淫羊藿苷對產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠抗抑郁作用研究

張笑笑，林天煒，張君利，張 琳，謝娟萍，李 暉，朱忠良

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710061)

淫羊藿苷對產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠抗抑郁作用研究

張笑笑1，林天煒1，張君利1，張 琳1，謝娟萍1，李 暉2，朱忠良1

(1.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710069；2.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科，陜西 西安 710061)

目的 觀察淫羊藿苷對產(chǎn)前應(yīng)激子代抑郁樣行為的干預(yù)作用，并探究其作用機制。方法 本文采用慢性束縛應(yīng)激對孕后期母鼠建立抑郁模型，將♂ SD子代大鼠隨機分為5組：空白對照組(CON)、產(chǎn)前應(yīng)激組(PS)、生理鹽水組(NS)、淫羊藿苷高劑量組(80 mg·kg-1)、淫羊藿苷低劑量組(40 mg·kg-1)。采用強迫游泳實驗和曠場實驗對各組大鼠的抑郁樣行為進行評價，并通過Western blot測定各組大鼠前額葉皮層區(qū)mGluR1、mGluR5、EAAT2蛋白的表達。結(jié)果 與CON組相比，PS組子代大鼠掙扎時間和穿越中央格次數(shù)減少(P<0.01,P<0.05)，表現(xiàn)出明顯的抑郁樣行為。PS組較CON組前額葉皮層區(qū)mGluR1、mGluR5蛋白表達明顯升高(P<0.01,P<0.05)，而EAAT2蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與NS組相比，淫羊藿苷高、低劑量組均能明顯增加子代大鼠的掙扎時間(P<0.05,P<0.01)和穿越中央格次數(shù)(P<0.05)。淫羊藿苷干預(yù)后(80 、40 mg·kg-1)均能明顯改善前額葉皮層區(qū)mGluR1、mGluR5及EAAT2蛋白的表達。結(jié)論 淫羊藿苷對產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠具有明顯的抗抑郁作用，其作用機制可能與腦內(nèi)Ⅰ族mGluRs的調(diào)制作用相關(guān)。

淫羊藿苷；產(chǎn)前應(yīng)激；子代大鼠；抗抑郁；ΙmGluRs；EAAT2；機制

抑郁癥已引起很多研究者的廣泛關(guān)注，但抑郁癥的發(fā)病機制仍不清楚。谷氨酸是一種興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，參與突觸可塑性調(diào)控，谷氨酸能系統(tǒng)在抑郁癥發(fā)生中起到至關(guān)重要的作用[1]。而代謝型谷氨酸受體1(mGluR1)和代謝型谷氨酸受體5(mGluR5)是G蛋白偶聯(lián)受體[2]，與焦慮癥、抑郁癥的發(fā)生息息相關(guān)[3]。谷氨酸轉(zhuǎn)運體(EAAT2)是一種在前腦、海馬、皮層區(qū)的星型膠質(zhì)細(xì)胞膜上表達最為豐富的轉(zhuǎn)運體[4]，能夠清除突觸間隙過量的谷氨酸，對消除谷氨酸毒性起到重要的作用[5]。抑郁癥屬于情感類精神障礙的一種，誘導(dǎo)抑郁癥發(fā)生的因素很多，其中產(chǎn)前應(yīng)激在抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展起到關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用。已有研究證實，產(chǎn)前應(yīng)激能夠增加焦慮癥和抑郁癥的發(fā)生風(fēng)險[6-7]。目前，針對抑郁癥的臨床治療藥物主要是選擇性5-HT重吸收抑制(SSRIs)，然而在臨床治療中發(fā)現(xiàn)SSRIs治療效果緩慢，治療潛伏期長達4～8周，并且僅使大約40%的抑郁病人痊愈[8]。因此，迫切需要更加有效、快速地治愈抑郁癥的新型藥物。而淫羊藿苷是從中草藥淫羊藿中提取分離得到的一種黃酮類化合物，有動物研究已經(jīng)證實，淫羊藿苷在社會挫敗應(yīng)激模型和慢性不可預(yù)見性應(yīng)激模型上均表現(xiàn)出抗抑郁作用，其作用機制主要涉及炎性信號因子通路及HPA軸的調(diào)節(jié)作用等[9-10]，但淫羊藿苷對產(chǎn)前束縛應(yīng)激子代大鼠的抗抑郁作用研究很少，其作用機制也不清楚。本實驗通過建立產(chǎn)前束縛應(yīng)激模型，進一步探究淫羊藿苷對產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠的抗抑郁作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑 光學(xué)顯微鏡(麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；HPLC (Waters)；5418R型低溫離心機(Bio-Rad公司)；微量分光光度儀(Nana Drop公司)；化學(xué)發(fā)光儀(Bio-Rad公司)；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(西安赫特生物科技)；Rabbit anti-mGluR1(Abcam公司)；Rabbit anti-mGluR5(Abcam公司)；Rabbit anti-EAAT2 (Abcam公司)。

1.1.2 實驗動物 SD大鼠，SPF級，由西安交通大學(xué)動物研究中心提供。所有實驗動物被飼養(yǎng)于西北大學(xué)SPF動物房，動物房溫度恒定于22 ℃～26 ℃，濕度恒定于60%左右，每天12 h白晝和12 h黑夜(每天開燈從早8 ∶00到晚20 ∶00)交替，♀♂大鼠分開飼養(yǎng)，在實驗前持續(xù)飼養(yǎng)1周以適應(yīng)實驗環(huán)境，在整個實驗過程中動物均可自由進食、飲水。

1.1.3 實驗藥品 淫羊藿苷，購買于陜西昊辰生物科技有限公司，經(jīng)HPLC檢測，其純度為98.18%，結(jié)果見Fig 1。

Fig 1 High performance liquid chromatography of icariin

1.2 方法

1.2.1 動物分組與給藥 ♀♂大鼠按3 ∶1合籠，次日清晨用光學(xué)顯微鏡進行陰道涂片檢查，精子陽性被認(rèn)定為妊娠d 0。孕鼠隨后被隨機分成對照組和應(yīng)激組，對照組不進行任何干預(yù)，應(yīng)激組給予束縛應(yīng)激。孕鼠d 21分娩，子鼠d 21斷奶，隨機抽取每組8只♂進行實驗，每窩選取的子代♂不得多于2只。實驗將子代♂分為5組，對照組(CON)、產(chǎn)前應(yīng)激組(PS)、生理鹽水組(NS)、淫羊藿苷高劑量組(ICA 80 mg·kg-1)、淫羊藿苷低劑量組(ICA 40 mg·kg-1)。給藥組從子代出生后d 22開始，共灌胃給藥35 d。

1.2.2 建模 應(yīng)激模型裝置是一個透明塑料的圓柱狀筒，直徑為6.8 cm，塑料圓柱筒的長度可根據(jù)大鼠的具體尺寸進行調(diào)節(jié)，并且塑料圓柱筒兩端有密集的小孔，有助于動物呼吸。孕鼠于懷孕d 13～20被放置于此裝置內(nèi)，3次/d，每次45 min，每次束縛應(yīng)激至少間隔2 h。

1.2.3 強迫游泳實驗 強迫游泳裝置是一圓柱形塑料桶，直徑為20 cm，高度為50 cm。桶中水深40 cm左右，以保證大鼠在水中無法觸及桶底而強迫掙扎游泳，水溫保持在24℃左右。每只大鼠強迫游泳8 min，并用攝像機記錄大鼠在水中的掙扎時間。

1.2.4 曠場實驗 曠場箱的規(guī)格為40 cm×40 cm×25 cm，底部和四壁均被涂成黑色，底部用白色線條分為25個(5×5)均等的方格，曠場箱的中央9個(3×3)方格被認(rèn)定為中央格。實驗開始時，將大鼠放在曠場箱的最中間的方格中，讓大鼠在曠場箱中自由活動，并用攝像機記錄6 min內(nèi)大鼠在曠場箱中的活動情況，計算大鼠穿越中央格的次數(shù)(至少有3只爪子進入中央?yún)^(qū)域)和理毛次數(shù)(用爪子或舌頭梳理自己的毛)。

1.2.5 取材 實驗大鼠用10%水合氯醛腹腔注射進行麻醉，在冰上迅速剝離大鼠腦前額葉皮層，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｋ薪饘倨餍稻韪邷馗邏簻缇?/p>

1.2.6 蛋白樣品的制備 將組織稱重，用眼科剪將組織剪碎，加入RIPA裂解液(使用前數(shù)分鐘加入PMSF，使其終濃度為1 mmol·L-1)，在冰上充分研磨使其完全透過篩網(wǎng)，冰中靜置5 min，待組織充分裂解，置4℃離心機中以12 000 r·min-1離心5～10 min，取上清液。按4 ∶1加入loading buffer，置沸水中變性5 min，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.7 Western blot 根據(jù)SDS-PAGE試劑盒配置凝膠，保持蛋白上樣量一致。電泳結(jié)束后，根據(jù)marker指示目的蛋白所在區(qū)域的凝膠，將目的蛋白轉(zhuǎn)到標(biāo)記好的PVDF膜上，將PVDF膜置于脫脂奶粉中封閉2 h，孵育一抗(mGluR1 1 ∶500，mGluR5 1 ∶1 000，EAAT2 1 ∶2 000)，在4℃冰箱過夜。次日，孵育二抗1 h，接著將PVDF膜置于Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀的暗盒中進行目的蛋白自動顯影。最后，用Image J軟件對目的蛋白條帶進行灰度分析。

2 結(jié)果

2.1 淫羊藿苷對產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠強迫游泳實驗中抑郁樣行為的影響 與CON組相比，PS誘導(dǎo)子代大鼠在強迫游泳實驗中掙扎時間明顯減少(P<0.01)；而淫羊藿苷灌胃給藥后(80、40 mg·kg-1)均能明顯延長掙扎時間(P<0.05，P<0.01)，ICA(40 mg·kg-1)組較ICA(80 mg·kg-1)組更加明顯，見Tab 1。

Tab 1 Effect of icariin on struggling time of FST in prenatally stressed male offsprings(±s,n=8)

**P<0.01vsCON;#P<0.05,##P<0.01vsNS

2.2 淫羊藿苷對產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠曠場實驗中抑郁樣行為的影響 與CON組相比，PS組子代大鼠穿越中央格次數(shù)較CON組明顯減少(P<0.05)；淫羊藿苷(80、40 mg·kg-1)灌胃給藥后，子代大鼠穿越中央格次數(shù)明顯增加(P<0.05)；各組子代大鼠理毛次數(shù)差異無顯著性(P>0.05)，見Tab 2。

Tab 2 Effect of icariin on depressive-like behavior of OFT in prenatally stressed male offsprings(± s,n=8)

*P<0.05vsCON;#P<0.05vsNS

2.3 淫羊藿苷調(diào)節(jié)產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠前額葉皮層區(qū)ΙmGluRs及EAAT2蛋白的表達 在前額葉皮層區(qū)，PS組較CON組mGluR1、mGluR5蛋白表達明顯升高(P<0.01，P<0.05)，EAAT2蛋白表達明顯降低(P<0.05)；淫羊藿苷灌胃給藥(80、40 mg·kg-1)均能明顯降低產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠前額葉皮層區(qū)mGluR1蛋白表達(P<0.01)；與NS組相比，ICA(80 mg·kg-1)組mGluR5蛋白表達明顯減少(P<0.05)，但EAAT2蛋白表達差異無顯著性(P>0.05)；而ICA(40 mg·kg-1)組能明顯上調(diào)前額葉皮層區(qū)EAAT2蛋白表達(P<0.05)，但對mGluR5蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見Fig 2～4。

Fig 2 Effect of icariin on mGluR1 protein expression in prefrontal cortex of male offsprings(±s,n=8)

**P<0.01vsCON;##P<0.01vsNS

3 討論

古醫(yī)家認(rèn)為陽氣為動力之源，推動人體各種生命活動，包括思維、情志、精神和行動等方面，然腎陽不足，則表現(xiàn)為精神不振、情緒低糜、自卑絕望、嗜睡乏力。而抑郁癥則以“不動”為主要特點，因此認(rèn)為腎陽不足是抑郁癥的基本病機[11]，腎陽虧虛，當(dāng)滋補腎陽。淫羊藿性辛苷溫，其主要的功效是溫腎壯陽。有研究表明，淫羊藿總黃酮能使抑郁模型大鼠腦內(nèi)β-腎上腺素受體密度明顯降低，起到抗抑郁作用[12]。

Fig 3 Effect of icariin on mGluR5 protein expression in prefrontal cortex of male offsprings(±s,n=8)

*P<0.05vsCON;#P<0.05vsNS

Fig 4 Effect of icariin on EAAT2 protein expression in prefrontal cortex of male offsprings(±s,n=8)

*P<0.05vsCON;#P<0.05vsNS

很多探究PS對抑郁或焦慮樣行為影響的動物實驗均選用子代♂，本實驗也選擇子代♂為研究對象，主要是為了避免♀發(fā)情期激素的影響。本實驗中，PS子代大鼠在強迫游泳實驗中掙扎時間減少，曠場實驗中穿越中央格次數(shù)減少等，預(yù)示子代大鼠生活追求淡漠、悲觀失望、探究能力減弱，這與抑郁癥病人運動遲滯、喜歡避角的癥狀較為相似。

大量證據(jù)已經(jīng)表明[13]，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，谷氨酸及谷氨酸受體在抑郁癥的發(fā)病機制及抗抑郁治療中起著至關(guān)重要的作用。前期研究表明[14]，產(chǎn)前應(yīng)激能明顯提高♂子代鼠前額葉皮層區(qū)mGluR2/3和mGluR5的表達，而Ⅱ族親代謝型谷氨酸受體mGluR2/3能通過抑制自身受體減少興奮性谷氨酸能傳遞，Ⅰ族親代謝型谷氨酸受體mGluR1/5位于抑制性中間神經(jīng)元的終端，Ⅰ族mGluRs表達上調(diào)則會增強興奮性谷氨酸能傳遞，提高細(xì)胞興奮性[15]。本實驗結(jié)果表明，產(chǎn)前應(yīng)激能引起子代♂前額葉皮層區(qū)Ⅰ族親代謝型谷氨酸受體mGluR1、mGluR5表達上調(diào)，因此認(rèn)為，在產(chǎn)前應(yīng)激子代♂中Ⅰ族mGluRs表達升高很可能是為興奮性谷氨酸能傳遞保持長期平衡的一種代償機制。而淫羊藿苷能明顯抑制產(chǎn)前應(yīng)激子代♂前額葉皮層區(qū)Ⅰ族mGluRs的上調(diào)，另有很多研究表明，mGluR5受體拮抗劑(比如MPEP、MTEP)具有明顯的抗抑郁作用[16]，這同時也支持了我們的研究結(jié)果。綜上所述，淫羊藿苷高、低劑量組能不同程度地改善產(chǎn)前應(yīng)激子代大鼠的抑郁樣行為，調(diào)節(jié)前額葉皮層區(qū)Ι mGluRs和EAAT2蛋白的表達，具有明顯的抗抑郁作用。

(致謝：本文實驗在陜西省生物醫(yī)藥重點實驗室完成，特此致謝！)

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Antidepressant effects of icariin in prenatally stressed offsprings

ZHANG Xiao-xiao1,LIN Tian-wei1,ZHANG Jun-li1, ZHANG Lin1, XIE Juan-ping1, LI Hui2, ZHU Zhong-liang1
(1.CollegeofLifeScience,NorthwestUniversity,Xi′an710069,China; 2.DeptofNeonatology,FirstAffiliatedHospitalofXi′anJiaotongUniversity,Xi′an710061,China)

Aim To observe the effects of icariin on depressive-like behavior in prenatally stressed offsprings and explore its mechanism.Methods The model of depression was established by prenatal restraint stress on late pregnant mother, then male offspring rats were randomly divided into five groups of eight: Control, PS model, Saline group(NS), ICA(80 mg·kg-1), ICA(40 mg·kg-1). The effects of icariin on PS-induced depressive-like behaviors in male offsprings were examined by forced swimming test(FST) and open-field test(OFT).Furthermore, the protein expressions of group I metabotropic glutamate receptors(I mGluRs) and excitatory amino acid transporter 2(EAAT2) in prefrontal cortex were detected by Western blot.Results PS group exhibited depressive-like behaviors with decreased struggling time(P<0.01) and center crossing numbers(P<0.05) compared to CON, with increased protein expressions of group I mGluRs(P<0.01,P<0.05) and decreased EAAT2(P<0.05) in prefrontal cortex compared to CON. Treatment with icariin(80 mg·kg-1, 40 mg·kg-1)significantly increased struggling time(P<0.05,P<0.01) and center crossing numbers(P<0.05) in PS-exposed male offspring rats. Treatment with icariin markedly modulated the protein levels of mGluR1, mGluR5 and EAAT2 in prefrontal cortex.Conclusion Icariin has significant antidepressant effects in prenatally stressed rats, and the mechanism might be associated with the modulation of Ⅰ mGluRs.

icariin; prenatal stress; offspring; antidepressant; ΙmGluRs; EAAT2; mechanism

2017-04-11,

2017-05-20

陜西省教育廳重點實驗室科學(xué)研究計劃(No14JS108)；陜西省科技項目(No 81671342)

時間：2017-6-7 19:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170607.1904.040.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.07.020

A

1001-1978(2017)07-0987-05

R-332；R284.1；R322.81；R749.420.531

作者介紹：張笑笑(1991-)，女，碩士，研究方向：中藥藥理學(xué)，E-mail：1182553071@qq.com； 朱忠良(1963-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：產(chǎn)前應(yīng)激與子代行為，通訊作者，Tel：029-88304569，E-mail：zlzhu@mail.xjtu.edu.cn