TSG-6對兔耳瘢痕形成過程中MMP-2、TIMP-2表達及瘢痕修復的影響

文科 虞冬梅 劉漪倫

TSG-6對兔耳瘢痕形成過程中MMP-2、TIMP-2表達及瘢痕修復的影響

文科1虞冬梅2劉漪倫3

目的 建立兔耳創(chuàng)面修復瘢痕模型，探討在瘢痕形成過程中腫瘤壞死因子α刺激基因6（TSG-6）對基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2（TIMP-2）表達和瘢痕修復的影響。方法 參照Morris方法，建立兔耳創(chuàng)面模型，設(shè)計實驗組，注射TSG-6；對照組注射等量的無菌生理鹽水。檢測各組瘢痕指數(shù)及Ⅰ、Ⅲ型膠原的表達情況來評價瘢痕增生情況。同時檢測MMP-2及TIMP-2基因的表達情況。結(jié)果 實驗組的瘢痕指數(shù)及Ⅰ、Ⅲ型膠原含量低于對照組，MMP-2的表達較多，對應的TIMP-2表達降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論 TSG-6可以抑制瘢痕增生，可能是增多瘢痕組織中MMP-2表達來實現(xiàn)的。

瘢痕；腫瘤壞死因子α刺激基因6；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2

創(chuàng)面愈合過程機制復雜，創(chuàng)傷愈合后往往伴隨著瘢痕的出現(xiàn)，瘢痕的出現(xiàn)給患者帶來很大的精神和經(jīng)濟負擔，同時，一些患者會出現(xiàn)瘙癢、疼痛、紅腫等臨床癥狀，給患者的生活和工作帶來很大困擾。目前，瘢痕的確切機制尚不明確，治療方法很多，但尚無標準的治療指導原則，仍需要進行更加深入地研究。

腫瘤壞死因子α刺激因子6（tumor necrosis factor α-inducible protein 6,TSG-6）是由腫瘤壞死因子α誘導的抑制過度炎癥反應的基因[1]。相關(guān)研究證實，其與炎癥反應密切相關(guān)，可抑制炎性細胞遷移和粘附。炎癥在創(chuàng)面愈合及瘢痕形成過程中具有重要的作用，早期炎癥反應較強，可釋放腫瘤壞死因子α、白細胞介素-6等炎性因子，誘導TSG-6產(chǎn)生，抑制炎癥反應，減弱瘢痕的形成。1997年，DE Morris等成功建立了兔耳瘢痕模型[2]，瘢痕可持續(xù)數(shù)月不退，為體內(nèi)瘢痕研究實驗提供了可能，此方法在國內(nèi)外普遍開展。自2015年12月至2016年4月，成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院整形科采用Morris兔耳瘢痕模型，在瘢痕形成過程中進行人為藥物干預，最后檢測瘢痕厚度與面積，以及檢測瘢痕組織塊基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2, MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-2（metallopeptidase inhibitor,TIMP-2）基因的表達情況。

1 實驗動物

新西蘭雄性大白兔30只（購自成都醫(yī)學院實驗中心），月齡3個月，體質(zhì)量為2.0～2.5 kg。

2 實驗方法

2.1 兔耳瘢痕模型建立 30只新西蘭雄性大白兔于標準條件下適應飼養(yǎng)7 d后，制作兔耳創(chuàng)面。用脫毛劑去除兔耳背部的兔毛。將3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）行耳緣靜脈注射麻醉，麻醉成功后徹底消毒。參照Morris方法于兔耳的腹側(cè)用直徑0.6 cm的活檢穿孔器進行打孔，解剖纖維鏡下，剝除皮下組織及軟骨膜，形成直徑為0.6 cm的圓形創(chuàng)面，左右耳各2個創(chuàng)面，按壓止血，再次消毒并包扎，所有切口均選在耳后腹側(cè)，深達全層，即至軟骨膜層，避免毛發(fā)周期對創(chuàng)面愈合及瘢痕形成的影響。

2.2 分組處理 術(shù)后第4天，將30只大白兔隨機分為對照組和實驗組，每組15只（創(chuàng)面總數(shù)60個）,實驗組沿創(chuàng)面周邊十字交叉選擇4個點，分別注射0.5 ml的TSG-6（1μg），對照組注射等體積的生理鹽水，連續(xù)注射14 d。本實驗操作嚴格遵守《實驗動物保護條例》。

2.3 觀察記錄并檢測 術(shù)后28 d，切取兔耳瘢痕組織，測量瘢痕面積，并進行HE染色，計算瘢痕指數(shù)。PCR檢測MMP-2及TIMP-2的表達。

2.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大體觀察 創(chuàng)面在3 d左右已基本干燥結(jié)痂；13 d左右完全愈合。對照組在23 d左右瘢痕凸出皮膚，呈淡紅色，術(shù)后28 d左右形成增生性瘢痕。實驗組15只大白兔，2只感染，創(chuàng)面形成52個瘢痕，瘢痕高于體表，且有攣縮現(xiàn)象。對照組感染3只，創(chuàng)面形成有效瘢痕48個。實驗組的瘢痕顏色較對照組淡，質(zhì)地較對照組軟。

3.2 兔耳瘢痕面積及瘢痕指數(shù) 對形成的瘢痕組織做HE染色，計算瘢痕指數(shù)[3]（圖1），其中實驗組的瘢痕指數(shù)為2.03±0.45，對照組的瘢痕指數(shù)為1.98±0.70，兩組比較，差異具有統(tǒng)計學意義（n=100, t=2.898,P=0.011）。實驗組的瘢痕面積為21.83± 1.99，對照組瘢痕面積為25.5±1.33（n=100,t=6.866, P=0.001）。

3.3 基因檢測 取術(shù)后28 d的瘢痕組織，PCR檢測MMP-2、TIMP-2、COL1A1、COL1A3，結(jié)果表明，實驗組MMP-2基因表達明顯低于對照組，而實驗組TIMP-2基因表達高于對照組，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義（圖2）。

4 討論

隨著我國工業(yè)、交通、能源等領(lǐng)域的發(fā)展，嚴重創(chuàng)傷毀形已成為一新的多發(fā)病。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，我國每年僅車禍和燒傷已達100萬余例，而增生性瘢痕作為外傷、燒傷及手術(shù)后的最常見的繼發(fā)疾病，在創(chuàng)傷、手術(shù)后的發(fā)生率可達40%以上，燒傷后更可達91%[4]。瘢痕的過度增生或攣縮，往往導致丑陋外觀并可嚴重損害肢體關(guān)節(jié)活動以及口鼻眼等體表器官的生理功能，對患者造成巨大的身心傷害。如何調(diào)控創(chuàng)傷后組織愈合過程，有效避免病理性愈合及瘢痕過度增殖，是燒創(chuàng)傷毀形治療中的一個亟待解決的熱點問題。

圖1 實驗組與對照組瘢痕組織HE染色（對照組膠原排列紊亂，出現(xiàn)旋渦狀結(jié)節(jié)及膠原結(jié)節(jié)，×20） a.實驗組b.對照組

圖2 實驗組與對照組相關(guān)基因表達對比分析

瘢痕產(chǎn)生原理是皮膚損傷后真皮成纖維細胞過度增生、纖維蛋白分泌積聚導致的，目前，瘢痕的治療方法很多，如瘢痕內(nèi)注射類固醇激素、激光治療[5]、脂肪移植，外科手術(shù)切除等。

TSG-6無論是在細胞層面還是動物模型中均被證實其具有一定的抗炎作用，相關(guān)研究已經(jīng)證實TSG-6能抑制白細胞介素6、白細胞介素1β和嗜中性粒細胞浸潤遷移，保護角膜，避免物理化學損傷，同時可以抑制新毛細血管的生成[6]。在新西蘭大白兔關(guān)節(jié)炎模型中，證實其可以減少炎癥反應及水腫，保護關(guān)節(jié)[7]。由于炎癥在瘢痕形成過程中具有重要的作用[8-10]，前人在小鼠皮膚全層損傷模型中證實其具有抗纖維化作用[11]。相關(guān)文獻證實，間質(zhì)細胞分泌的TSG-6可以通過抑制巨噬細胞的的炎性信號表達及一些相關(guān)因子的分泌已達到抑制纖維化的作用[12]。應用TSG-6治療瘢痕是個新的治療方法。MMPs家族及其抑制劑在創(chuàng)面愈合部位的細胞外基質(zhì)合成和降解具有機密的調(diào)控作用，外源性的MMP-2可以抑制成纖維細胞分化及炎癥反應，減少膠原合成。TMMP-2則可促進膠原合成，促進愈合后瘢痕增生。其中MMP-2可以減少I型膠原纖維合成，抑制瘢痕增生提高創(chuàng)面愈合質(zhì)量，TIMP-2抑制MMP-2的活性，促進一些纖維化基因的表達和纖維蛋白的分泌。

本實驗制作的兔耳瘢痕模型[13]，經(jīng)過TSG-6注射后的實驗組瘢痕形成厚度變小，MMP-2基因檢測表達增多，而對應的對照組卻無此改變，證實其具有促進MMP-2表達作用，同時檢測出實驗組的TIMP-2表達減少，MMP-2對于TIMP-2具有一定的調(diào)控作用，TIMP-2表達抑制具體機制則需要進一步詳細地研究。未來治療瘢痕也可以通過應用一些技術(shù)如創(chuàng)傷早期使用rsTSG-6蛋白達到早期預防治療瘢痕的目的。

［1］ 張?zhí)K文,李小靜,陳釗,等.TSG-6對人病理性瘢痕成纖維細胞增殖與凋亡的影響[J].安徽醫(yī)科大學學報,2016,51(1):102-105.

［2］ 竇孝康,程代薇.雌三醇及拮抗劑三苯氧胺對兔耳瘢痕增生的影響[J].中國生化藥物雜志,2014,(5):30-32,36.

［3］ 洪艷玲.鹽酸法舒地爾作用于增生性瘢痕的實驗研究[J].檢驗醫(yī)學與臨床,2015,(z2):15-17.

［4］ Gauglitz GG,Korting HC,Pavicic T,et al.Hypertrophic scarring and keloids:pathomechanisms and current and emerging treatment strategies[J].Mol Med,2011,17(1-2):113-125.

［5］ 向英,匡永琴,鄒靜,等.非剝脫性Lux1540nm點陣激光在淺表瘢痕治療中的護理[J].激光雜志,2013,34(3):68-69.

［6］ Le Blanc K,Mougiakakos D.Multipotent mesenchymal stromal cells and the innate immune system[J].Nat Rev Immunol,2012,12(5): 383-396.

［7］ Oh JY,RoddyGW,Choi H,et al.Anti-inflammatory protein TSG-6 reduces inflammatory damage to the cornea following chemical and mechanical injury[J].Proc Natl Acad.Sci USA,2010,107(39): 16875-16880.

［8］ Viera MH,Amini S,Valins W,et al.nnovative therapies in the treatment of keloids and hypertrophic scars[J].J Clin Aesthet Dermatol,2010,3(5):20-26.

［9］ Choi H,Lee RH,Bazhanov N.Anti-inflammatory protein TSG-6 secreted by activated MSCs attenuates zymosan-induced mouse peritonitis by decreasing TLR2/NF-kappaB signaling in resident macrophages[J].Blood,2011,118(2):330-338.

［10］ 李泰然,孟慶延,李萬同,等.自體刃厚頭皮聯(lián)合負壓封閉引流技術(shù)回植中厚供皮區(qū)的臨床應用[J].中國臨床實用醫(yī)學, 2015,6(1):4-6.

［11］ Su WH,ChengMH,Lee WL,et al.Nonsteroidal anti-inflammatory drugs for wounds:pain relief or excessive scar formation?[J].Mediators Inflamm,2010,2010:413238.

［12］ Qi Y,Jiang D,Sindrilaru A,et al.TSG-6 released from intradermally injected mesenchymal stem cells accelerates wound healing and reduces tissue fibrosis in murine full-thickness skin wounds [J].J Invest Dermatol,2014,134(2):526-537.

［13］ Liu S,Jiang L,Li H,Shi H,et al.Mesenchymal stem cells prevent hypertrophic scars formation via inflammatory regulation when undergoingapoptosis[J].JInvestDermatol,2014,134(10):2648-2657.

Effect of TSG-6 on MMP-2 and TIMP-2 expression and scar repairing in cicatrization

WEN Ke,YU Dong-mei,LIU Yi-lun.(Department of Plastic and Reconstructive Surgery,the First Affiliated Hospital of Chengdu University,Chengdu 610000,China)

ObjectiveTo investigate the influence of TSG-6 on MMP-2 and TIMP-2 expression and scar repairing in cicatrization in the model of rabbit ear scar.MethodsA rabbit ear scar model was established according to the Morris method.The left ear was selected as the experimental group and injected with TSG-6,and the right ear,as the control group,was injected with the same dose of sterile normal saline.The condition of scar hyperplasia was evaluated by scar index andⅠandⅢcollagen expression.The expression of MMP-2 and TIMP-2 gene was also tested.ResultsThe scar index andⅠandⅢcollagen content in the experimental group were less than that in the control group.MMP-2 expressed relatively higher and TIMP-2 expressed lower.The difference was statistically significant (P＜0.05).ConclusionScar hyperplasia can be inhibited by TSG-6.The mechanism increased MMP-2 expression in cicatricial tissue.

Scar;TSF-6;Matrixmetalloproteinase-2;Matrix metallo-proteinase inhibitor

2016-11-23）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.014.

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.014

四川省教育廳科研項目（16ZB0287）

成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院（1.燒傷整形科，3.中心實驗室）四川 成都 610000；2.四川省平安醫(yī)院 整形外科，四川 成都610000

本文引用格式：文科,虞冬梅,劉漪倫.TSG-6對兔耳瘢痕形成過程中MMP-2、TIMP-2表達及瘢痕修復的影響[J].中國美容整形外科雜志,2017,28(3):170-172.

參考文獻中英文作者名的著錄方法

在醫(yī)學期刊的論文中，引用英文文獻的比例很高，但有不少作者將英、美人的姓名搞錯，以至檢索核對時出現(xiàn)錯姓、錯名或姓名全錯。英、美人姓名的習慣寫法是：名-名-姓，“名”可以有1個、2個或3個，但“姓”只有1個。因此，從書籍或期刊中的姓名轉(zhuǎn)錄到文獻時，要將次序調(diào)整為姓-名-名?！靶铡笔遣豢梢院唽懙模弧懊笨梢钥s寫，用第一個字母大寫，不用縮寫點。數(shù)據(jù)庫在著錄作者姓名時，已經(jīng)調(diào)整為“姓-名-名”，可照錄。