黃曲霉毒素免疫親和柱性能評價方法及應用

徐文遠，倪新，崔淑華，朱萬燕

（1.臨沂出入境檢驗檢疫局，山東臨沂276034；2.山東出入境檢驗檢疫局食品農產(chǎn)品檢測中心，山東青島266002）

黃曲霉毒素免疫親和柱性能評價方法及應用

徐文遠1，倪新1，崔淑華2，朱萬燕1

（1.臨沂出入境檢驗檢疫局，山東臨沂276034；2.山東出入境檢驗檢疫局食品農產(chǎn)品檢測中心，山東青島266002）

探索建立一種簡便可靠的黃曲霉毒素免疫親和柱性能評價方法并利用該方法對國內市場上5個主流品牌產(chǎn)品進行對比評價。依據(jù)評價結果進行產(chǎn)品采購使用，經(jīng)3年多實用經(jīng)驗證明了方法的可靠性。該性能評價方法不僅能夠從確保檢測質量和降低檢測成本兩方面指導親和柱的采購還能夠協(xié)助倒逼生產(chǎn)商不斷提升產(chǎn)品質量。

黃曲霉毒素；免疫親和柱；性能評價；對比評價

黃曲霉毒素（aflatoxins，AFT）是一類結構和理化性 質相似的真菌次級代謝物，具有強致癌性和免疫抑制性[1-3]。該類毒素廣泛存在于花生及其制品、玉米及其制品、乳與乳制品、動物飼料、棉花籽、杏仁、開心果等食品中，黃曲霉毒素不僅直接對人體及動物造成毒害，還可以通過食物鏈從動物體轉內移到人體內造成二次危害[4-5]。從環(huán)節(jié)上控制黃曲霉毒素污染有一定的難度，從源頭上消除目前技術尚未成熟，提高檢測技術水平加強對該類產(chǎn)品的監(jiān)測監(jiān)管是當務之急。

黃曲霉毒素的檢測方法有多種，主要有薄層層析法、快速微柱法、酶聯(lián)免疫法、電化學免疫傳感器法、高效液相色譜法和液相色譜串聯(lián)質譜法等。薄層層析法靈敏度、精密度和重現(xiàn)性較差，微柱法定量差，酶聯(lián)免疫法假陽性率較高[6]。免疫親和凈化液相色譜法及液相色譜串聯(lián)質譜法是當前黃曲霉毒素的主要檢測方法，液相色譜串聯(lián)質譜法無論在定性還是定量上均具有其他方法無法比擬的優(yōu)勢，但其高昂的儀器價格限制了其廣泛應用。

免疫親和柱凈化-高效液相色譜法（IAC-HPLC）是當前最為簡潔、準確、快速和常用的黃曲霉檢測方法[7]。免疫親和柱是該類檢測方法的主要耗材，其性能的好壞和成本的高低直接關系到檢測結果的準確性和檢測成本。免疫親和柱性能評價方法對于篩選出性能優(yōu)越的親和柱，提高檢測結果準確性具有重要意義。為此我們根據(jù)黃曲霉毒素檢測用免疫親和柱產(chǎn)品特點探索建立了一種快速簡潔的性能評價方法。基于自行建立的方法對目前市場上國內外5個主流品牌產(chǎn)品性能進行了對比評價活動。性能評價方法主要從添加回收率、批內差、批間差、準確度、穩(wěn)定性和柱容量等產(chǎn)品關鍵技術指標進行評價。

1 免疫親和柱對比驗證方案

1.1 樣品篩選

依據(jù)GB/T 18979-2003《食品中黃曲霉毒素的測定免疫親和層析凈化高效液相色譜法和熒光光度法》（液相色譜法）對多批次花生樣品進行檢測，篩選出陰、陽性樣品。

1.2 添加回收試驗

在陰性樣品中添加標準品至濃度分別為2、5、10 μg/kg，按 GB/T 18979-2003（液相色譜法）檢測，樣品前處理參考各個廠家親和柱說明書進行操作。檢測各個濃度下B1、B2、G1、G2各個組分含量并計算回收率。

回收率/%=洗脫量/上樣量×100。

檢測數(shù)量：單一批次親和柱檢測數(shù)量隨機抽取不低于18支。

批內差、批間差檢測。變異系數(shù)=方差/均值×100。評價不少于2批產(chǎn)品，批次間隔不少于2個月，每批至少18根。

1.3 準確度

采樣標準樣品，按GB/T 18979-2003（液相色譜法）方法進行操作。

準確度/%=檢測量/實際量×100，采取雙平行試驗方法。

1.4 穩(wěn)定性

將產(chǎn)品放置于冷藏柜內（控溫4℃），每2周隨機抽取3支進行添加回收試驗，根據(jù)回收率對產(chǎn)品穩(wěn)定性進行考評。

1.5 柱容量

一次添加超量的AFT標準品、采用高濃度標準樣品或天然陽性樣品，測定回收率。

2 試驗部分

2.1 主要儀器

Agilent 1200液相色譜儀、G1321A熒光檢測器：安捷倫科技有限公司；AURA 230V 8W柱后光化學衍生器：美國AURA公司；德國斯蒂芬UM44A粉碎機：德國斯蒂芬公司；WARINGCOMMERCIAL8010S均質器：美國WARING公司；IKA T25分散機：德國IKA公司。

2.2 材料與試劑

花生仁：國家農產(chǎn)品安全檢測重點實驗室（臨沂）日常檢測樣品；黃曲霉毒素標準樣品：純度>99%，Sigma公司；乙腈、甲醇（色譜純）：美國天地公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；提取用水為蒸餾水；液相流動相用水為milli-Q凈化超純水；折疊濾紙、纖維濾紙、玻璃注射器、塑料漏斗和塑料燒杯：中檢維康技術有限公司。

2.3 標準品的配制

分別取1 mL濃度為3 μg/mL溶于體積比為2∶98的苯與乙腈的黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2標準品于10mL的棕色容量瓶中用甲醇定容，得到濃度為0.3 μg/mL標準儲備液。4種標準儲備液等體積（各取1 mL）混合得標準工作液。

2.4 樣品的提取和凈化

稱取經(jīng)粉碎后的花生仁試驗樣品25.0 g，加5.0 g氯化鈉，添加相應體積濃度為0.3 μg/mL的B1、B2、G1、G2標準儲備液，放置2 h左右，用體積比70∶30的甲醇與水提取液定容至125 mL，均質提取2 min，用折疊濾紙過濾，移取15 mL濾液加30 mL水稀釋，用纖維濾紙過濾后，準確移取15 mL上述濾液，注入玻璃注射器中，以自然流速通過免疫親和柱，流完后吹入空氣進入親和柱中，然后用10 mL蒸餾水淋洗免疫親和柱兩次，棄去全部流出液，吹干小柱，在小柱加入1 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于樣品瓶中供HPLC測定。

2.5 液相色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（ZORBAX SB-C18 5 μm，250 mm ×4.6 mm）；流速：1.00 mL/min；溫度：30℃；進樣體積：10 μL；流動相：甲醇 ∶水=45 ∶55（體積比）；檢測器：熒光檢測器，波長 λEx=360 nm，λEm=440 nm。

3 結果與討論

3.1 方法的選擇

免疫親和柱凈化高效液相色譜法檢測花生中黃曲霉毒素，前處理過程對結果的準確性影響較大。提取液的配比和洗滌及淋洗速率是影響檢測準確性的關鍵因素。該對比評價試驗所采用的提取液甲醇和水的配比為70∶30（體積比）。對于淋洗速率，GB/T 18979-2003（液相色譜法）方法指出為6 mL/min。實際批量檢測操作時用氣泵加壓，因不同品牌產(chǎn)品填裝工藝差異不易控制每個柱子流速在同一水平?；诿庖哂H和凈化為抗體抗原相互作用過程的原理及實驗室日常檢測經(jīng)驗數(shù)據(jù)，淋洗速率減慢能提高檢測回收率。本次試驗采取親和柱上樣后整個前處理過程不再加外壓，完全依靠自然重力凈化。考慮到多次添加和提取批次間的差異，本試驗采取將同一批驗證親和柱所用多次添加提取液全部混合均勻后再進行檢測，以消除提取差異。

3.2 液相色譜儀校正

樣品液相色譜檢測采用五點即用標準工作液稀釋 得到 濃 度 分 別 為 15、7.5、3.75、1.875 ng/mL 和0.937 5 ng/mL校正液。經(jīng)HPLC檢測后相關系數(shù)均大于0.995。

3.3 添加樣品情況及檢測結果

以10 μg/kg濃度添加樣品檢測過程為例：稱取試驗樣品25.0 g，加5.0 g氯化鈉，用濃度為0.3 μg/mL的B1、B2、G1、G2標準儲備液混合后氮氣吹至1 mL左右添加到樣品中，避光靜置2 h后用體積比70∶30的甲醇與水的提取液定容至125 mL，均質提取2 min。用折疊濾紙過濾．將4次提取后的過濾液全部混合均勻后加提取液體積2倍的水稀釋，用纖維濾紙過濾后，準確移取15 mL上述濾液，注入玻璃注射器中，以自然流速通過免疫親和柱，流完后吹入空氣進入親和柱中，再用10 mL蒸餾水淋洗免疫親和柱兩次，棄去全部流出液，吹干小柱。在小柱加入1 mL甲醇洗脫，收集全部洗脫液于樣品瓶中供HPLC測定。

3.4 10 μg/kg濃度添加的平均回收率及標準偏差

回收率及相對偏差表見表1。

表1 回收率及相對偏差表Table 1 Recovery and RSTD data

3.5 柱容量

柱容量驗證試驗采用50 μg/kg濃度添加水平樣品。經(jīng)3個平行樣品的檢測5個品牌親和柱產(chǎn)品回收率均在73%～113%間，數(shù)據(jù)表明所驗證品牌產(chǎn)品在柱容量方面均能滿足日常檢測需要。

3.6 討論

綜合試驗成本和驗證周期，添加回收、批間差和批內差3個指標同時做，即每個品牌的每個批次同時做3個濃度6個平行驗證及3個天然陽性樣品檢測。本次驗證過程共進行了 2、5、10 μg/kg 3個濃度的添加，其他兩個濃度添加的結論同10 μg/kg濃度添加水平一致。因此在實際驗證過程中可以只選擇一個濃度值進行驗證，即提高效率又降低驗證成本。通過試驗證明所驗證5個品牌，除其中E品牌批間/內差大不易判斷外，其他4個品牌質保期內4℃儲存條件下的穩(wěn)定性均較好。

通過試驗數(shù)據(jù)可以看出參加對比驗證試驗的5個不同品牌親和柱除C品牌對黃曲霉毒素B2和G2，特別是G2的回收不理想外其他4個品牌均能滿足試驗要求。C品牌產(chǎn)品生產(chǎn)廠家再將親和柱進行升級改進后性能也能滿足要求。從廠方所提供的兩個批次看批間和批內差別均較好，E品牌批次P1的產(chǎn)品對黃曲霉毒素G2檢測的標準偏差過大的原因是其中5個平行中的一支親和柱對G2的回收率為41.33%所致，鑒于此次試驗為驗證試驗故保留此數(shù)據(jù)。

5種不同品牌的親和柱性能在前處理過程中表現(xiàn)出的差別不大，相對來說A和C兩個品牌產(chǎn)品柱內填料較緊密，過柱過程中流暢性差。B品牌產(chǎn)品過柱時最流暢，另外A和E兩個品牌產(chǎn)品的蓋子均過緊且E品牌的蓋子太小不宜打開。總體技術評價優(yōu)良降序排序為D、B、A、C和E?；谛阅軐Ρ闰炞C目的，本次試驗采取了統(tǒng)一的前處理方法。統(tǒng)一的方法可能引起結果差異，但食品檢測機構的檢測活動需要標準依據(jù)，在執(zhí)行相應標準時如GB/T 18979-2003（液相色譜法）測定花生及制品中黃曲霉毒素，需按標準方法要求進行操作。

4 結論

本文所采用的黃曲霉毒素檢測用免疫親和柱對比方法是結合檢測實際著重從產(chǎn)品的回收率、批內差、批間差、準確度、穩(wěn)定性和柱容量等產(chǎn)品關鍵技術指標考察。該方法簡便易行，能夠篩選出性能優(yōu)越產(chǎn)品，保證檢測質量。通過幾年的實用驗證證明該方法完全可行，可信。參加驗證試驗的5個國內外產(chǎn)品品牌在收到驗證報告的同時也收到了一份產(chǎn)品建議，對于企業(yè)提高產(chǎn)品質量和技術水平具有重要意義。經(jīng)過改進提高5種產(chǎn)品性能均能滿足日常檢測基本需要，總體來說此類產(chǎn)品質量較好。

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Method of Performance Assessment about Aflatoxin Test Immunoaffinity Columns and Its Application

XU Wen-yuan1，NI Xin1，CUI Shu-hua2，ZHU Wan-yan1
（1.Linyi Entry-Exit Inspecting and Quarantine Bureau，Linyi 276034，Shandong，China；2.The Food and Agricultural Products Testing Agency of Shandong Entry-Exit Inspecting And Quarantine Bureau，Qingdao 266002，Shandong，China）

In this article a performance assessment method for aflatoxin test immunoaffinity columns has been developed and applied to five different products.After years of application the method proved to be completely dependable.The performance assessment result which depend on our method can not only been used for product purchase but also as an enhancement to product manufacture for quality improve.

aflatoxin；immunoaffinity column；performance comparison；performance assessment

2016-11-04

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.032

山東出入境檢驗檢疫局課題（SK201285）

徐文遠（1981—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品及輕工業(yè)品安全檢驗檢測技術。