鐵皮石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析及指紋圖譜構(gòu)建

李懷志 劉士輝 沈若剛 張中林 黃和喜 王兆龍

摘要[目的] 對鐵皮石斛進行有效的遺傳多樣性分析，對于制訂鐵皮石斛的保護策略具有重要的意義。[方法]使用25對SRAP引物對供試的石斛進行遺傳多樣性分析。[結(jié)果] 25對SRAP標記共獲得86條多態(tài)性條帶，每對引物組合可擴增出1～6條多態(tài)性條帶，平均3.07條；20份石斛品系間Jaccard相似系數(shù)為0.002～0.821；構(gòu)建了20份石斛品系的SRAP特征指紋圖譜。 [結(jié)論]供試的鐵皮石斛有較為豐富的遺傳變異。

關(guān)鍵詞鐵皮石斛；SRAP；遺傳多樣性；指紋圖譜

中圖分類號S502.4；R282.5文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0126-03

Abstract[Objective]The genetic diversity of Dendrobium officinale was analyzed，which had the vital significance for formulating conservation strategies for D.officinale.[Method] Twentyfive pairs of SRAP primer combinations were used to evaluate genetic diversity of Dendrobium.[Result] These primer combinations produced 86 polymorphic bands.Each primer pair can produce 1-6 bands，an average of 3.07.Jaccard similarity coefficient among 20 Dendrobium ranged from 0.002 to 0.821. Characteristic fingerprint among 20 Dendrobium was constructed.[Conclusion] There had abundant variation in tested D.officinale.

Key wordsDendrobium officinale；Sequencerelated amplified polymorphism （SRAP）；Genetic diversity；Fingerprint

鐵皮石斛（Dendrobium officinale）是蘭科石斛蘭屬多年生附生草本植物，主要分布于浙江、云南、福建、貴州、廣東、廣西、湖南、江西等地，其干燥莖是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，具有降低血糖、提高機體免疫、抗癌、抗氧化等作用。近年來，由于過度采挖，加上其苛刻的生長環(huán)境，野生的鐵皮石斛資源已日漸枯竭。對鐵皮石斛進行有效的遺傳多樣性分析，對于制訂鐵皮石斛的保護策略具有重要的意義。

相關(guān)序列擴增多態(tài)性（Sequencerelated amplified polymorphism，SRAP）是一種新型的基于PCR 的標記系統(tǒng)，最早由Li等[1]提出。由于SRAP標記具有操作簡便、重復(fù)性較好、多態(tài)性較高、共顯性高等特點而廣泛應(yīng)用在種質(zhì)資源鑒定、遺傳多樣性分析、圖譜構(gòu)建、指紋分析及圖位克隆等方面[2]。

目前鐵皮石斛栽培技術(shù)基本成熟，影響產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要瓶頸是種質(zhì)混亂、品種退化等問題。大部分種植基地的鐵皮石斛群體在形態(tài)和顏色上不一致，莖稈顏色有深有淺，有些吃起來有很多渣子。這主要是由于目前應(yīng)用的種源基本上是野生植株繁殖的，沒有經(jīng)過人工選育，而有些野生植株本身是雜合的，如果進行自花授粉，其后代是分離的，這只有通過人工選育才能解決。對上海孫橋現(xiàn)代農(nóng)業(yè)園的鐵皮石斛進行評價有助于理清這些種質(zhì)的親緣關(guān)系，為以后鐵皮石斛間雜交育種提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料供試石斛種質(zhì)資源來源于安徽、浙江等石斛主要產(chǎn)區(qū)。SH-1是金釵石斛（D.nobile Lindl.），SH-2和SH-3是霍山石斛（D.huoshanense），SH-20是金釵石斛與鐵皮石斛的雜交種，其余是鐵皮石斛（D.officinale）。該試驗所用石斛均是組培苗。

1.2基因組DNA提取取植株嫩葉，采用CTAB法提取基因組[3]，以Lambda DNA作為對照，用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并稀釋至約20 ng/L備用。

1.3PCR擴增引物序列參照表2[1]，由上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成。SRAP-PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL，其中包括MgCl2 2.0 mmol/L、dNTP各為0.2 mmol/L、引物0.50 μmol/L、模板DNA 50 ng、Taq酶1 U，不足部分用無菌水補足。擴增程序如下：反應(yīng)混合物94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min， 35 ℃復(fù)性1 min， 72 ℃延伸1 min，5個循環(huán)；94 ℃變性1 min， 55 ℃復(fù)性1 min， 72 ℃延伸2 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增產(chǎn)物加3 /4體積的上樣緩沖液， 94 ℃變性5 min。采用4%的變性聚丙烯酰胺凝膠， 0.5 ×TBE緩沖液，60 W恒功率電泳1.5 h，銀染檢測電泳結(jié)果。

1.4數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計清晰、再現(xiàn)性強的條帶。擴增產(chǎn)物按同一位點條帶有或無分別賦值，有帶記為“1”， 無帶記為“0”； 采用NTSYS-pc version 2.10軟件計算Jaccard相似系數(shù)， 按照UPGMA法進行聚類。

2結(jié)果與分析

2.1品種遺傳多樣性分析 從154對SRAP引物組合中篩選出37對帶型清晰、多態(tài)性好的引物組合用于遺傳多樣性研究，選出其中25對引物，擴增出的可重演性的差異條帶為86條，擴增片段大小從140～680 bp不等。平均每個引物組合擴增出3.07條多態(tài)性條帶，其中引物ME8-EM14擴增的多態(tài)性條帶最多，為6條。品種間Jaccard相似系數(shù)為0.002～0.821。20份石斛品系中相似系數(shù)最大為0.821（SH-8與SH-12），相似系數(shù)最小為0.002（SH-1與SH-4）。

2.2品種聚類分析以0.260為閾值，把20份石斛品系分成4個類群（圖1）。第Ⅰ類群為金釵石斛SH-1，第Ⅱ類群為霍山石斛，包含SH-2和SH-3，第Ⅲ類群為金釵石斛與鐵皮石斛的雜交種SH-20，第Ⅳ類群為鐵皮石斛。從圖1中看出金釵石斛與鐵皮石斛的雜交種SH-20與霍山石斛聚在一起，與鐵皮石斛的親緣關(guān)系較近，與金釵石斛的親緣關(guān)系較遠。金釵石斛與鐵皮石斛雜交種繼承了金釵石斛的高產(chǎn)量，因此市場上經(jīng)常出現(xiàn)以雜交種冒充鐵皮石斛坑害消費者的現(xiàn)象。

2.3品種指紋圖譜構(gòu)建根據(jù)每個品種DNA 擴增圖譜中SRAP 標記位點條帶的有（1）或無（0）進行統(tǒng)計，結(jié)果由0和1排列形成字符串，構(gòu)成一個品種的數(shù)字指紋圖譜。表3 列出了20份石斛品系的數(shù)字指紋圖譜。從擴增出的86條特征條帶中選擇11條譜帶把供試20份石斛品系完全區(qū)分開，這11條帶是由ME8-EM14、ME9-EM3、ME1-EM7、ME1-EM14、ME3-EM3及ME3-EM5這6對引物擴增的。

3結(jié)論與討論

研究表明SRAP技術(shù)是研究作物遺傳多樣性的有效工具。通過對孫橋農(nóng)業(yè)園鐵皮石斛遺傳多樣性分析，理清了石斛間親緣關(guān)系的遠近，為防止品種間混雜，并為鐵皮石斛間雜交選育提供依據(jù)。

丁鴿等[4]利用RAPD標記對不同居群鐵皮石斛的遺傳多樣性進行評價，研究表明鐵皮石斛種內(nèi)多態(tài)性水平較高，可達91.35%，用SRAP標記評價不同居群種內(nèi)多態(tài)性水平可達88.01%。包英華等[5]、肖正杭[6]采用SRAP 標記技術(shù)擴增8個居群鐵皮石斛DNA條帶，結(jié)果表明從64對SRAP引物組合中篩選出7 對有效引物組合，共擴增出396條清晰譜帶，其中多態(tài)性條帶占382個，總多態(tài)性條帶比率 99.46%，其鐵皮石斛遺傳多樣性水平比該研究中遺傳多樣性水平高的原因在于該研究只統(tǒng)計了具有重演性的差異DNA譜帶主帶。

在鐵皮石斛親緣關(guān)系分析上，SSR和SRAP標記對親緣關(guān)系的分類相同，說明SRAP標記在遺傳親緣關(guān)系分析上和SSR標記一樣有很高的可靠性。

總之，利用SRAP技術(shù)對鐵皮石斛親緣關(guān)系分析可以揭示石斛不同品系之間的關(guān)系遠近，并為品種鑒定及育種提供更準確的信息。

參考文獻

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[3] MUTLU N，BOYACI F H，GCMEN M，et al.Development of SRAP，SRAPRGA，RAPD and SCAR markers linked with a Fusarium wilt resistance gene in eggplant[J].Theoretical and applied genetics，2008，117（8）：1303-1312.

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[5] 包英華，潘超美，白音，等.鐵皮石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性的SRAP分析[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2014，37（5）：349-353.

[6] 肖正杭.鐵皮石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性及HPLC指紋圖譜分析[D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2013.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，Journal of Anhui Agri. Sci.2017，45（14）：129-131