一種同系異體異位心臟與皮瓣同期移植小鼠模型的建立

劉士強 丁健科 張棟梁 陳晨 陳建武 莊然 蘇映軍 郭樹忠

一種同系異體異位心臟與皮瓣同期移植小鼠模型的建立

劉士強1丁健科1張棟梁1陳晨1陳建武1莊然2蘇映軍1郭樹忠1

目的 構(gòu)建一種簡單可靠的同期心臟聯(lián)合皮瓣移植小鼠模型，探討復(fù)合組織與內(nèi)臟器官聯(lián)合移植后可能存在的相互影響。方法 取供體C57小鼠心臟及腹股溝皮瓣移植至受體C57小鼠頸部。獲取供體心臟血管蒂主動脈時，保留其右側(cè)頸總動脈分支，供體心臟主動脈與肺動脈分別與受體C57小鼠右側(cè)頸總動脈和頸外靜脈連接；獲取供體腹股溝皮瓣的營養(yǎng)血管分別與供體心臟的右側(cè)頸總動脈及受體左側(cè)頸總靜脈相連，即將供體頸總動脈作為血管橋，連接供體心臟與皮瓣。術(shù)后每天觀察、記錄皮瓣與心臟的存活情況，最后行組織病理學(xué)檢查。結(jié)果 同系移植物存活時間大于100 d。平均手術(shù)時間為（193.6± 7.8）min，其中心臟熱缺血時間為（14.4±1.7）min，皮瓣熱缺血時間為（28.0±4.2）min。術(shù)后第100天，組織學(xué)檢查顯示，心肌、皮瓣組織細胞完好，無炎癥細胞浸潤。結(jié)論 我們成功地構(gòu)建了一種簡便可靠的同期小鼠心臟聯(lián)合皮瓣移植模型，可用于復(fù)合組織與內(nèi)臟器官聯(lián)合移植的相關(guān)實驗研究。

復(fù)合組織移植；內(nèi)臟器官移植；Cuff套管；血管橋；小鼠模型

內(nèi)臟器官移植（solid organ transplantation,SOT）作為治療終末器官衰竭的有效手段已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。但由于創(chuàng)傷、感染、腫瘤等原因，部分患者移植術(shù)后創(chuàng)面難以閉合[1]。近年來，復(fù)合組織移植（composite tissue allotransplantation,CTA）在創(chuàng)面覆蓋、功能外觀修復(fù)中取得了良好的效果[2-4]。SOT的患者同期行CTA修復(fù)難以閉合創(chuàng)面作為一種新的有效方法，已經(jīng)得到了臨床驗證[4-8]。然而內(nèi)臟器官與復(fù)合組織聯(lián)合移植后在免疫排斥反應(yīng)中的相互影響尚不清楚，且缺乏合適的動物模型進行相應(yīng)的研究。因此，自2015年12月至2016年6月，我們建立小鼠心臟聯(lián)合皮瓣同期移植模型，用于開展相關(guān)的研究。

1 實驗材料

雄性C57BL/6（H-2b）健康小鼠13只，6～12周齡，體質(zhì)量為21～25 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于清潔級動物飼養(yǎng)室。本實驗經(jīng)第四軍醫(yī)大學(xué)動物實驗倫理委員會批準。

2 實驗方法

2.1 實驗分組

實驗分為兩組：解剖組（n=8）。3只小鼠進行心臟、皮瓣及頸部受區(qū)解剖探查；5只小鼠分離并結(jié)扎雙側(cè)頸外靜脈及右側(cè)頸總動脈，術(shù)后觀察小鼠的存活狀態(tài)。同系移植組（n=5）。小鼠間行同系心臟聯(lián)合皮瓣移植，術(shù)后觀察皮瓣、心臟存活狀態(tài)，術(shù)后100 d對移植物行病理學(xué)檢查。

2.2 手術(shù)過程

本實驗由單人操作，手術(shù)過程中小動物恒溫電熱毯保持術(shù)區(qū)37℃，采用戊巴比妥（60 mg/kg）腹腔注射麻醉，術(shù)中必要時追加1/4初始麻醉劑量。受體術(shù)前腹腔注射0.3 ml林格液，術(shù)后腹腔注射0.2 m l葡萄糖生理鹽水溶液，以補充術(shù)中水分丟失和能量損耗。

2.2.1 解剖組 實驗動物麻醉后,剔除頸部毛發(fā),標記0.7 cm×1.0 cm矩形術(shù)區(qū)。取仰臥位，固定后碘伏消毒術(shù)區(qū)，沿標記線剪開矩形術(shù)區(qū)皮膚，分離皮下組織，保留矩形術(shù)區(qū)左側(cè)皮膚軟組織，掀開形成的帶蒂皮瓣，剪除部分舌下腺，分離右側(cè)頸外靜脈、頸總動脈并結(jié)扎，同時分離對側(cè)頸外靜脈并結(jié)扎。頸外靜脈結(jié)扎點為近心端靠近鎖骨的主干處，手術(shù)過程中盡量減少靜脈分支的損傷。結(jié)扎完畢后曠置創(chuàng)面，間斷以生理鹽水濕潤，1 h后原位縫合帶蒂皮瓣。術(shù)畢，待動物蘇醒后送飼養(yǎng)籠觀察。

2.2.2 同系移植組 供體腹股溝皮瓣的獲取：麻醉后，一側(cè)腹股溝區(qū)剔除毛發(fā)，標記1.2 cm×1.5 cm矩形術(shù)區(qū)。取仰臥位，固定后碘伏消毒術(shù)區(qū)，沿標記線剪開皮膚、皮下組織，掀起皮瓣，顯露股動靜脈。分離股動靜脈，于腹股溝韌帶處、腹壁淺動靜脈分支遠心端結(jié)扎并離斷股血管，取下皮瓣[9]。套管方法[10]：將股動脈穿過26 G套管，使管壁外翻包裹套管后，用11-0尼龍線環(huán)繞1周固定;股靜脈則使用24 G套管以同樣的方法固定，將皮瓣置于4℃生理鹽水保存（圖1a）。供體心臟的獲取[11]：腹股溝皮瓣取下后剪開小鼠腹壁，顯露腹部下腔靜脈，注入0.4 ml肝素鹽水（50 IU），1 min后剪開血管使血液流出；剪開膈肌與胸骨兩側(cè)肋骨并掀起，打開胸腔，切除胸腺，結(jié)扎并離斷左側(cè)上腔靜脈；剪開右側(cè)上腔靜脈及下腔靜脈遠端使血液流出，30 G針頭刺入胸主動脈，注入4℃生理鹽水3.0 ml進行灌注；然后分離右側(cè)頸總動脈至分叉處，結(jié)扎并離斷右側(cè)鎖骨下動脈，在左側(cè)頸總動脈分支水平離斷主動脈干，這樣可使心臟主動脈保留右側(cè)頸總動脈分支（圖1b）。先后結(jié)扎并剪斷右側(cè)上腔及下腔靜脈。盡可能分離肺動脈主干，并在遠端離斷，最后完全結(jié)扎肺靜脈，取下心臟置入4℃生理鹽水中保存。

受體麻醉后,剔除頸部毛發(fā),標記0.7 cm×1.0 cm術(shù)區(qū)。取仰臥位，消毒后剪開皮膚、皮下組織，去除部分右側(cè)舌下腺及胸鎖乳突肌，分離右側(cè)頸外靜脈、頸總動脈（圖1c），近心端分別以血管夾夾畢后使用22 G、26 G套管，受體心臟并不摘除；取出供體心臟，將受體頸總動脈連接心臟主動脈，受體頸外靜脈連接心臟肺動脈，將供體心臟保留的頸總動脈分支使用血管夾夾畢，然后使心臟恢復(fù)血供；分離受體左側(cè)頸外靜脈，近心端夾畢。取出供體皮瓣，股動脈與供體頸總動脈連接，股靜脈與受體頸外靜脈連接，松開血管夾，恢復(fù)皮瓣血供（圖1d）。調(diào)整并固定心臟位置，固定血管蒂，縫合皮瓣。

2.3 大體觀察

解剖組術(shù)后每天觀察小鼠活動狀態(tài)是否異常，是否存在偏癱或活動減少，毛發(fā)是否光亮整齊，頭面部是否水腫，每日測量體質(zhì)量變化。同系移植組術(shù)后每天觀察皮瓣顏色的改變以及心臟跳動情況，觸摸皮瓣質(zhì)地和心臟跳動強度，判斷是否出現(xiàn)淤血、缺血壞死、血腫、感染等并發(fā)癥。

2.4 組織學(xué)檢查

術(shù)后第100天，取移植組供體皮瓣及心臟，置于10%甲醛溶液固定24 h后，儲存于70%乙醇溶液，石蠟包埋后切片（4μm），HE染色后觀察。

圖1 同系移植組術(shù)中 a.已經(jīng)套管完畢的供體腹股溝皮瓣 b.分離出頸總動脈分支的供體心臟 c.受體雙側(cè)頸外靜脈及右側(cè)頸總動脈 d.移植至受體的心臟及皮瓣移植物

3 結(jié)果

3.1 解剖組觀察

單純心臟移植模型中，心臟血管蒂主動脈長度較短，不保留任何分支，經(jīng)過解剖組的研究發(fā)現(xiàn)，適當延長主動脈長度，保留右側(cè)頸總動脈，可為移植心臟供血的同時通過血管分支為其他器官供血。雙側(cè)頸總動脈由血管蒂長，管壁較厚，口徑與腹股溝皮瓣血管蒂股動脈匹配，非常適合作為血管橋。右側(cè)頸總動脈較左側(cè)頸總動脈可縮短心臟血管蒂長度，且與主動脈角度合適，減少心臟移植后蒂扭轉(zhuǎn)，且移植受體分支處后不易返折，右側(cè)頸總動脈更適合作為血管橋（圖2）。C57小鼠結(jié)扎雙側(cè)頸外靜脈及右側(cè)頸總動脈，術(shù)后無異常改變，觀察4周發(fā)現(xiàn)小鼠狀態(tài)良好、活動自如、反應(yīng)敏捷、毛發(fā)光亮整齊；未出現(xiàn)偏癱、行走障礙，面部浮腫。術(shù)后1周內(nèi)體質(zhì)量降低10%左右，隨后逐漸回升。

圖2 供體心臟與皮瓣通過頸總動脈連接示意

3.2 同系移植組手術(shù)時間及器官缺血時間

同系移植組平均手術(shù)時間為（193.6±7.8）min，其中受體手術(shù)時間為（87.6±6.3）min。心臟熱缺血時間（打開供體胸腔至心臟灌注4℃保存液之間和從4℃保存液取出與受體連接至恢復(fù)血供的時間）為（14.4±1.7）min。供體皮瓣熱缺血時間為（28.0± 4.2）min。通過使用供體血管橋連接心臟皮瓣，避免了分離更多的受體血管，以及使用簡便的Cuff血管吻合方法，縮短了受體手術(shù)時間；如果2名實驗者分別實施供體與受體手術(shù)，則手術(shù)時間及器官缺血時間可進一步縮短。

3.3 同系移植物大體觀察及組織病理學(xué)檢查

由于實驗前進行了大量的探索與改進，同系移植組存活率為100%，僅1例術(shù)后第2天出現(xiàn)傷口裂開，立即予以縫合后逐漸愈合。術(shù)后100 d持續(xù)觀察，皮瓣顏色紅潤，隨時間推移，腫脹逐漸消失，重新生長出的毛發(fā)與周圍方向不一致，心臟搏動規(guī)律有力。由于Cuff技術(shù)的應(yīng)用，術(shù)后血管吻合處未發(fā)生出血、栓塞；移植物在受體頸部，避免了術(shù)后受體對移植物的撕咬；受體未發(fā)現(xiàn)感染、無毛發(fā)脫落、表皮脫屑、潰瘍形成等并發(fā)癥發(fā)生。與解剖組相似，術(shù)后1周內(nèi)受體的體質(zhì)量降低10%左右，隨后逐漸回升。術(shù)后第100天，病理顯示皮瓣組織結(jié)構(gòu)完整，心肌細胞完好，無明顯炎癥細胞浸潤（圖3）。

4 討論

自從第1例手移植和顏面移植后，CTA取得了令人鼓舞的修復(fù)效果[12-13]，但長期服用免疫抑制劑所帶來的不良反應(yīng)，如感染、腫瘤、代謝紊亂等限制了其廣泛應(yīng)用[14]。SOT聯(lián)合應(yīng)用CTA覆蓋難以閉合的創(chuàng)面被認為是拯救生命所必須，小腸、肝臟等器官聯(lián)合CTA已成功應(yīng)用于臨床[15]。但是，內(nèi)臟器官與復(fù)合組織在免疫學(xué)中相互影響及分離排斥等問題仍待研究，因此，必須構(gòu)建復(fù)合組織與內(nèi)臟器官聯(lián)合移植的動物模型。

圖3 同系移植物術(shù)后大體及組織病理學(xué)檢查結(jié)果 a.術(shù)后即時 b.術(shù)后100 d c.皮瓣組織結(jié)構(gòu)完整，界限清晰（HE×200）d.心肌細胞完好，無明顯炎癥細胞浸潤（HE×200）

同時移植多個器官手術(shù)難度較大，且操作時間長，創(chuàng)傷較大，實驗動物很難耐受，相關(guān)模型鮮有報道。Yang等[16]首先報道了心臟與復(fù)合組織聯(lián)合移植模型，但其實驗動物為大鼠，并且在移植心臟后10 d再次手術(shù)移植復(fù)合組織，操作過程較復(fù)雜，占用了頸部與腹股溝兩處術(shù)區(qū)。相比大鼠，我們使用的小鼠模型具有基因背景清楚，轉(zhuǎn)基因、敲除品系廣泛，各類抗體制劑、分子探針種類繁多，其H2抗原系統(tǒng)與人類MHC相近，成本低廉，易飼養(yǎng)等優(yōu)勢，而且將心臟與復(fù)合組織同期移植在頸部一處術(shù)區(qū)，減輕了創(chuàng)傷，簡化了手術(shù)流程。Oh等[17]構(gòu)建了小鼠心臟聯(lián)合胸腺、胸骨CTA模型，用于研究含血管化骨髓的復(fù)合組織（vascularized bone morrow transplantation, VBMT）及胸腺誘導(dǎo)同種異體移植免疫耐受的實驗研究，但胸骨胸腺組成的復(fù)合組織與心臟串聯(lián)，血液回流必須通過心臟。我們的模型是利用心臟血管蒂的分支作為血管橋為復(fù)合組織供血，血液回流分別經(jīng)過受體雙側(cè)頸外靜脈，從而使兩器官并聯(lián)連接，為研究免疫學(xué)問題減少了解剖上的相互影響。

術(shù)中只需剝離近鎖骨頸外靜脈主干，減少其余靜脈分支損傷，避免靜脈回流障礙造成的面部腫脹；由于右側(cè)舌下腺必須切除以容納供體心臟，還應(yīng)減少對側(cè)舌下腺損傷以防小鼠術(shù)后飲食減少，造成體質(zhì)量減輕；移植物血管蒂較長，血管吻合完畢后應(yīng)按照血管走行方向進行固定，防止血管返折。NKamada和RYCalne報道的Cuff血管吻合技術(shù)雖然縮短了血管吻合時間，降低了手術(shù)難度，但由于小鼠血管口徑較細，管壁很薄，本模型對顯微外科操作水平有較高的要求。此外，本模型采用異位移植的心臟，只進行營養(yǎng)血管的吻合，并無射血功能，在血流灌注上與原位心臟存在部分差異。按本手術(shù)方式，亦可用其他復(fù)合組織如肌皮瓣、骨肌皮瓣、VBMT等替代皮瓣，與心臟同期移植，可進一步進行嘗試。

我們成功地構(gòu)建了小鼠心臟聯(lián)合皮瓣同期移植模型，具有諸多特點：⑴使用Cuff血管吻合技術(shù)，降低吻合難度；⑵僅行1次手術(shù)，頸部1處受區(qū)，減少創(chuàng)傷；⑶皮瓣可由其他復(fù)合組織代替使模型多樣化。本模型將促進復(fù)合組織與內(nèi)臟器官聯(lián)合移植后相互影響的研究，還可用于內(nèi)臟、復(fù)合組織分離排斥研究的相關(guān)實驗，并利于新的免疫治療策略的開發(fā)。

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Establishment of a simultaneous transplantation mouse model of allogeneic heterotopic heart and skin flap

LIU Shi-qiang,DING Jian-ke,ZHANG Dong-liang,CHEN Chen,CHEN Jian-wu,ZHUANG Ran,SU Ying-jun,GUO Shu-zhong. (Department of Plastic Surgery,Xijing Hospital,Xi′an 710032,China)

ObjectiveWe aimed to develop a model ofconcomitant heart and composite tissue transplant in mice,which could be used to compare the possible surgical results.MethodsIsograft transplants were performed among C57BL/6 mice.The donor's heart was harvested with the right common carotid artery,then the aorta and pulmonary arterywere anastomosed to the recipient's right common carotid arteryand external jugular vein,and the donor's abdominal flap vessels were connected to the donor's rightcommon carotid arteryand recipient's leftexternal jugular vein,respectively.Heart viabilitywas assessed by daily palpation,and the skin flap was observed every day.Finally, the grafts were assessed histologically.ResultsIndefinite allograft survival(＞100 days)was achieved in the isograft transplant group.The mean totaloperative timewas(193.6±7.8)minuteswith theaveragewarm ischemia timeofheartand skin flap was(14.4±1.7)minutes and (28.0±4.2)minutes,respectively.Histologic examination displayed viable grafts withoutnecrosis or fibrosis.ConclusionWe succeeded in developing a technically feasible and reliable model of simultaneous heart and composite tissue transplant in mice which may be used in the research ofmutual immunologic influence and split rejection between composite tissue and solid organ.

Composite tissue allotransplantation;Solid organ transplantation;Cuff technique;Vessel bridge;Mice model

GUO Shu-zhong,Email:shuzhong@fmmu.edu.cn

2016-10-06）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.013.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.013

國家自然科學(xué)基金（30830102）

1.第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 全軍整形外科研究所，陜西 西安 710032；2.第四軍醫(yī)大學(xué) 基礎(chǔ)部免疫教研室，陜西 西安 710032

郭樹忠，Email：shuzhong@fmmu.edu.cn

本文引用格式：劉士強,丁健科,張棟梁,等.一種同系異體異位心臟與皮瓣同期移植小鼠模型的建立[J].中國美容整形外科雜志,2017, 28(3):166-169.