柱前衍生化—HPLC檢測亞氨基二乙酸法制備雙甘膦反應進程的研究

莊勇 黃楷

摘要[目的]建立一種利用亞氨基二乙酸制備雙甘膦的新檢測方法。[方法]以9-芴基甲氧羰酰氯為衍生化試劑對合成雙甘膦的反應物進行衍生化。采用Gemini C18 （150.0 mm ×4.6 mm， 5.0 μm）色譜柱，室溫下以0.05 mol/L NaH2PO4 （pH=3.5）溶液-乙腈（V/V，60∶40）為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長265 nm，對反應液中的亞氨基二乙腈、亞氨基二乙酸和氨氣衍生物進行分離檢測。[結(jié)果]反應液中的亞氨基二乙腈、亞氨基二乙酸和氨氣衍生物，分別在0.02～1.20、0.02～1.20、0.10～2.00 mg/mL濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（r≥0.999 8），檢出限分別為0.000 4、0.000 4、0.003 0 mg/mL，加樣回收率分別為99.96%、99.86%、99.89%，相對標準偏差均不超過1.6%。[結(jié)論]該研究建立的方法可用于亞氨基二乙酸法制備雙甘膦反應體系的跟蹤分析。

關(guān)鍵詞亞氨基二乙酸法；雙甘膦；高效液相色譜；衍生化

中圖分類號O657.7文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）14-0012-02

Abstract[Objective] To establish a new inspection method for preparation of PMIDA with iminodiacetic acid.[Method] The derivatives of the reaction solution for synthesizing PMIDA were synthesized using 9fluorenyl methyl chloroformate （FMOCCl） as the derivatization reagent.The separation of the derivatives was performed on a Gemini C18 column at room temperature by isocratic elution.The mobile phase composed of 60% 0.05 mol/L NaH2PO4 （pH=3.5） and 40% CH3CN at a flow rate of 1.0 mL/min.The injection volume was 10 μL and the detection wavelength was 265 nm.[Result] The linear ranges of the derivatives of iminodiacetonitrile， iminodiacetic acid and ammonia were respectively 0.02-1.20 mg/mL， 0.02-1.20 mg/mL and 0.10-2.00 mg/mL with correlation coefficient of more than or equal to 0.999 8.The detection limits for the derivatives were respectively 0.000 4， 0.000 4 and 0.003 0 mg/mL.The average recoveries of 3 derivatives were respectively 99.96%， 99.86% and 99.89% with relative standard deviation values less than or equal to 1.6%.[Conclusion] The method developed in the present paper could be used for trace analysis of the reaction system for preparation of PMIDA by iminodiacetic acid.

Key wordsIminodiacetic acid；PMIDA；HPLC；Derivatization

草甘膦是美國孟山都公司于1974 年商品化的滅生性有機膦類除草劑[1]，是目前世界農(nóng)藥市場上噸位最大、銷售額最高的除草劑品種。雙甘膦是制備草甘膦的重要中間體[2-3]，其生產(chǎn)過程中涉及的物質(zhì)包括亞氨基二乙腈、亞氨基二乙酸和氨氣等。在實際生產(chǎn)過程中需要一個準確的分析檢測方法對整個工藝流程進行中間控制，了解原料以及中間體的反應消耗情況，才能對整個生產(chǎn)工藝過程做出正確的分析和判斷。為此，建立一種能快速準確監(jiān)控雙甘膦制備進程的分析方法就顯得尤為重要。

由于該反應過程中涉及的含氮化合物的結(jié)構(gòu)中均缺少發(fā)色團，難以采用常規(guī)的高效液相色譜法（HPLC）直接測定。為此，筆者根據(jù)高效液相色譜中脂肪胺類化合物的柱前衍生原理[4]，以熒光試劑9-芴基甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）[5-7]與反應液中的胺類化合物柱前衍生，然后用HPLC進行分離測定。

1材料與方法

1.1材料Shimadzu LC-2010型高效液相色譜儀，日本島津；FMOC-Cl（>99%），Sigma-Aldrich；亞氨基二乙腈（純度≥98%），廣州江城石化；氫氧化鈉（含量≥98%）、鹽酸（含量35%），國藥集團；亞磷酸（含量89%），上海實誠；甲醛（含量37%），上海凌風；乙腈（色譜純），北京百靈威；超純水，自制。

1.2方法

1.2.1標準品衍生方法。稱取亞氨基二乙腈、亞氨基二乙酸、合成中間體等標準樣品約25.0 mg置于50 mL容量瓶中，加20 mL硼酸緩沖液（0.2 mol/L、pH 7.5），再加20 mL FMOC-Cl乙腈溶液（0.4 mmol），用乙腈定容至刻度，在室溫25 ℃下放置10 min，配制成0.5 mg/mL濃度的待測標準樣品溶液。

1.2.2樣品衍生化方法。亞氨基二乙酸中控樣品配制：稱取反應液體約2 mL（約400 mg）置于燒杯中，用3 mol/L鹽酸水溶液調(diào)節(jié)pH至7±1，并用純水稀釋至約100 mL，再取0.2 mL該溶液，加入0.8 mL硼酸緩沖液和0.8 mL FMOC-Cl乙腈溶液（0.016 mmol），配制成約0.8 mg/mL的待測樣品溶液，靜置10 min待測。

雙甘膦中控樣品衍生化配制：稱取反應液體約2 mL（約400 mg）置于燒杯中，用28%氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至7±1，并用純水稀釋至約100 mL，再取0.2 mL該溶液，加入0.8 mL硼酸緩沖液和0.8 mL FMOC-Cl/乙腈溶液（0.016 mmol），配制成約0.8 mg/mL的待測樣品溶液，靜置10 min待測。

1.2.3色譜分離條件。Gemini C18色譜柱（5.0 μm，4.6 mm×150.0 mm）；流動相A為0.05 mol/L NaH2PO4 （pH=3.5），流動相B為 乙腈，A∶B=60%∶40%（V/V）；流速0.8 mL/min；進樣量8 μL；柱溫35 ℃；波長265 nm。

2結(jié)果與分析

2.1分離條件的優(yōu)化該試驗分別選擇了不同濃度的磷酸二氫鈉-磷酸緩沖溶液作為流動相對亞氨基二乙腈、亞氨基二乙酸以及氨的衍生物同時檢測，發(fā)現(xiàn)只有當流動相中磷酸二氫鈉的濃度為0.05 mol/L，用磷酸將體系的pH調(diào)到3.5時最合適，原料和中間體出峰相對較快，峰形對稱性好，且各物質(zhì)的分離效果較好，各標準品的色譜圖見圖1。

2.2衍生方法的重現(xiàn)性按照上述衍生化方法，對亞氨基二乙腈、亞氨基二乙酸、氨氣分別平行衍生5次，然后采用HPLC進行分析。結(jié)果表明，衍生物保留時間的RSD分別為0.38%、0.62%、0.52%，峰面積的RSD分別為1.60%、1.20%、1.10%。表明該衍生化方法重復性良好。

2.3衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性將上述樣品衍生反應液在室溫下保存3 d后測定，結(jié)果表明，各衍生產(chǎn)物的峰型、峰面積和保留時間等均無明顯差異，各組分的衍生產(chǎn)物檢測結(jié)果的RSD均小于2%，表明各組分的衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性良好。

2.4標準曲線、準確度、精密度和檢出限配制一系列標準溶液，按方法“1.2.1”衍生和“1.2.3”進行色譜分析。以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，以3倍信噪比計算檢出限，結(jié)果如表1所示。在一定的濃度范圍內(nèi)，各組分峰面積和濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均在0.999 5以上。精密量取已測定含量的反應溶液，分別加入高、中、低3種不同濃度的標準溶液，混勻，衍生化后進樣分析，考察分析方法的加樣回收率和RSD。結(jié)果表明，加樣回收率分別為99.89%、99.86%、99.96%，RSD分別為1.60%、1.20%、1.10%。

2.5實際樣品反應過程分析稱取一定的反應原料，在小于45 ℃投料時即產(chǎn)生大量的氨氣，同時迅速生成亞氨基二乙酸進行反應，按照一定的時間間隔取適當?shù)姆磻海凑铡?.2.2”和“1.2.3”的方法進行樣品處理和分析，測定體系中各組分的濃度，考察反應過程中底物和產(chǎn)物的變化，確定最適合的反應條件。如圖2所示，隨著反應的進行，原料亞氨基二乙腈的濃度下降，亞氨基二乙酸濃度逐漸升高，在60 min

時達到最大。所以建立的跟蹤監(jiān)測方法對亞氨基二乙酸法制備雙甘膦反應有很大幫助。

3結(jié)論

該試驗建立的方法具有簡便快速、靈敏準確、衍生條件溫和及衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性好等特點，能對亞氨基二乙酸法制備雙甘膦的工業(yè)化生產(chǎn)進程進行準確的跟蹤和檢測，對降低該路線的工業(yè)化生產(chǎn)成本和提高產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。

參考文獻

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