芬苯達(dá)唑?qū)β运柘蛋籽562細(xì)胞的增殖抑制作用*

賀立彩， 史柳芝， 鞏 瑞， 杜轉(zhuǎn)運， 顧海華， 呂建新

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢生學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

芬苯達(dá)唑?qū)β运柘蛋籽562細(xì)胞的增殖抑制作用*

賀立彩， 史柳芝， 鞏 瑞， 杜轉(zhuǎn)運， 顧海華， 呂建新△

(溫州醫(yī)科大學(xué)檢生學(xué)院， 浙江 溫州 325035)

目的： 探討抗寄生蟲藥芬苯達(dá)唑?qū)β运柘蛋籽〖?xì)胞K562的作用及機(jī)制。方法: 采用CCK-8法檢測芬苯達(dá)唑?qū)562和正常人外周血單個核細(xì)胞(PBMC)生長的影響；臺盼藍(lán)拒染實驗檢測芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞活力的影響；瑞氏染色觀察芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞形態(tài)的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞周期分布的影響；Western blot檢測芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的影響；免疫熒光觀察芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞核的改變。結(jié)果: 芬苯達(dá)唑能夠顯著抑制K562細(xì)胞的生長，而對PBMC生長無明顯影響；進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，芬苯達(dá)唑顯著抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯；芬苯達(dá)唑處理K562細(xì)胞后，細(xì)胞分裂周期蛋白25C(Cdc25C)磷酸化、周期素依賴性激酶1(Cdk1)-Tyr15去磷酸化以及cyclin B1磷酸化增加；免疫熒光結(jié)果證實芬苯達(dá)唑誘導(dǎo)K562多核細(xì)胞增多(P<0.01)，發(fā)生有絲分裂災(zāi)難。結(jié)論: 芬苯達(dá)唑通過調(diào)控周期相關(guān)蛋白誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯。

芬苯達(dá)唑； 慢性髓系白血??； 增殖抑制； G2/M期阻滯

慢性髓系白血病(chronic myelogenous leukemia，CML)是血液系統(tǒng)干細(xì)胞起源、造血祖細(xì)胞驅(qū)動的骨髓惡性增殖性疾病[1]，90%以上患者存在特征性的費城染色體，即t(9;22) (q34;q11)染色體易位，形成BCR/ABL融合基因[2]。該融合基因編碼P210蛋白，使其酪氨酸激酶活性增強(qiáng)并激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制細(xì)胞凋亡，在促進(jìn)CML的發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[3]。伊馬替尼是CML的一線治療藥物，它是靶向BCR/ABL酪氨酸激酶的抑制劑。雖然多數(shù)費城染色體陽性CML患者伊馬替尼治療后可以取得顯著療效，但耐藥成為伊馬替尼治療CML失敗的主要原因[4-5]。據(jù)統(tǒng)計高達(dá)25%的患者對伊馬替尼原發(fā)性耐藥[6]。因此，急需尋找新的具有抗CML作用的低毒副作用藥物。

老藥新用是一種抗白血病藥物篩選的高性價比策略。這是因為臨床批準(zhǔn)用藥的藥代動力學(xué)已知，這些藥物已在人體或動物體內(nèi)進(jìn)行過毒理學(xué)測試，安全性較高。若研究證實某些藥物具有抗白血病作用，將很快可以進(jìn)入二期臨床試驗進(jìn)行驗證，能夠極大縮短研發(fā)周期和成本。在過去的十幾年中，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了一些老藥用于治療惡性腫瘤[7-9]。

本課題組前期實驗通過對1 000多種FDA 批準(zhǔn)藥物進(jìn)行系統(tǒng)地篩選，發(fā)現(xiàn)芬苯達(dá)唑(fenbendazole，F(xiàn)BZ)具有明顯的抗CML作用。芬苯達(dá)唑?qū)儆诒讲⑦溥蚣易逅幬锏囊环N，可用于防治腸道寄生蟲病，是廣譜類殺寄生蟲藥物[10]。毒理學(xué)實驗表明，動物對芬苯達(dá)唑具有非常好的耐受性[11]。這就提示芬苯達(dá)唑具有較好的臨床應(yīng)用前景。本研究對芬苯達(dá)唑抗CML白血病的作用和機(jī)制進(jìn)行了初步研究，以期為CML的治療提供重要的科學(xué)理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞

慢性髓系白血病細(xì)胞株K562購自ATCC細(xì)胞庫；正常人外周血單個核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)采自學(xué)生志愿者。

2 主要試劑

胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自HyClone；培養(yǎng)基RPMI-1640購自Gibco；CCK-8細(xì)胞試劑盒購自Dojindo；瑞氏染色液購自南京建成有限公司；青霉素、鏈霉素雙抗及細(xì)胞周期檢測試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)公司；抗周期素依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1，Cdk1)、p-Cdk1 (Tyr-15)、細(xì)胞分裂周期蛋白25C(cell division cycle protein 25C，Cdc25C)、p-cyclin B1 (Ser126)抗體、HRP標(biāo)記的鼠 II 抗、兔 II 抗和免疫熒光試劑盒均購自CST； β-tubulin鼠源單克隆抗體購自Sigma；BSA、SDS、Tris、甘氨酸和聚丙烯酰胺購自上海生工。

3 主要方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) K562細(xì)胞采用含1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素和10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，PBMC補(bǔ)加IL-2 (1×105U/L)， 置于37 ℃、5% CO2、95% O2的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

3.2 細(xì)胞活力檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于96孔板，每孔1×104個細(xì)胞，設(shè)3個復(fù)孔，不同劑量FBZ (0、0.1、0.2、0.4和0.8 μmol/L)分別處理K562細(xì)胞和PBMC細(xì)胞48 h。每孔加入10 μL的CCK-8溶液(5 g/L)，37 ℃繼續(xù)孵育2 h，終止培養(yǎng)，450 nm處測吸光度(A)值。

3.3 Western blot實驗 收集各組細(xì)胞，細(xì)胞裂解液提取總蛋白，行SDS-PAGE，電泳結(jié)束后將凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉PVDF膜1 h。分別加入相應(yīng)的 I 抗，4 ℃搖床孵育過夜。第2天，將膜用TBST洗3次，每次10 min。加入HRP標(biāo)記的相應(yīng) II 抗(1∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。將PVDF膜置于ECL試劑中反應(yīng)1～3 min，經(jīng)超靈敏化學(xué)發(fā)光成像分析儀(Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng))掃描得到目的條帶。

3.4 免疫熒光 細(xì)胞離心涂片機(jī)離心制片，4% PFA室溫固定，4% Triton X-100室溫滲透后用含10% NDS的PBS室溫封閉1 h。I 抗1∶500稀釋，4 ℃加濕盒過夜；II 抗1∶500稀釋，37 ℃避光孵育1 h；PBS漂洗，熒光抗淬滅劑封片。熒光顯微鏡觀察并拍照。

3.5 瑞氏染色 細(xì)胞離心涂片機(jī)離心制片，滴加配制好的瑞氏染色液(Ⅰ液和Ⅱ液1∶1混勻后靜置0.5 h)室溫染色5 min，在顯微鏡下觀察并拍照。

3.6 流式細(xì)胞術(shù) 離心收集各處理組細(xì)胞，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)洗滌2次，加入70%乙醇溶液在-20 ℃固定過夜。第2天，1 000×g離心5 min棄去乙醇并用預(yù)冷的PBS相同條件洗2遍。每管細(xì)胞應(yīng)用碘化丙啶染色后，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的DNA含量，用FlowJo軟件分析細(xì)胞周期。實驗重復(fù)3次。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組計量資料間的比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 芬苯達(dá)唑?qū)562和PBMC細(xì)胞生長的的影響

芬苯達(dá)唑系苯并咪唑類驅(qū)蟲藥，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1A所示。為了研究芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞和PBMC細(xì)胞生長的影響，我們用不同濃度的芬苯達(dá)唑(0、0.1、0.2、0.4和0.8 μmol/L)分別處理K562和PBMC細(xì)胞48 h，利用CCK-8法檢測細(xì)胞生長情況。結(jié)果顯示，芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞有顯著的生長抑制作用，且呈明顯的劑量依賴性。芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞作用48 h的IC50為0.17 μmol/L (0.12～0.24 μmol/L)，但芬苯達(dá)唑在高達(dá)0.8 μmol/L時對PBMC生長仍無明顯影響，見圖1B。

Figure 1.Differential effects of FBZ on the growth of normal PBMC and K562 cells detected by CCK-8 assay. A: the chemical structure of FBZ; B: the growth of PBMC and K562 cells treated with different concentrations of FBZ. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖1 芬苯達(dá)唑?qū)BMC和K562細(xì)胞生長的不同影響

2 芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞活力的影響

不同濃度的芬苯達(dá)唑(0、0.1、0.2、0.4和0.8 μmol/L)分別處理K562細(xì)胞0、24、48和72 h后進(jìn)行臺盼藍(lán)染色。結(jié)果顯示，與對照相比，0.2、0.4和0.8 μmol/L的芬苯達(dá)唑處理K562細(xì)胞24 h，細(xì)胞數(shù)目明顯減少(圖2A)，而細(xì)胞活力無明顯改變(圖2B)，說明芬苯達(dá)唑早期抑制了K562細(xì)胞的增殖能力。

Figure 2.FBZ inhibited the proliferation of K562 cells at early phase (A) and performed little impact on the viability of K562 cells (B). K562 cells were treated with the indicated concentrations of FBZ for various time. Viable cell numbers and viability were determined by Trypan blue exclusion assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 μmol/L group.

圖2 芬苯達(dá)唑早期抑制K562細(xì)胞的增殖能力

3 芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞形態(tài)的改變

0.4 μmol/L的芬苯達(dá)唑細(xì)胞處理K562細(xì)胞0、24和48 h后進(jìn)行瑞氏染色，檢測細(xì)胞形態(tài)的改變。結(jié)果顯示，細(xì)胞出現(xiàn)明顯的染色質(zhì)凝集及核膜崩解的現(xiàn)象，提示細(xì)胞發(fā)生有絲分裂期阻滯，見圖3。

4 芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞周期的影響和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白表達(dá)的改變

為了驗證芬苯達(dá)唑是否影響了K562細(xì)胞的周期分布，我們用對照溶劑DMSO和0.4 μmol/L FBZ分別處理K562細(xì)胞24 h，采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞的周期分布進(jìn)行了檢測和分析。結(jié)果顯示芬苯達(dá)唑處理K562細(xì)胞24 h后G0/G1期所占比例明顯減少，同時伴隨著G2/M 期比例顯著升高(圖4A)，說明芬苯達(dá)唑能夠誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生G2/M 期阻滯。這一結(jié)果與芬苯達(dá)唑早期能夠顯著抑制K562細(xì)胞的生長而對細(xì)胞活力無明顯改變相一致。

Figure 3.The effect of FBZ on the morphology of K562 cells. K562 cells were treated with FBZ at 0.4 μmol/L for various time, and the cells were collected onto slides by cytospin with Wright-Giemsa staining (×400).

圖3 芬苯達(dá)唑?qū)562細(xì)胞形態(tài)的影響

為了探索芬苯達(dá)唑是如何將K562細(xì)胞抑制在G2/M期的，0.4 μmol/L 芬苯達(dá)唑處理K562細(xì)胞不同時間檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的改變。結(jié)果顯示，隨著藥物作用時間的延長，cyclin B1的活化形式，即Ser126位磷酸化的cyclin B1顯著增加；總的Cdk1蛋白無明顯改變，Cdc25C磷酸化顯著增加，同時Cdk1-Tyr15磷酸化(Cdk1非活化形式)顯著減少，見圖4B。

Figure 4.FBZ induced cell cycle arrest at G2/M phase. A: K562 cells were treated with vehicle or FBZ at 0.4 μmol/L for 24 h， and DNA content and cell cycle distribution of the K562 cells were determined by flow cytometry; B: the effect of FBZ on the expression of cell cycle-related proteins in K562 cells treated with FBZ at 0.4 μmol/L for various time. β-actin served as an internal control. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol (CON or 0 h) group.

圖4 芬苯達(dá)唑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯

5 芬苯達(dá)唑使K562細(xì)胞發(fā)生分裂期災(zāi)難

對照溶劑DMSO和FBZ分別處理K562細(xì)胞24 h和48 h后，利用DAPI和β-tubulin進(jìn)行免疫熒光染色。與對照組相比，F(xiàn)BZ處理K562細(xì)胞后多核細(xì)胞的比例明顯增加，見圖5。

Figure 5.FBZ induced mitotic catastrophe. K562 cells treated with vehicle or 0.4 μmol/L FBZ for 24 h or 48 h were fixed and stained with β-tubulin antibody (red) and DAPI (blue)， and then the number of multinucleated cells was enumerated. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group.

圖5 芬苯達(dá)唑誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生分裂期災(zāi)難

討 論

慢性髓性白血病占成人白血病的15%，全球年發(fā)病率為(1.6～2.0)/10萬[12]。伊馬替尼自2001年廣泛用于臨床治療慢性髓系白血病以來，有效地延長了病人的生存期，但病人出現(xiàn)嚴(yán)重的副反應(yīng)如水腫、骨骼肌肉痛、骨骼肌肉抽筋疲勞等[13]，且有高達(dá)25%的患者對伊馬替尼原發(fā)性耐藥[6]。因此尋找一種低毒的有效藥物尤為重要。

課題組前期實驗通過對1 000多種FDA 批準(zhǔn)藥物進(jìn)行系統(tǒng)地篩選，發(fā)現(xiàn)芬苯達(dá)唑具有明顯的抗CML作用。芬苯達(dá)唑是一種廣譜、高效、低毒的驅(qū)蟲藥，屬于苯并咪唑藥物，可用于防治腸道寄生蟲病和治療系統(tǒng)性蠕蟲感染[14]。毒理學(xué)實驗表明，動物對芬苯達(dá)唑具有非常好的耐受性。小鼠口服給藥LD50大于10 000 mg/kg[10](相當(dāng)于常規(guī)治療劑量的1 000倍)，腹腔給藥LD50大于1 250 mg/kg，皮下注射給藥LD50大于2 000 mg/kg。在嚙齒類動物研究中沒有明顯的不良反應(yīng)報道[15]，一項為期90 d的小鼠亞慢性毒性實驗研究表明，芬苯達(dá)唑1 600 mg/kg口服給藥60 d后，繼續(xù)2 500 mg/kg口服給藥30 d未出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng)[11]。本文檢測到芬苯達(dá)唑在較低藥物濃度0.4 μmol/L時就能有效抑制慢性髓系白血病K562細(xì)胞的增殖，而對正常外周血單個核細(xì)胞無明顯影響。這表明芬苯達(dá)唑用來治療白血病將是安全和有效的。

作為抗寄生蟲藥，芬苯達(dá)唑能夠結(jié)合寄生蟲的微管蛋白，抑制微管形成，影響腸道線蟲攝取葡萄糖，從而影響其生存與繁殖，進(jìn)而引起蟲體死亡。微管蛋白是細(xì)胞內(nèi)微管的基本構(gòu)成單位，在細(xì)胞骨架組成、運動和分裂過程中都發(fā)揮著非常重要的作用[16]。我們通過形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞周期分析、周期相關(guān)蛋白的檢測和多個核細(xì)胞的計數(shù)證實芬苯達(dá)唑誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生M期阻滯并發(fā)生分裂期災(zāi)難。

有絲分裂期的關(guān)鍵調(diào)控因子是促分裂因子(mitosis-promoting factor, MPF)，該因子由調(diào)節(jié)亞基cyclin B1和激酶Cdk1組成，在有絲分裂G2/M期轉(zhuǎn)變中起關(guān)鍵作用[17-18]。而Cdc25C的活性是細(xì)胞周期進(jìn)入M期的關(guān)鍵步驟之一，Cdc25C通過使Cdk1-Tyr15發(fā)生去磷酸化而激活cyclin B1/Cdk1促進(jìn)細(xì)胞從G2期進(jìn)入M期[19-20]。

芬苯達(dá)唑在抗寄生蟲治療中耐受性好，安全性高。而我們的研究證實，芬苯達(dá)唑在治療濃度就能夠顯著抑制慢性髓系白血病K562細(xì)胞的增殖能力，發(fā)現(xiàn)了芬苯達(dá)唑的新用途和新適應(yīng)癥，為白血病治療提供了一定的科學(xué)理論依據(jù)。

[1] Neviani P, Harb JG, Oaks JJ, et al. PP2A-activating drugs selectively eradicate TKI-resistant chronic myeloid leukemic stem cells [J]. J Clin Invest, 2013, 123(10): 4144-4157.

[2] Taverna S, Giallombardo M, Pucci M, et al. Curcumin inhibitsinvitroandinvivochronic myelogenous leukemia cells growth: a possible role for exosomal disposal of miR-21 [J]. Oncotarget, 2015, 6(26): 21918-21933.

[3] Deininger MW, Goldman JM, Melo JV. The molecular biology of CML [J]. Blood, 2000, 96(10):3343-3356.

[4] Giles FJ, Cortes JE, Kantarjian HM, et al. Accelerated and blastic phases of chronic myelogenous leukemia [J]. Hematol Oncol Clin North Am, 2004, 18(3):753-774.

[5] 梅 芬, 李瑞瑋, 楊同華.15-LO在慢性髓系白血病作用的研究進(jìn)展[J].中國病理生理雜志, 2016, 32(10): 1916-1920.

[6] de Lavallade H, Apperley JF, Khorashad JS, et al. Imatinib for newly diagnosed patients with chronic myeloid leukemia: incidence of sustained responses in an intention-to-treat analysis [J]. Clin Oncol, 2008, 26(20): 3358-3363.

[7] Febbraro T, Lengyel E, Romero IL. Old drug, new trick: repurposing metformin for gynecologic cancers [J]. Gynecol Oncol, 2014, 135(3): 614-621.

[8] Kang D， Song Y, Chen W, et al. "Old Dogs with New Tricks": exploiting alternative mechanisms of action and new drug design strategies for clinically validated HIV targets [J]. Mol Biosys, 2014, 10(8):1998-2022.

[9] Wright GD. Something old, something new: revisiting na-tural products in antibiotic drug discovery [J]. Can J Microbiol, 2014, 60(3): 147-154.

[10]Wagil M, Bialk-Bielinska A, Puckowski A. Toxicity of anthelmintic drugs (fenbendazole and flubendazole) to aquatic organisms [J]. Environ Sci Pollut Res Int, 2015, 22(4): 2566-2573.

[11]Villar D, Cray C, Zaias J， et al. Biologic effects of fenbendazole in rats and mice: a review [J]. Am Assoc Lab Anim Sci, 2007, 46(6): 8-15.

[12]von Bubnoff N, Duyster J. Chronic myelogenous leuke-mia: treatment and mornitoring [J]. Dtsch Artzebl Int, 2010, 107(7): 114-121.

[13]Efficace F, Baccarani M, Breccia M, et al. GIMEMA health-related quality of life in chronic myeloid leukemia patients receiving long-term therapy with imatinib compared with the general population [J]. Blood, 2011, 118(17): 4554-4560.

[14]Sathi G, Bhargava IP, Shanker K. Benzimidazoles as anthelmintics [J]. Pharmazie, 1981, 36(2): 165.

[15]Toth LA, Oberbeck C, Straign CM， et al. Toxicity evaluation of prophylactic treatments for mites and pinworms in mice [J]. Contemp Top Lab Anim Sci, 2000, 39(2): 18-21.

[16]Barrowman MM, Marriner SE, Bogan JA. The binding and subsequent inhibition of tubulin polymerization inAscarissuum(invitro) by benzimidazole anthelmintics [J]. Biochem Pharmacol, 1984, 33(19): 3037-3040.

[17]Ohi R, Gould KL. Regulating the onset of mitosis [J]. Curr Opin Cell Biol, 1999, 11(2): 267-273.

[18]Norbury C, Nurse P. Animal cell cycles and their control [J]. Annu Rev Biochem, 1992, 61(1): 441-470.

[19]Perdiguero E, Nebreda AR. Regulaion of Cdc25C activity during the meiotic G2/M transition [J]. Cell Cycle, 2004, 3(6): 733-737.

[20]Shibuya EK. G2cell cycle arrest： a direct link between PKA and Cdc25C [J]. Cell Cycle, 2003, 2(1): 39-41.

(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Inhibitory effect of fenbendazole on proliferation of human chronic myelogenous leukemia K562 cells

HE Li-cai, SHI Liu-zhi, GONG Rui, DU Zhuan-yun, GU Hai-hua, Lü Jian-xin

(SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:jxlu1313@163.com)

AIM: To investigate the effect of fenbendazole (FBZ) on the proliferation of human chronic myelogenous leukemia (CML) cell line K562. METHODS: The CCK-8 assay was used to detect the effect of FBZ on viability of the K562 cells and normal peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The cell growth was measured by the method of Trypan blue exclusion. The cell cycle was analyzed by flow cytometry. The cell cycle-related proteins were detected by Western blot. RESULTS: The growth of K562 was significantly inhibited by FBZ. However, it elicited little cytotoxic effect on PBMC. Furthermore, FBZ induced G2/M phase arrest and mitotic catastrophe in the K562 cells based on the changes of nuclear morphology, DNA content, mitotic marker analysis and the number of polykaryocytes. CONCLUSION: Fenbendazole significantly inhibits the proliferation of K562 cells and induces cell cycle arrest at G2/M phase by the regulation of cell cycle-related proteins.

Fenbendazole; Chronic myelogenous leukemia; Proliferation inhibition; G2/M phase arrest

1000- 4718(2017)06- 1012- 05

2016- 12- 13

2017- 04- 19

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81400125；No. 81372826)；教育部博士點新教師類資助項目(No. 20133321120003)；浙江省自然科學(xué)基金資助項目(No. LQ13H080002)

R733.72

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.009

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net

△通訊作者 Tel: 0577-86689805； E-mail: jxlu1313@163.com