人咬肌內(nèi)注射A型肉毒毒素后組織形態(tài)學(xué)觀察

朱順文 王君 馬昊 徐國棟 馬福順

人咬肌內(nèi)注射A型肉毒毒素后組織形態(tài)學(xué)觀察

朱順文1王君1馬昊2徐國棟2馬福順1

目的 觀察人咬肌內(nèi)注射A型肉毒毒素后咬肌纖維的組織形態(tài)學(xué)改變。方法 自2011年4月至2015年10月，收集60例雙側(cè)下頜骨肥大伴咬肌肥大患者的左側(cè)和右側(cè)咬肌標(biāo)本，共120份。將60份未注射A型肉毒毒素的咬肌標(biāo)本作為對照組，60份已注射A型肉毒毒素的咬肌標(biāo)本作為實驗組。兩組標(biāo)本均行石蠟切片和HE染色，光鏡下觀察兩組咬肌纖維的基本結(jié)構(gòu)，測量其橫截面面積，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。結(jié)果 光學(xué)顯微鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)兩組咬肌纖維的基本結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，兩組咬肌纖維橫截面面積的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。咬肌纖維橫截面面積在第12周時減小程度最大，之后減小趨勢放緩，第24周時，與第12周時的面積基本一致。結(jié)論 A型肉毒毒素能誘導(dǎo)人咬肌萎縮，在注射后第12周時萎縮程度最大，之后無明顯變化。

A型肉毒毒素；咬肌肌纖維；咬肌肥大；肌纖維橫截面面積

良性咬肌肥大是一種尚未明確具體發(fā)病機(jī)制的常見臨床現(xiàn)象[1]。其以下頜角區(qū)及附近軟組織膨大，伴或不伴有局部疼痛為特點[2]，嚴(yán)重肥大者可導(dǎo)致面部輪廓畸形、不對稱。當(dāng)前良性咬肌肥大的臨床治療方式有手術(shù)治療、藥物治療、射頻治療等，但各有優(yōu)缺點。A型肉毒毒素的咬肌內(nèi)注射治療通常被認(rèn)為是一種有效、安全性高、不良反應(yīng)小的低侵襲性療法[3]，被廣泛應(yīng)用于臨床。濰坊醫(yī)學(xué)院收集60例雙側(cè)下頜骨肥大伴咬肌肥大患者的咬肌標(biāo)本，觀察并分析了人咬肌內(nèi)注射A型肉毒毒素后咬肌肌纖維的組織形態(tài)學(xué)改變。現(xiàn)報道如下。

1 實驗材料

1.1 標(biāo)本來源 咬肌標(biāo)本來源于自2011年4月至2015年10月行口內(nèi)入路下頜骨咬肌部分切除術(shù)的60例雙側(cè)下頜骨肥大伴咬肌肥大患者，共120份（每例患者左、右側(cè)各留取標(biāo)本1份）。男性7例（14份），女性53例（106份）；年齡17～48歲，平均（23.5±5.5）歲。標(biāo)本的采集部位為近咬肌粗窿1/3處深層咬肌，切取標(biāo)本量至保留該區(qū)域1/3～1/2咬肌，切取的咬肌標(biāo)本均在術(shù)后經(jīng)4%中性緩沖甲醛液及時固定。全部患者均無其他疾病，且均獲得患者的知情同意。

1.2 試劑與儀器 4%中性緩沖甲醛液、二甲苯、乙醇、中性樹膠封片劑、HE染色試劑盒均購自北京索萊寶公司；A型肉毒毒素購自中國蘭州生物制品研究所；Leica EG1150H石蠟包埋機(jī)、Leica RM2255石蠟切片機(jī)（德國LEICA公司）；Olympus BX-51正置光學(xué)顯微鏡、Olympus DP73數(shù)碼照相機(jī)、Cell Sens Dimension圖像分析系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）。

2 實驗方法

2.1 實驗分組 將未行A型肉毒毒素注射治療的患者作為對照組，已行A型肉毒毒素注射治療的患者作為實驗組，每組60份。實驗組中，根據(jù)患者最后一次注射A型肉毒毒素距手術(shù)取材的間隔時間分為4、8、12、16和24周組。兩組咬肌標(biāo)本均在相同條件和環(huán)境下，行石蠟切片、HE染色及組織形態(tài)學(xué)觀察，并對各組咬肌肌纖維的橫截面面積進(jìn)行測量及收集數(shù)據(jù)。

2.2 咬肌石蠟切片及HE染色 取出經(jīng)4%中性緩沖甲醛液固定的咬肌，將咬肌標(biāo)本平置于取材板上，橫切一塊大小約為0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm的咬肌。將切好的咬肌標(biāo)本用紗布袋包裹，流水沖洗12 h[4]，再經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%乙醇由低濃度至高濃度的順序分別脫水1 h，經(jīng)二甲苯透明后，將咬肌標(biāo)本置于石蠟包埋機(jī)中浸蠟，最后經(jīng)石蠟包埋冷卻后制備成石蠟組織塊。將石蠟組織塊置于冰上及時進(jìn)行連續(xù)切片（切片厚度為4 μm），每個石蠟組織塊制作3張石蠟切片，每張切片進(jìn)行HE染色。

2.3 測量咬肌肌纖維的橫截面面積 全部石蠟切片在相同條件和環(huán)境下經(jīng)過HE染色后，用Olympus BX-51正置光學(xué)顯微鏡觀察，采用Cell Sens Dimension圖像分析系統(tǒng)軟件測量兩組咬肌肌纖維的橫截面面積。選取每例患者左側(cè)和右側(cè)咬肌標(biāo)本中染色效果好且視野清晰的切片，400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)取5個視野，測量每個視野內(nèi)全部咬肌肌纖維的橫截面面積，取其平均值。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組咬肌肌纖維橫截面面積的數(shù)值均以±s表示，兩組的差異比較采用U檢驗，實驗組不同時間取材間隔的左側(cè)和右側(cè)咬肌肌纖維橫截面面積的整體比較均采用多因素方差分析，實驗組組間比較采用snk-q檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 兩組咬肌肌纖維的變化 經(jīng)Cell Sens Dimension彩色圖像分析系統(tǒng)軟件分析后，顯示實驗組較對照組咬肌肌纖維橫截面面積明顯減小。兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，肌纖維橫截面面積的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組咬肌肌纖維的橫截面積 μm2

3.2 HE染色組織學(xué)觀察 實驗組與對照組的咬肌肌纖維相比，明顯減小。兩組咬肌肌纖維均具有高度相似的基本組織結(jié)構(gòu)，且肌纖維排列整齊，咬肌肌纖維細(xì)胞均結(jié)構(gòu)完整，未見變性、水腫、壞死等病理改變（圖1）。

3.3 A型肉毒毒素注射4、8、12、16、24周后咬肌肌纖維橫截面面積的變化 注射A型肉毒毒素后，人咬肌肌纖維的橫截面面積會發(fā)生不同程度的減小。隨著時間的推移，咬肌肌纖維的減小程度逐漸增大，第12周時最大，此后減小趨勢逐漸平緩;第24周時，咬肌肌纖維橫截面稍有增大;但與第12周相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。實驗組不同時間間隔的咬肌肌纖維橫截面面積的整體比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2）。實驗組組間數(shù)據(jù)的分析比較發(fā)現(xiàn)，第4周與第8周、第12周與第16周、第16周與第24周右側(cè)咬肌肌纖維橫截面面積的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（snk-q和P值分別為3.75和0.17、9.33和0.06、3.22和0.22）；第8周與第12周右側(cè)咬肌肌纖維橫截面面積的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（snk-q值為22.35，P＜0.05）；第4周與第8周、第12周與第16周、第16周與第24周左側(cè)咬肌肌纖維橫截面面積的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（snk-q和P值分別為4.23和0.15、7.66和0.06、2.77和0.26）；第8周與第12周左側(cè)咬肌肌纖維橫截面面積的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（snk-q值為20.58，P＜0.05），見圖2。

表2 實驗組不同間隔標(biāo)本的咬肌肌纖維橫截面面積

4 討論

圖1 兩組人咬肌肌纖維的HE染色（×400） a.對照組 b.實驗組A型肉毒毒素注射后4周 c.實驗組A型肉毒毒素注射后8周 d.實驗組A型肉毒毒素注射后12周 e.實驗組A型肉毒毒素注射后16周 f.實驗組A型肉毒毒素注射后24周

圖2 實驗組咬肌肌纖維橫截面面積的變化

良性咬肌肥大的臨床治療方法多種，以手術(shù)切除、藥物注射治療、射頻治療為主。由于手術(shù)切除肥大咬肌后會給患者留下切口創(chuàng)傷以及瘢痕[5]，且在手術(shù)過程中，還可能造成神經(jīng)、血管損傷，導(dǎo)致血腫、感染等并發(fā)癥發(fā)生，常令患者難以接受。Huang等[6]研究認(rèn)為，射頻治療咬肌肥大的效果顯著，但局限于射頻治療適應(yīng)證的選擇較為嚴(yán)格，且治療技術(shù)尚不成熟，不能在臨床上大范圍推廣。A型肉毒毒素注射治療具有有效率高、不良反應(yīng)小等優(yōu)點，得到了患者的普遍認(rèn)可。1980年，AB Scott將A型肉毒毒素應(yīng)用于眼肌痙攣的治療。1992年，JD Carruthers和JA Carruthers首次將A型肉毒毒素應(yīng)用于眉間區(qū)皺紋的美容治療。1994年，AP Moore和GDWddo將A型肉毒毒素用于治療良性咬肌肥大。近年來，國內(nèi)外學(xué)者將A型肉毒毒素應(yīng)用于治療咬肌肥大、腓腸肌肥大等良性骨骼肌肥大，并取得了滿意的效果[7-9]。

目前，國內(nèi)外學(xué)者的研究多集中在A型肉毒毒素的臨床治療觀察上，對于注射A型肉毒毒素后組織形態(tài)學(xué)的觀察也是以動物為研究對象而進(jìn)行的研究[10]。由于動物跟人類的解剖和功能差異較大，不能真實地反映A型肉毒毒素注射后對人咬肌的影響，研究結(jié)果具有一定的局限性。因此，進(jìn)行以人咬肌為研究對象的研究很必要。本研究以人咬肌為研究對象，觀察人咬肌內(nèi)注射A型肉毒毒素后，咬肌肌纖維橫截面面積的改變情況，以及分析了A型肉毒毒素注射時間的不同對人咬肌肌纖維的影響。A型肉毒毒素是由厭氧型肉毒梭狀芽孢桿菌產(chǎn)生的高強(qiáng)效神經(jīng)毒素，通過作用于運動神經(jīng)末梢肌肉接頭處，裂解破壞此處的膜聯(lián)系/跨膜蛋白[11]，阻斷神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的釋放和神經(jīng)沖動的傳導(dǎo)，引起肌肉松弛性麻痹，導(dǎo)致肌肉萎縮。研究過程中發(fā)現(xiàn)，在A型肉毒毒素注射12周后，其誘導(dǎo)咬肌肌肉萎縮作用出現(xiàn)明顯的減弱，至注射后第24周時，已基本無誘導(dǎo)咬肌肌肉萎縮作用，推測這可能與A型肉毒毒素的化學(xué)去神經(jīng)作用有關(guān)[12]。已有研究證實，在注射A型肉毒毒素12周后，骨骼肌在原先萎縮的肌肉中會建立起不同程度的功能連結(jié)，這種功能連結(jié)主要是以神經(jīng)發(fā)芽的方式來實現(xiàn)的[13]。當(dāng)萎縮的肌肉再次獲得神經(jīng)支配時，原先失去功能的神經(jīng)末梢肌肉接頭將重新恢復(fù)神經(jīng)沖動的傳遞，肌肉將不再萎縮。因此，本次研究過程中所得出的推測是成立的。

咬肌是骨骼肌的一種，咬肌肌纖維根據(jù)參與生物氧化代謝所需酶的不同主要分為快肌、慢肌纖維兩種類型[14]。本研究證實了A型肉毒毒素注射后能誘導(dǎo)人咬肌萎縮，但未研究A型肉毒毒素注射后引起何種類型的肌纖維發(fā)生萎縮。我們將進(jìn)一步重點研究人咬肌在注射A型肉毒毒素后何種類型肌纖維發(fā)生組織形態(tài)學(xué)改變，旨在為良性咬肌肥大等骨骼肌肥大的A型肉毒毒素治療提供科學(xué)指導(dǎo)。

綜上所述，本研究觀察了人咬肌內(nèi)注射A型肉毒毒素后其組織形態(tài)學(xué)的改變，證實了A型肉毒毒素誘導(dǎo)咬肌萎縮的最佳作用時間為注射后3個月，最長有效時間可持續(xù)至注射后6個月，為臨床上使用A型肉毒毒素治療良性咬肌肥大等骨骼肌肥大提供了重要的依據(jù)。

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本文引用格式：朱順文,王君,馬昊,等.人咬肌內(nèi)注射A型肉毒毒素后組織形態(tài)學(xué)觀察[J].中國美容整形外科雜志,2017,28(3):141-144. DOI:10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.006.

關(guān)于圖的要求

圖包括曲線圖、示意圖、照片等。每一圖應(yīng)有簡短確切的題名，連同圖號置于圖下。必要時，應(yīng)將圖上的符號、標(biāo)記、代碼，以及實驗條件等，用簡練的文字，橫排于圖的下方，作為圖例說明。

曲線圖的縱橫坐標(biāo)必須標(biāo)注“量、標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定符號、單位”。此三者只有在不必要標(biāo)明(如無量綱等)的情況下方可省略。坐標(biāo)上標(biāo)注的量的符號和縮略詞必須與正文中一致。

照片圖要求主題和主要顯示部分的輪廓清晰，層次分明，反差適中，無雜亂背景。人體照片只需顯示必要部位，但應(yīng)能看出是人體的哪一部分。顏面或全身照片，若無須顯示眼部和陰部，應(yīng)說明需遮蓋。使用特定染色方法的顯微照片，應(yīng)標(biāo)明染色方法。顯微照片中使用的符號、箭頭或字母，應(yīng)與背景有很好的對比度。涉及尺寸的照片上應(yīng)該有表示目的物尺寸的標(biāo)度。

Histomorphologic changes of masseter muscle after botulinum toxin A injection

ZHU Shun-wen,WANG Jun,MA Hao,XU Guo-dong,MA Fu-shun.(Weifang Medical University,Weifang 261042,China)

ObjectiveThe histomorphologic changes ofmasseter muscle after botulinum toxin A injection were observed.M ethodsFrom April 2011 toOctober 2015,60 patients with bilateral mandibular and masseter hypertrophy were involved in this study.There were a total of120 masseter muscle specimens.Among them,60 specimens without botulinum toxin A injection were selected as the control group,and the other 60 specimens,with botulinum toxin A injection,as the experimental group.Paraffin section and HE stainingwere performed in both two groups.Basic structure of the masseter muscle fiber was observed under light microscope and the cross-sectional area was measured.The data above were analyzed statistically.ResultsNo change of the basic structure of the masseter muscle fiber was found between the two groups.Compared to the control group,the cross-section area of the masseter muscle fiber decreased more significantly(P＜0.05).The cross-section area of the masseter muscle fiber reached a minimum at the 12th week and gradually recovered after that.No further changes were noticed after another 12-week interval.ConclusionMasseter muscle atrophied after Botulinum toxin A injection.The masseter muscle reached a minimum at the 12th week,and no obvious change occurred after that.

Botulinum toxin type A;Masseter muscle fibers;Masseteric hypertrophy;Cross-section area

MA Fu-shun,Email:fushunma@hotmail.com

2016-10-23）

10.3969/j.issn.1673-7040.2017.03.006

1.濰坊醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261042；2.濰坊市人民醫(yī)院病理科，山東 濰坊 261042

馬福順，Email：fushunma@hotmail.com