增殖因子對嗜酸乳桿菌液態(tài)培養(yǎng)的影響

張超鳳，李情敏，嚴(yán)美婷，杜霞，陳衛(wèi)平，張鳳英

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

增殖因子對嗜酸乳桿菌液態(tài)培養(yǎng)的影響

張超鳳，李情敏，嚴(yán)美婷，杜霞，陳衛(wèi)平，張鳳英*

（江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045）

對嗜酸乳桿菌培養(yǎng)基中的碳源和增殖因子進(jìn)行優(yōu)化，以增加菌體的數(shù)量。先從碎米粉、玉米、小麥等原料的水解糖液中，選出最佳的碳源及最佳濃度。然后用土豆汁、番茄汁、麥芽汁、白蘿卜汁、乳糖、大豆分離蛋白等6種物質(zhì)作為增殖因子，采用單因素試驗，選出效果較好的增殖因子，繼而采用正交試驗以確定最佳的增殖因子組合，結(jié)果表明：最佳碳源及濃度為4°Bx碎米水解糖液；最佳增殖因子組合為：6%麥芽汁，0.9 g/100 mL乳糖，7%白蘿卜汁，在此條件下液態(tài)發(fā)酵活菌數(shù)可達(dá)6.2×109cfu/mL。

嗜酸乳桿菌；液態(tài)發(fā)酵；增殖因子；活菌數(shù)

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）是一種重要的乳桿菌屬益生菌，屬于革蘭氏陽性桿菌[1-3]，桿的末端呈圓形，不形成色素、過氧化氫酶陰性、不能還原硝酸鹽[4-5]?？勺鳛樯a(chǎn)用理想的飼料添加劑菌株[6]。適合生存在37℃的微酸性環(huán)境中，主要存在于人和動物的腸道和口腔中。乳酸菌的大量生長繁殖維持了腸道菌群的平衡，起到了整腸作用[1]，抑制腸道不良微生物的生長和繁殖，阻止致病菌的入侵和定殖，從而調(diào)整菌群之間的關(guān)系，維持和保證菌群最佳優(yōu)勢組合以及這種組合的穩(wěn)定性。乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸，有助于消化[7-10]。嗜酸乳桿菌分泌的蛋白酶，能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)的消化和吸收。同時，嗜酸乳桿菌在腸道內(nèi)定殖，能激活機(jī)體巨噬活性，誘發(fā)體內(nèi)特異性及非特異性免疫反應(yīng)，提高人和動物的抗感染能力[11-13]。此外，嗜酸乳桿菌能通過改善腸道菌群，抑制致癌物質(zhì)的生成，其本身及代謝產(chǎn)物還能活化免疫功能，抑制體內(nèi)癌細(xì)胞的形成和增殖。近年來對嗜酸乳桿菌的應(yīng)用越來越廣，然而國內(nèi)對嗜酸乳桿菌的研究主要集中在應(yīng)用方面，而基礎(chǔ)研究卻很少[14-17]。但不管是菌劑的開發(fā)還是菌體的分離培養(yǎng)、發(fā)酵劑的制備等，都需要良好的增菌培養(yǎng)基，使嗜酸乳桿菌得以大量增殖。

因而，為了增加嗜酸乳桿菌的活菌數(shù)，我們研究了在厭氧液態(tài)發(fā)酵條件下，選擇出適于工業(yè)生產(chǎn)的嗜酸乳桿菌碳源，并通過研究不同增殖因子對嗜酸乳桿菌液態(tài)發(fā)酵的影響，確定出能提高嗜酸乳桿菌產(chǎn)量、降低嗜酸乳桿菌生產(chǎn)成本、提高資源利用率的最佳增殖因子組合，為嗜酸乳桿菌工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）：于中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）購買。

培養(yǎng)基：

種子液培養(yǎng)基：液態(tài)MRS培養(yǎng)基；菌落計數(shù)培養(yǎng)基：固態(tài)MRS培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：20 g豆粕（20 g豆粕粉加水煮沸20 min，過濾）15 g葡萄糖（或最佳碳源），硫酸鎂 0.5 g，硫酸錳 0.25 g，乙酸鈉 5 g，水 1 000 mL（pH 5.5～6.0）。

主原料：

土豆、番茄、白蘿卜、麥芽：購于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)的菜市場；大豆分離蛋白（食品級）：河南中偌生物科技有限公司；乳糖（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心。

1.2 儀器與設(shè)備

WFZ UV-2100紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；WJ-LCQ二氧化碳培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；ZD-8802搖床：江蘇太倉華利實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分析方法

紫外分光光度計法：在600 nm波長下測定嗜酸乳桿菌的OD值。

稀釋涂布平板法進(jìn)行菌落計數(shù)。

1.3.2 方法

1.3.2.1 水解糖液的制備

將玉米、碎米、小麥磨粉。分別加入85%的水充分混勻，置水浴鍋中加熱至100℃，使其徹底糊化。待溫度降至80℃，加入適量α-淀粉酶混勻保溫20 min，使淀粉液化。再將溫度升至100℃保溫滅酶10 min。繼續(xù)降溫至約60℃時，加入適量β-淀粉酶，混勻，在60℃恒溫條件下保溫約6 h，使淀粉充分糖化。

1.3.2.2 增殖因子的處理

土豆汁、番茄汁、白蘿卜汁：分別將土豆、番茄、白蘿卜新鮮榨原汁，用紗布過濾后滅菌，備用。

麥芽汁：加入75%的水與麥芽混合煮沸20 min，冷卻過濾滅菌，備用。

1.3.2.3 碳源及濃度的確定

以各水解糖液和葡萄糖為碳源，最佳碳源濃度分別為 1、2、3、4、5、6 °Bx，接種 5%的種子液，在 37 ℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h測吸光度，每個碳源濃度做3個平行，以確定最佳碳源濃度。

1.3.2.4 增殖因子單因素試驗

將各個增殖因子以不同含量（除乳糖與大豆分離蛋白其它均為體積分?jǐn)?shù)）[白蘿卜汁（%）：0、2、4、6、8；番茄汁（%）：0、2、4、6、8；土豆汁（%）：0、2、4、6、8；麥芽汁（%）：0、2、4、6、8；乳 糖（g/100 mL）：0、0.5、0.7、0.9、1.1；大豆分離蛋白（g/100 mL）：0、0.2、0.4、0.6、0.8]加入優(yōu)化后的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)測其吸光度，確定最佳的增殖因子及其最佳濃度。

1.3.2.5 增殖因子正交試驗

根據(jù)增殖因子對目的菌的生長促進(jìn)效果以及增殖因子經(jīng)濟(jì)性等條件選出最合適的3種增殖因子，采用L9（34）正交表進(jìn)行正交試驗，試驗因素水平表如表1，并通過分析試驗結(jié)果得出最佳增殖因子組合。

表1L9（34）正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levers of the L9（34）orthogonal experiments

1.3.2.6 生長曲線繪制

用最終確定的增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)嗜酸乳桿菌，每4小時測一次吸光度，連續(xù)測定48 h，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，發(fā)酵時間為橫坐標(biāo)作出嗜酸乳桿菌生長曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源對嗜酸乳桿菌生長的影響

不同碳源對嗜酸乳桿菌生長的影響如圖1所示。

圖1 不同碳源對嗜酸乳桿菌生長的影響Fig.Effect of different carbon source on the growth of Lactobacillus acidophilus

乳桿菌屬對不同種類糖的代謝順序為：葡萄糖>果糖>麥芽糖>半乳糖>蔗糖>甘露糖>核糖>乳糖>纖維二糖[18]，由圖1可知3種水解糖液作為碳源時，嗜酸乳桿菌的長勢都較葡萄糖為碳源時更好，而碎米水解糖液效果最好?？赡苁且驗槠渌馓且褐泻渌偕L因子，且碎米的價格較便宜，在工業(yè)化生產(chǎn)中，既能為企業(yè)節(jié)省生產(chǎn)成本，還能充分利用資源，所以選擇用碎米粉水解液代替葡萄糖作為碳源進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)嗜酸乳桿菌。

2.2 碎米水解液糖含量對嗜酸乳桿菌生長的影響

碎米水解液糖含量對嗜酸乳桿菌生長的影響如圖2所示。

圖2 碎米水解液糖含量對嗜酸乳桿菌生長的影響Fig.2 Effects of different sugar content in broken Rice Hydrolyzate on Lactobacillus acidophilus Growth

由圖2可知，隨著培養(yǎng)基中糖含量的增加，OD值出現(xiàn)先增大后減小的現(xiàn)象，當(dāng)碳源不足時，隨著濃度的增加，菌體迅速繁殖，但濃度過高會造成細(xì)胞脫水而死亡而抑制菌體的生長。當(dāng)碳源濃度為4°Bx時，嗜酸乳桿菌的生長狀況最好，OD值（稀釋20倍）達(dá)到0.364。

2.3 增殖因子對嗜酸乳桿菌生長的影響

2.3.1 白蘿卜、番茄汁、土豆汁、麥芽汁作為增殖因子對嗜酸乳桿菌的影響

白蘿卜、番茄汁、土豆汁、麥芽汁濃度對嗜酸乳桿菌生長的影響如圖3所示。

圖3 蔬菜汁濃度對嗜酸乳桿菌生長的影響Fig.3 Effect of different concentration of vegetables juice on the growth of Lactobacillus acidophilus

由圖3可知白蘿卜汁對嗜酸乳桿菌的生長促進(jìn)比較明顯，麥芽汁對嗜酸乳桿菌的生長有一定的促進(jìn)作用，番茄汁和土豆汁對嗜酸乳桿菌的增殖效果不太明顯，可能是因為白蘿卜汁中含有維生素A、胡蘿卜素、維生素C等多種維生素以及鈣、鉀、鎂等多種金屬元素，從而促進(jìn)了嗜酸乳桿菌的生長。

2.3.2 乳糖作為增殖因子對嗜酸乳桿菌的影響

乳糖濃度對嗜酸乳桿菌的影響如圖4所示。

圖5 大豆分離蛋白濃度對嗜酸乳桿菌生長的影響Fig.5 Effect of different concentration of soy protein isolate on the growth of Lactobacillus acidophilus

由圖4可知，乳糖對嗜酸乳桿菌的增殖效果比較明顯，隨著濃度的增加增殖效果也越來越好，當(dāng)乳糖的濃度為0.9 g/mL時，增殖效果最好，超過這一濃度后，增殖效果反而下降，為此我們選用0.9 g/mL的乳糖作為增殖濃度。

2.3.3 大豆分離蛋白作為增殖因子對嗜酸乳桿菌的影響

大豆分離蛋白濃度對嗜酸乳桿菌的影響如圖5所示。

圖4 乳糖濃度對嗜酸乳桿菌生長的影響Fig.4 Effect of different concentration of lactose on the growth of Lactobacillus acidophilus

由圖5可知，大豆分離蛋白對嗜酸乳桿菌的生長促進(jìn)作用很不明顯，各濃度間影響差異也不明顯，因此對其不予考慮。

通過比較各種增殖因子的最佳增殖效果，選出對嗜酸乳桿菌的生長有較顯著影響的3種增殖因子，即白蘿卜汁、麥芽汁、乳糖作為增殖因子做正交試驗。

2.4 增殖因子正交試驗

白蘿卜汁、麥芽汁、乳糖作為增殖因子對嗜酸乳桿菌影響的正交試驗結(jié)果見表2。

表2 增殖因子正交試驗結(jié)果Table 2The result of L9（34）orthogonal experiments

續(xù)表2 增殖因子正交試驗結(jié)果Continue table 2The result of L9（34）orthogonal experiments

通過DPS數(shù)據(jù)處理軟件采用Duncan法對正交試驗結(jié)果進(jìn)行分析，得出表3。

表3 增殖因子正交試驗方差分析表Table 3The variance analysis of L9（34）orthogonal experiments

從表3可知A（麥芽汁）、C（白蘿卜汁）都對嗜酸乳桿菌的生長促進(jìn)效果極顯著，它們的P值＜0.01，其中B（乳糖）0.01＜P＜0.05，說明其效果顯著。

表4 增殖因子的多重比較結(jié)果Table 4 The results of multiplication factors

由表4的多重比較結(jié)果可知，最優(yōu)組合為A2B1C3，即6%麥芽汁，0.8 g/mL乳糖，7%白蘿卜汁。在此配方下液態(tài)發(fā)酵嗜酸乳桿菌，測OD值和對菌數(shù)進(jìn)行計數(shù)，并與9個處理中最高的一組即A2B2C3相比。結(jié)果表明在A2B1C3條件下培養(yǎng)的嗜酸乳桿菌的OD值和菌數(shù)均低于A2B2C3的組合，在A2B2C3的組合條件下的培養(yǎng)基OD值為0.449，菌數(shù)經(jīng)計數(shù)可達(dá)6.2×109cfu/mL，且與未經(jīng)優(yōu)化的時5.3×108cfu/mL相比，菌數(shù)高很多。由此確定最終的最優(yōu)增殖因子組合為A2B2C3，即6%麥芽汁，0.9 g/mL乳糖，7%白蘿卜汁。

2.5 生長曲線的繪制

嗜酸乳桿菌生長曲線如圖6所示。

圖6 嗜酸乳桿菌生長曲線Fig.6 The growth curve of Lactobacillus acidophilus

從圖6可看出0～8 h嗜酸乳桿菌處于適應(yīng)期；8 h～24 h為對數(shù)期，這段時間內(nèi)細(xì)菌數(shù)量大量增加；24 h～40 h左右則為穩(wěn)定期，細(xì)菌數(shù)量變化不大，40 h時細(xì)菌數(shù)量達(dá)到最大，此時為收集細(xì)菌的最佳時間；40 h之后，開始進(jìn)入衰亡期，細(xì)菌數(shù)量開始下降。

3 結(jié)論

本試驗確定了嗜酸乳桿菌最佳碳源為碎米水解糖液，以及最佳濃度為4BX。為嗜酸乳桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)中提供了一定的理論意義，不僅可以實現(xiàn)資源的有效利用，降低環(huán)境壓力，還能節(jié)約生產(chǎn)成本。在以4°Bx碎米水解液的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入增殖因子，進(jìn)行單因素實驗和正交試驗分析，得出了有利于嗜酸乳桿菌生長的最佳增殖因子組合，即6%麥芽汁，0.9 g/100 mL乳糖，7%白蘿卜汁。按以上配方液態(tài)發(fā)酵嗜酸乳桿菌的最高OD值（稀釋20倍）可達(dá)到0.449，菌數(shù)經(jīng)計數(shù)可達(dá)6.2×109cfu/mL，較基礎(chǔ)培養(yǎng)基而言（5.3×108cfu/mL），菌數(shù)得到較大程度的增加，并利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基做嗜酸乳桿菌的生長曲線，得出40 h為菌體的最佳收集時間，這樣為益生菌制劑研制前期（獲得菌體）奠定了基礎(chǔ)。

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Effect of Proliferation Factor on the Liquid Culture of Lactobacillus acidophilus

ZHANG Chao-feng，LI Qing-min，YAN Mei-ting，DU Xia，CHEN Wei-ping，ZHANG Feng-ying*
（College of Food Science and Engineering，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，Jiangxi，China）

To increase the number of Lactobacillus acidophilus，the best carbon source and optimize the breeding factors in the culture medium was chosen.From hydrolysised the broken rice，corn and wheat into sugar，elect the best carbon source and the best concentration.Then put the solidify，tomato juice，malt juice，white turnip juice，lactose，soy protein isolated as multiplication factor of substances，adopt single factor experiment，choose the multiplication factor with better effect，and then adopt orthogonal experiment to determine the best combinationofmultiplicationfactor，theresultsshowedthatthebestcarbonsourceandconcentrationfor4 °Bx broken rice hydrolyzed sugar liquid；best multiplication factor combination was：6%malt juice，0.9 g/100 mL lactose，7%white turnip juice，the living bacterium number coule be up to 6.2 × 109cfu/mL under this liquid fermentation condition.

Lactobacillus acidophilus；liquid state fermentation；multiplication factor；number of living bacterium

2016-09-20

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.14.038

張超鳳（1991—），女（漢），在讀碩士研究生，研究方向：食品微生物。

*通信作者：張鳳英，女，研究員，碩士生導(dǎo)師，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。