黃芪甲苷對(duì)甲基乙二醛誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

周云豐，李 琳，葛爭(zhēng)艷，周立東，郭宇潔，金 龍，任 燁，李彥林，孫 蘭，許 揚(yáng)

[1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中藥(天然藥物)創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，北京 100091]

黃芪甲苷對(duì)甲基乙二醛誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用研究

周云豐1，李 琳1，葛爭(zhēng)艷2，周立東1，郭宇潔2，金 龍2，任 燁2，李彥林1，孫 蘭1，許 揚(yáng)1

[1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所，中藥(天然藥物)創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)研究中心，北京 100091]

目的 研究黃芪甲苷(AS-Ⅳ)對(duì)甲基乙二醛(MGO)誘導(dǎo)的人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及分子機(jī)制。方法 利用MGO誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷，CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力，Hoechst 33342染色法觀察細(xì)胞核形態(tài)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)水平和脂質(zhì)過氧化物丙二醛(MDA)含量，JC-1染色法觀察線粒體膜電位的變化，Western blot法檢測(cè)Bcl-2、Bax和PARP蛋白的表達(dá)量，熒光酶標(biāo)法檢測(cè)caspase家族蛋白caspase-9和caspase-3的活化水平。結(jié)果 MGO能劑量依賴性地降低ARPE-19的細(xì)胞活力，AS-Ⅳ預(yù)處理能夠明顯逆轉(zhuǎn)MGO引起的細(xì)胞活力下降(P<0.05)，改善細(xì)胞核形態(tài)，減少細(xì)胞凋亡，減少ROS和MDA的產(chǎn)生(P<0.05)，增加SOD活力(P<0.05)，抑制線粒體膜電位的下降，提高Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)率(P<0.05)和PARP的表達(dá)水平，降低caspase-9和caspase-3的活化水平(P<0.05)。結(jié)論 AS-Ⅳ對(duì)MGO損傷的ARPE-19細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用，其作用機(jī)制是提高細(xì)胞抗氧化能力，調(diào)節(jié)線粒體通路蛋白的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡。

糖尿病視網(wǎng)膜病變；黃芪甲苷；甲基乙二醛；人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞；抗氧化；細(xì)胞凋亡

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病患者最嚴(yán)重的微血管并發(fā)癥之一。DR能導(dǎo)致不可逆的視力喪失，已經(jīng)成為致盲的主要疾病[1]，DR與自由基介導(dǎo)的氧化損傷有關(guān)，氧化應(yīng)激反應(yīng)可調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理功能和生化反應(yīng)，在細(xì)胞增殖分化過程中發(fā)揮重要作用，并可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelium，RPE)位于富含血管的脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層之間，是視網(wǎng)膜重要的營(yíng)養(yǎng)、維護(hù)和代謝組織，也是外血-視網(wǎng)膜屏障的重要組成部分，RPE因其特殊的位置和功能在DR的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[2]。甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)是糖酵解生成的活性二羰基化合物，在糖尿病患者血漿中大量積累[3]，MGO可以通過與氨基酸殘基結(jié)合，經(jīng)過復(fù)雜反應(yīng)產(chǎn)生晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)，作為AGEs最具活性的前體物質(zhì)，MGO被認(rèn)為是引發(fā)糖尿病并發(fā)癥的關(guān)鍵物質(zhì)[4]。在糖尿病患者中，血糖升高導(dǎo)致AGEs在RPE基底膜中聚集，從而引起RPE的損傷[5]。

黃芪甲苷(astragaloside IV，AS-Ⅳ)是中藥黃芪的主要活性成分之一，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，AS-Ⅳ具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化、降糖和改善心血管疾病等藥理作用[6]，并且AS-Ⅳ對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病變和糖尿病大鼠腎臟病變具有改善和治療效果[7-8]，對(duì)糖尿病大鼠心肌細(xì)胞和糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller細(xì)胞具有保護(hù)作用[9-10]。目前尚未見AS-Ⅳ對(duì)DR中RPE損傷保護(hù)作用的研究報(bào)道，本研究采用MGO誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷為模型，探討AS-Ⅳ對(duì)ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用及分子機(jī)制，為AS-Ⅳ用于防治DR提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 ARPE-19細(xì)胞株購(gòu)自賽百慷(上海)生物技術(shù)股份有限公司；AS-Ⅳ購(gòu)自成都曼斯特生物科技有限公司，以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)溶解，配制成50 mmol·L-1的貯備液，-20℃保存，用時(shí)以無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，實(shí)驗(yàn)中DMSO濃度小于0.1%。DMEM/F12(1 ∶1)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，青鏈霉素混合液(100×)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，Hoechst 33342、MGO購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，CCK-8由日本同仁化學(xué)研究所提供，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)試盒由南京建成生物工程研究所提供，線粒體膜電位和活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，caspase-3、caspase-9檢測(cè)試劑盒購(gòu)自凱基生物技術(shù)股份有限公司，F(xiàn)ITC Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司，抗Bcl-2抗體、抗Bax抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，抗PARP抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、山羊抗兔二抗(HRP結(jié)合)購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 ARPE-19細(xì)胞培養(yǎng) ARPE-19細(xì)胞生長(zhǎng)于含有10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天換液，每3 d傳代1次，選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理

1.3.1 MGO最佳造模濃度的確定 將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，接種24 h后，將細(xì)胞分為對(duì)照組和不同濃度MGO組，棄去完全培養(yǎng)基，分別加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的0.5、0.75、1、2 mmol·L-1MGO溶液，對(duì)照組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，孵育16 h。

1.3.2 AS-Ⅳ最佳作用濃度的確定 將處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞接種于96孔板中，每組5個(gè)復(fù)孔，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，接種24 h后，將細(xì)胞分為對(duì)照組、MGO組、MGO+5 μmol·L-1AS-Ⅳ組、MGO+10 μmol·L-1AS-Ⅳ組和MGO+20 μmol·L-1AS-Ⅳ組，棄去完全培養(yǎng)基。對(duì)照組和MGO組加入無(wú)血清培養(yǎng)基，MGO+不同濃度AS-Ⅳ組加入含不同濃度AS-Ⅳ(5、10、20 μmol·L-1)的無(wú)血清培養(yǎng)基，孵育6 h后，MGO組和MGO+不同濃度AS-Ⅳ組加入MGO使其終濃度為1 mmol·L-1，孵育16 h。

1.4 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力 選取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的ARPE-19細(xì)胞，接種于96孔板中(每孔1×104個(gè))，培養(yǎng)24 h后，按以上分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，然后棄去完全培養(yǎng)基，加入含CCK-8(CCK-8 ∶無(wú)血清培養(yǎng)基=1 ∶9)的無(wú)血清培養(yǎng)基100 μL，孵育2 h，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)吸光度值，計(jì)算細(xì)胞活力，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

1.5.1 Hoechst 33342細(xì)胞核熒光染色 細(xì)胞經(jīng)處理后，PBS洗2次，加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的Hoechst 33342染色液，37℃避光染色15 min，PBS洗3次，每次5 min，然后利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)拍照。

1.5.2 Annexin V-FITC/PI雙染 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔1.5×105個(gè)，細(xì)胞長(zhǎng)滿板底約80%時(shí)，按上述方法處理細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后離心，用冷PBS洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞重懸于100 μL 1×Binding Buffer中，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，室溫避光孵育15 min，加入400 μL 1×Binding Buffer 輕彈混勻，上機(jī)檢測(cè)。

1.6 細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平檢測(cè)

1.6.1 ROS染色 細(xì)胞經(jīng)處理后，用PBS洗2次，加入以無(wú)血清培基1 ∶1000稀釋的DCFH-DA，37℃避光染色40 min后，無(wú)血清培基洗3次，然后加入Hoechst 33342 每孔200 μL，染色15 min，PBS洗3次后利用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)拍照。

1.6.2 細(xì)胞內(nèi)SOD和MDA檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)處理后，消化收集細(xì)胞，利用超聲破碎細(xì)胞，4℃、12 000 r·min-1離心5 min，取上清，按照試劑盒說明進(jìn)行SOD和MDA的檢測(cè)。

1.7 線粒體膜電位檢測(cè) 細(xì)胞經(jīng)處理后，用PBS洗2次，加入JC-1染色工作液37℃避光染色30 min，1×JC-1染色緩沖液洗3次，然后利用高內(nèi)涵成像體統(tǒng)拍照。

1.8 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞經(jīng)處理后，胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，加入含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的哺乳動(dòng)物蛋白抽提試劑(體積比為1 ∶1 ∶98)，冰上裂解30 min；4℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清稀釋10倍進(jìn)行蛋白定量；將SDS-PAGE上樣緩沖液與蛋白樣品按照1 ∶4混勻，煮沸5 min，使蛋白充分變性，-20℃保存待用。取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳3 h，轉(zhuǎn)膜105 V，55 min，然后將NC膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗孵育過夜，用TBST洗3次，每次15 min，二抗室溫孵育2 h，TBST洗3次，每次15 min，顯色后使用凝膠成像儀進(jìn)行成像。使用Photoshop圖像處理軟件對(duì)蛋白條帶的灰度值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 MGO造模濃度及AS-Ⅳ作用濃度的確定 隨著MGO濃度的增加，ARPE-19細(xì)胞活力逐漸下降，當(dāng)MGO濃度為1 mmol·L-1時(shí)細(xì)胞存活率為(64.75±6.00)%(Fig 1A)，故選擇1 mmol·L-1MGO孵育16 h作為最佳造模條件；在不同濃度AS-Ⅳ預(yù)給藥6 h后給予MGO(1 mmol·L-1)孵育16 h，結(jié)果顯示，AS-Ⅳ濃度為10 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率為(78.45±5.90)%，與MGO組相比細(xì)胞活力明顯提高(P<0.05)，最終確定AS-Ⅳ的給藥濃度為10 μmol·L-1，并且在AS-Ⅳ濃度為10 μmol·L-1時(shí)對(duì)ARPE-19的細(xì)胞活力無(wú)明顯影響(Fig 1B，P>0.05)。

2.2 AS-Ⅳ對(duì)MGO引起的細(xì)胞凋亡的影響 利用Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞核染色發(fā)現(xiàn)，正常組細(xì)胞核呈圓形或橢圓形，完整無(wú)皺縮，呈均勻淡藍(lán)色；MGO組細(xì)胞核著色不均勻，部分細(xì)胞核固縮呈致密亮藍(lán)著色，表現(xiàn)出凋亡的典型特征；AS-Ⅳ給藥后細(xì)胞核染色較為均勻，與MGO組比較有明顯改善(Fig 2A)。Annexin V-FITC/PI雙染結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞凋亡率為(3.18± 0.30)%，MGO組細(xì)胞凋亡率為(19.47±2.48)%，與正常組相比凋亡率明顯增加(P<0.05)，AS-Ⅳ給藥后細(xì)胞凋亡率為(7.57±0.81)%，與MGO組相比凋亡率明顯降低(Fig 2B、2C，P<0.05)。

2.3 AS-Ⅳ對(duì)MGO引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 熒光探針DCFH-DA本身沒有熒光，可以自由穿過細(xì)胞膜，可被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解成DCFH，而DCFH不能通過細(xì)胞膜，細(xì)胞內(nèi)的ROS可以將無(wú)熒光的DCFH氧化成有綠色熒光的DCF，因而綠色熒光的強(qiáng)度代表細(xì)胞內(nèi)ROS的含量。由Fig 3A、3B可見，與對(duì)照組相比，MGO能增加ARPE-19細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，細(xì)胞綠色加深，熒光強(qiáng)度是對(duì)照組的(2.69±0.56)倍，有顯著性差異(P<0.05)，AS-Ⅳ能夠明顯減少ROS的產(chǎn)生(P<0.05)；且與對(duì)照組相比，MGO組細(xì)胞內(nèi)SOD含量明顯降低，MDA含量明顯增加，AS-Ⅳ能明顯增加SOD水平，減少M(fèi)DA含量(Fig 3C、3D，P<0.05)。

2.4 AS-Ⅳ對(duì)MGO引起的細(xì)胞線粒體膜電位降低的干預(yù)作用 JC-1熒光探針能夠快速靈敏的檢測(cè)線粒體膜電位的變化，正常細(xì)胞線粒體膜電位較高，JC-1以聚合物的形式存在于線粒體基質(zhì)中，產(chǎn)生紅色熒光；細(xì)胞受到損傷時(shí)線粒體膜電位降低，JC-1以單體形式存在，呈現(xiàn)綠色熒光。由Fig 4A、4B可見，對(duì)照組細(xì)胞紅色熒光較強(qiáng)，線粒體膜電位較高，而MGO組細(xì)胞受損，線粒體膜電位下降，綠色熒光增強(qiáng)，Red/Green比值為(0.66±0.11)，明顯低于正常組，AS-Ⅳ能夠提高線粒體膜電位，紅色熒光增加，綠色熒光減少，與MGO組相比Red/Green比值明顯提高(P<0.05)。

2.5 AS-Ⅳ對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 Western blot法檢測(cè)凋亡蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，MGO能明顯減少Bcl-2/Bax比值，AS-Ⅳ給藥后Bcl-2/Bax比值和PARP的表達(dá)明顯增加(Fig 5A～5C，P<0.05)。經(jīng)熒光酶標(biāo)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MGO組caspase-9、caspase-3活力明顯增加，AS-Ⅳ能明顯降低caspase-9、caspase-3的活化水平(Fig 5D、5E，P<0.05)。

Fig 1 Effect of AS-Ⅳ on cell viability of ARPE-19 cells

A: MGO can reduce ARPE-19 cell viability in a dose-dependent manner; B:AS-Ⅳ can inhibit the reduction of ARPE-19 cell viability induced by MGO.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsMGO group

Fig 2 Effect of AS-Ⅳ on ARPE-19 cell apoptosis by MGO

A: Morphology of cell nucleus observed by Hoechst 33342 staining; B, C: Results of induced cell apoptosis rates examined by Annexin V-FITC/PI with flow cytometry.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsMGO group

Fig 3 Effect of AS-Ⅳ on MGO-induced oxidative stress in ARPE-19 cells

A, B: AS-Ⅳ can significantly inhibit MGO-induced increase of ROS; C: AS-Ⅳ can significantly inhibit MGO-induced decrease of SOD activity; D: AS-Ⅳ can significantly inhibit MGO induced increase of MDA content.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsMGO group

Fig 4 Effect of AS-Ⅳ on mitochondrial membrane potential in ARPE-19 cells

A, B: AS-Ⅳ can significantly inhibit MGO-induced decrease of mitochondrial membrane potential in ARPE-19 cells.#P<0.05vscontrol group;*P<0.05vsMGO group

Fig 5 Effect of AS-Ⅳ on expression of apoptosis related protein in ARPE-19 cells

A ～ C: AS-Ⅳ up-regulates ratio of Bcl-2/Bax and expression of PARP detected by Western blot; D, E: AS-Ⅳ down-regulates activity of caspase-9 and caspase-3.#P<0.05,##P<0.01vscontrol group;*P<0.05vsMGO group

3 討論

MGO是機(jī)體產(chǎn)生的生理代謝產(chǎn)物，健康人體內(nèi)MGO的濃度約為1 μmol·L-1。糖尿病患者因長(zhǎng)期處于高糖狀態(tài)，體內(nèi)MGO大量產(chǎn)生并蓄積，MGO濃度為正常人的2 ～ 4倍，并且與血糖水平呈正相關(guān)，MGO成為加速DR進(jìn)展的有害物質(zhì)[11]。

MGO通過與蛋白質(zhì)、磷脂和核苷酸形成AGE加合物改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能[12]。本研究采用MGO損傷的ARPE-19作為細(xì)胞模型，研究AS-Ⅳ對(duì)ARPE-19細(xì)胞的保護(hù)作用。結(jié)果表明，AS-Ⅳ能夠明顯抑制MGO誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞活力的下降；對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Hoechst 33342染色和Annexin V-FITC/PI雙染，發(fā)現(xiàn)AS-Ⅳ對(duì)細(xì)胞核的形態(tài)有明顯的改善作用，能夠減少細(xì)胞核皺縮，使細(xì)胞核呈均勻藍(lán)染，并且能夠明顯抑制MGO引起的細(xì)胞凋亡。

氧化應(yīng)激水平的增強(qiáng)在糖尿病并發(fā)癥(如DR)的發(fā)生中起著重要作用[13]，ROS的大量產(chǎn)生，破壞了機(jī)體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的平衡，導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生。已有研究顯示[14-15]，MGO能誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)，MGO通過升高ARPE-19細(xì)胞的氧化應(yīng)激水平而引起細(xì)胞損傷，AS-Ⅳ給藥后能夠減少ROS產(chǎn)生，提高SOD活力，降低MDA水平，從而減輕MGO對(duì)ARPE-19細(xì)胞造成的損害。由此表明AS-Ⅳ通過抗氧化作用減少氧自由基的產(chǎn)生，提高細(xì)胞內(nèi)的抗氧化酶活性減少脂質(zhì)過氧化物的產(chǎn)生，從而增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力。

線粒體的完整性對(duì)于細(xì)胞的生存至關(guān)重要，正常的線粒體膜電位是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生三磷酸腺苷的先決條件[16]?；钚匝踝杂苫漠惓Ｉ吣軌蛞鹁€粒體內(nèi)膜發(fā)生變化，一方面引起線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore, MPTP)開放，促凋亡蛋白細(xì)胞色素C等被釋放至胞質(zhì)中；另一方面導(dǎo)致線粒體膜電位降低，線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡的早期信號(hào)[12]。胞質(zhì)中的細(xì)胞色素C結(jié)合并激活A(yù)PAF-1和caspase-9前體，形成凋亡體，caspase-9前體以這種方式聚集并導(dǎo)致caspas-9的激活，繼而活化caspas-3啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[17]。Bcl-2家族蛋白對(duì)線粒體通路有重要的調(diào)控作用，抗凋亡蛋白Bcl-2能夠抑制MPTP的開放，減少細(xì)胞色素C及凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，阻止凋亡的發(fā)生；促凋亡蛋白Bax正常情況下以單體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，受到凋亡刺激時(shí)構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致Bax寡聚體形成并整合到線粒體外膜上，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放，誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生[18]。通常用Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的比率(Bcl-2/Bax)來表示細(xì)胞的凋亡情況。本研究發(fā)現(xiàn)，MGO可影響B(tài)cl-2家族蛋白的表達(dá)，明顯降低Bcl-2/Bax比率，提高caspase家族蛋白caspase-9和caspase-3的表達(dá)水平，減少caspase-3裂解底物PARP的表達(dá)，從而促進(jìn)ARPE-19細(xì)胞凋亡。而AS-Ⅳ能逆轉(zhuǎn)MGO能引起的ARPE-19細(xì)胞線粒體膜電位的下降。明顯提高Bcl-2/Bax率，下調(diào)caspase-9和caspase-3的表達(dá)，提高PARP的水平，抑制ARPE-19細(xì)胞凋亡。表明AS-Ⅳ通過調(diào)節(jié)線粒體通路蛋白的表達(dá)發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用，至于AS-Ⅳ是否通過其他途徑如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路和MAPK通路對(duì)ARPE-19細(xì)胞起保護(hù)作用仍需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，AS-Ⅳ能夠通過增強(qiáng)細(xì)胞的抗氧化能力，提高線粒體膜電位，調(diào)節(jié)線粒體通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而抑制MGO引起的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，對(duì)ARPE-19細(xì)胞起到保護(hù)作用，并可能在DR中發(fā)揮治療作用。

(致謝：本研究所有實(shí)驗(yàn)均在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所中藥(天然藥物)創(chuàng)新藥物研發(fā)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，感謝中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心老師們的傾力協(xié)助，感謝陳陽(yáng)老師對(duì)實(shí)驗(yàn)及文章撰寫提供的幫助。)

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Protective effect of astragalosides IV on retinal pigment epithelium injury induced by methylglyoxal

ZHOU Yun-feng1, LI Lin1, GE Zheng-yan2, ZHOU Li-dong1, GUO Yu-jie2, JIN Long2, REN Ye2, LI Yan-lin1, SUN Lan1, XU Yang1
[1.BeijingKeyLabofInnovativeDrugDiscoveryofTraditionalChineseMedicine(NaturalMedicine)andTranslationalMedicine,InstituteofMedicinalPlantDevelopment,PekingUnionMedicalCollegeandChineseAcademyofMedicalSciences,Beijing100193,China; 2.ExperimentResearchCenterofXiyuanHospital,ChinaAcademyofChineseMedicalSciences,Beijing100091,China]

Aim To investigate the protective effect of astragaloside IV (AS-Ⅳ) on human retinal pigment epithelium injury induced by methylglyoxal (MGO), and explore its molecular mechanism. Methods The injury of ARPE-19 cells was induced by MGO and the cell viability was measured by CCK-8 method. The morphology of cell nucleus was analyzed by Hoechst 33342 staining and the cell apoptosis was analyzed by flow cytometry to detect labbled Annexin V-FITC/PI. JC-1 staining and fluorescence probe DCFH-DA were employed to evaluate the change of mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS). The levels of SOD, MDA, caspase-9 and caspase-3 were determined by respective kits. Western blot was used to analyse the expression of Bcl-2, Bax and PARP. Results AS-Ⅳ could significantly inhibit the decrease of cell viability induced by MGO, improve the morphology of cell nucleus, reduce the ARPE-19 cell apoptosis rate and the level of ROS and MDA, and increase the activity of SOD. Furthermore, AS-Ⅳ could enhance mitochondrial membrane potential, the ratio of Bcl-2/Bax and the expression of PARP, and inhibit the activation of caspase-9 and caspase-3. Conclusion AS-Ⅳ may protect ARPE-19 cells from the injury induced by MGO by increasing the antioxidant ability of ARPE-19 cells and inhibiting cell apoptosis.

diabetic retinopathy; astragaloside IV; methylglyoxal; retinal pigment epithelium; antioxidation; apoptosis

2017-01-15,

2017-04-10

北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 7152100)；藥植所創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃(No IT1305)

周云豐(1991-)，男，碩士生，研究方向：中藥藥理學(xué),E-mail:zhouyf1122@126.com; 許 揚(yáng)(1965-)，男，博士，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：中藥藥理學(xué)及創(chuàng)新藥物，通訊作者，Tel:010-57833234, E-mail：vascular888@126.com

時(shí)間：2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.014.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.007

A

1001-1978(2017)07-0915-07

R284.1；R322.91；R329.25；R587.2；R774.102.2