STC2促進人肝癌細胞HepG2增殖和EMT相關(guān)的遷移*

曹 蕾， 李 磊， 胡明珠， 張一梅， 羅海華， 胡水旺， 劉愛華， 姜 勇△

(南方醫(yī)科大學(xué) 1病理生理學(xué)教研室, 廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室， 2南方醫(yī)院呼吸科， 廣東 廣州 510515)

STC2促進人肝癌細胞HepG2增殖和EMT相關(guān)的遷移*

曹 蕾1， 李 磊1， 胡明珠1， 張一梅1， 羅海華1， 胡水旺1， 劉愛華2， 姜 勇1△

(南方醫(yī)科大學(xué)1病理生理學(xué)教研室, 廣東省蛋白質(zhì)組學(xué)重點實驗室，2南方醫(yī)院呼吸科， 廣東 廣州 510515)

目的： 探討斯鈣素 2(STC2)對人肝癌細胞HepG2增殖、遷移以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)進程的影響。方法: Western blot法檢測不同肝癌細胞株及正常肝細胞株的STC2蛋白表達情況；集落形成實驗分析STC2對HepG2細胞增殖的影響，同時進一步采用實時熒光定量PCR及Western blot法檢測STC2對cyclin D1等增殖相關(guān)基因的表達變化; Transwell實驗分析STC2對肝癌細胞HepG2遷移能力的影響，采用實時熒光定量PCR和Wes-tern blot法檢測過表達和沉默STC2的細胞中EMT分子標志物vimentin和E-cadherin的表達情況。結(jié)果: 與正常肝細胞系相比，STC2蛋白在肝癌細胞中高表達。集落形成實驗結(jié)果說明STC2促進HepG2細胞的增殖，同時STC2可以顯著影響cyclin D1等增殖相關(guān)基因的表達。Transwell實驗結(jié)果說明STC2增強HepG2細胞的遷移能力，同時顯著影響肝癌細胞的EMT過程。結(jié)論: STC2能夠促進肝癌細胞系HepG2的增殖并且影響增殖相關(guān)基因的表達，進一步研究表明STC2能夠影響肝癌細胞的EMT過程，促進肝癌細胞的遷移。

肝細胞癌； 斯鈣素2； 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化； 細胞遷移

迄今為止，由于診斷延誤及不良預(yù)后等原因，肝癌致死率仍然居高不下[1]。特別在國內(nèi)，每年新發(fā)病例占全球50%以上，死亡率僅次于肺癌，在某些農(nóng)村甚至躍居第1位[2-4]。此外，肝癌細胞的侵襲性與轉(zhuǎn)移性也是導(dǎo)致患者腫瘤復(fù)發(fā)、病情惡化而最終死亡的病理基礎(chǔ)[5]。因此，研究肝癌細胞轉(zhuǎn)移機制，找到調(diào)控肝癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控基因具有很大的意義。

斯鈣素2(stanniocalcin 2，STC2)是一種分泌型糖蛋白，在多種組織及器官中均表達，通過自分泌或旁分泌的方式發(fā)揮功能[6]。最近，越來越多的實驗表明，STC2在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程發(fā)揮重要作用[7-8]。STC2通過蛋白激酶B(protein kinase B，PKB;又稱AKT)-細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信號通路促進結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[9]。相似的，在頭頸癌的發(fā)生發(fā)展過程STC2發(fā)揮促癌作用[10]。但是，STC2在肝癌的病理進程的影響還知之甚少。本文以人肝癌細胞系HepG2為研究對象，研究STC2對肝癌細胞增殖、遷移以及上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)進程的影響。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

L02、HepG2、SMMC7721、Bel7402、QGY7703和Huh7細胞株購自ATCC細胞庫；DMEM、RPMI-1640培養(yǎng)基、Lipofectamine 2000以及胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)均購于Thermo；Trizol RNA提取試劑購自康為世紀；SYBR Green染料和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO；鼠抗人STC2單克隆抗體和兔抗人GAPDH單克隆抗體購自Santa Cruz。

2 主要方法

2.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 HepG2、SMMC7721和Huh7細胞均用含10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)，L02、Bel7402和QGY7703細胞采用含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000，方法步驟參照說明書，在HEK293T細胞中包裝慢病毒過表達質(zhì)粒pCDH-CWV-MCS-EF1-puro-STC2以及干擾質(zhì)粒pLKO.1-puro-STC2，使用的包裝質(zhì)粒是pCMV-dR8.91和pCMV-VSV-G，轉(zhuǎn)染48 h后回收培養(yǎng)基，離心去除雜質(zhì)，回收病毒顆粒，感染目的細胞48 h后，5 mg/L嘌呤霉素處理4～5 d，篩選穩(wěn)定過表達和干擾STC2細胞株，干擾序列為5’-AACAGTCTGAGTATTCTGAT-3’。

2.2 Western blot實驗檢測蛋白水平 細胞于4 ℃冰上裂解30 min,離心取上清，調(diào)整各組蛋白濃度一致后進行SDS-PAGE。將凝膠蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，TBST洗膜1次，加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，于4 ℃孵育 I 抗過夜。隔天取膜于HRP標記的 II 抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次后，用增強型化學(xué)發(fā)光劑溶液浸潤，顯影觀察。

2.3 集落形成實驗 過表達STC2細胞株以及對照組細胞株消化后計數(shù)，接種于6孔板中，每孔接種500個細胞，培養(yǎng)15 d后，4%多聚甲醛固定10 min，結(jié)晶紫染色5 min，PBS清洗數(shù)次，顯微鏡下觀察超過50個細胞視為一個集落，烘干拍照。

2.4 Transwell細胞遷移能力實驗 Transwell小室于鋪板前1 h浸潤于無血清培養(yǎng)基中，穩(wěn)定干擾STC2以及對照細胞株消化后，細胞計數(shù)，鋪板于小室內(nèi)，每孔1.5×104個細胞，小室內(nèi)無血清，培養(yǎng)板孔內(nèi)有血清，培養(yǎng)48 h(干擾表達實驗)或24 h(過表達實驗)后，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS清洗數(shù)次，結(jié)晶紫染色5 min，PBS清洗后，使用Zeiss倒置顯微鏡拍照。

2.5 實時熒光定量PCR (RT-qPCR)檢測mRNA水平 RT-qPCR步驟參照TOYOBO產(chǎn)品說明書。Cyclin D1、survivin、增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen， PCNA)、c-Myc、Bcl-2、缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia-inducible factor 1α， HIF-1α)、E-cadherin、vimentin和GAPDH引物序列見表1。采用2-ΔΔCt法計算和比較mRNA的相對表達量。

表1 RT-qPCR引物設(shè)計

3 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，多重比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 STC2在多種肝癌細胞中高表達

Western blot結(jié)果顯示，STC2在正常肝細胞中表達較低，在肝癌細胞系SMMC7721、Bel7402、HepG2、QGY7703和Huh7中的表達顯著高于正常肝細胞。結(jié)果預(yù)示STC2可能參與肝癌的某些病理進程，介導(dǎo)肝癌的發(fā)生發(fā)展，見圖1。

Figure 1.The protein expression levels of STC2 in several cell lines. The relative expression levels of STC2 were normalized to GAPDH. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsL02.

圖1 多種細胞系中STC2蛋白表達水平

2 成功于HepG2細胞中構(gòu)建穩(wěn)定過表達和沉默STC2的細胞株

為了檢測STC2對肝癌細胞增殖的影響，首先我們于人肝癌細胞HepG2中構(gòu)建STC2過表達和沉默的細胞株，RT-PCR結(jié)果顯示成功構(gòu)建過表達和沉默STC2的細胞株，見圖2。

Figure 2.Construction of the cell lines. A: the HepG2 cells with stable overexpression ofSTC2; B: the HepG2 cells with stable silencing ofSTC2. GAPDH was used as loading control. Every experiment was conducted in triplicate.

圖2 細胞株構(gòu)建

3 STC2促進肝癌細胞增殖以及相關(guān)促癌基因的表達

我們采用集落形成實驗檢測STC2對肝癌細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)STC2可以促進肝癌細胞的增殖(圖3A、B)。RT-qPCR進一步發(fā)現(xiàn)過表達STC2能促進cyclin D1、survivin、PCNA、c-Myc、Bcl-2和HIF-1α的mRNA表達上調(diào)，而干擾STC2則可以下調(diào)這些促增殖基因的表達(圖3C、D)。 此外，我們檢測了這些基因的蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)過表達STC2時這些蛋白表達水平升高，而干擾STC2時這些蛋白表達水平下降(圖3E)。

4 STC2增強肝癌細胞HepG2的遷移能力并促進EMT進程

為研究STC2對肝癌細胞遷移的影響，我們通過Transwell實驗發(fā)現(xiàn)，干擾STC2可以顯著抑制肝癌細胞的遷移能力，過表達STC2可以增強HepG2細胞的遷移能力(圖4A、B)。鑒于EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移中的重要作用，我們開展RT-qPCR實驗發(fā)現(xiàn)，過表達STC2可以顯著下調(diào)E-cadherin的mRNA表達水平，而上調(diào)vimentin的mRNA表達；干擾STC2可以促進E-cadherin mRNA表達水平上調(diào)，而顯著下調(diào)vimentin mRNA表達水平(圖4C、D)。通過檢測EMT標志性蛋白表達水平，我們發(fā)現(xiàn)過表達STC2可以下降E-cadherin蛋白表達水平，上調(diào)vimentin的蛋白水平；干擾STC2則可以促進E-cadherin的蛋白表達水平，下調(diào)vimentin的蛋白表達水平(圖4E、F)。

討 論

STC2是斯鈣蛋白家族成員之一，廣泛表達與哺乳動物的脾、腎、肝、骨骼肌等組織[8]。過去關(guān)于STC2的研究主要集中在STC2對鈣離子通道的影響方面，認為STC2能夠影響鈣離子內(nèi)流來調(diào)節(jié)細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)[11]。

近年來，STC2在腫瘤相關(guān)研究中越來越受到重視，越來越多的研究表明STC2參與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展進程[9-10,12]。但STC2對肝癌增殖轉(zhuǎn)移方面的機制研究仍不明確。在該研究中，我們發(fā)現(xiàn)在肝癌細胞系中STC2的表達水平顯著高于正常肝細胞。那么，STC2的高表達對肝癌發(fā)展進程有什么樣的影響呢？為了探討這一問題，我們選用HepG2細胞系構(gòu)建STC2過表達和沉默細胞系，我們發(fā)現(xiàn)過表達STC2可以顯著促進肝癌的增殖，并且對cyclin D1、survivin等促增殖基因的表達有比較強的促進作用，同時STC2可以顯著上調(diào)抗凋亡基因bcl-2的表達并促進HIF-1α的上調(diào)。這些發(fā)現(xiàn)提示我們，STC2可能通過調(diào)節(jié)細胞周期、細胞凋亡、腫瘤微環(huán)境等方面在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮作用，有待進一步深入的研究。

Figure 3.The promoting effect of STC2 on the proliferation and proliferation-associated gene expression in the HepG2 cells. A: colony formation assay was used to detect the proliferation ofSTC2-overexpressing cells and control cells; B: the number of colony dots were counted by ImageJ software in triplicate； C: RT-qPCR was used to test the mRNA levels of proliferation-associated genes inSTC2-overexpressing cells and control cells； D: RT-qPCR was used to test the mRNA levels of proliferation-associated genes inSTC2-silencing cells and control cells； E: Western blot was used to detect the expression of the proliferation-associated proteins inSTC2-overexpressing or -silencing cells and control cells. The bands were semi-quantified with densitometry. The relative expression levels of indicated proteins were normalized to GAPDH. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHepG2；#P<0.05，##P<0.01vsHepG2/shCon.

圖3 STC2對人肝癌細胞HepG2增殖以及相關(guān)促增殖基因表達的影響

有文獻報道，STC2能夠促進神經(jīng)母細胞瘤[13]和缺氧性卵巢癌細[14]的轉(zhuǎn)移和侵襲。那么STC2能否影響肝癌細胞HepG2的遷移能力呢？我們的研究發(fā)現(xiàn)，過表達STC2可以極強的促進肝癌細胞HepG2的轉(zhuǎn)移，而干擾STC2則可以削弱其遷移能力。同時，也有越來越多的研究表明，EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮重要作用[15]。那么，STC2促進肝癌HepG2細胞的轉(zhuǎn)移是否是通過影響其EMT進程呢？我們通過檢測EMT的2個典型分子標志物，發(fā)現(xiàn)STC2可以顯著影響EMT進程，我們的研究表明STC2可以通過影響肝癌細胞HepG2的EMT進而在HepG2細胞轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要的功能。綜上所述，本研究利用慢病毒載體成功構(gòu)建STC2穩(wěn)定過表達和干擾細胞株，分析STC2對HepG2細胞增殖、遷移以及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程中的作用，結(jié)合STC2在結(jié)腸癌、肺癌、頭頸癌中的研究發(fā)現(xiàn)[9-10,12]，提示我們STC2極有可能在肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，需要進一步的深入研究來闡述其可能的分子機理。

Figure 4.STC2 affected the migration of HepG2 cells and was involved in the EMT process. A:STC2-silencing and control cells were subjected to Transwell assay for 48 h incubation; B:STC2-overexpressing and control cells were subjected to Transwell assay for 24 h incubation； C: RT-qPCR was used to test the effect of STC2 on EMT process inSTC2-overexpressing and control cells； D: RT-qPCR was used to test the effect of STC2 on EMT process inSTC2-silencing and control cells; E: Western blot assay was served to identify the protein expression of E-cadherin and vimentin inSTC2-overexpressing and control cells； F: Western blot assay was served to identify the protein expression of E-cadherin and vimentin inSTC2-silencing and control cells. The bands were semi-quantified with densitometry. The relative expression levels of indicated proteins were norma-lized to GAPDH. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHepG2；##P<0.01vsHepG2/shCon.

圖4 STC2影響肝癌細胞HepG2的遷移能力并參與其EMT進程

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

STC2 promotes proliferation and EMT-related migration of HepG2 cells

CAO Lei1, LI Lei1, HU Ming-zhu1, ZHANG Yi-mei1, LUO Hai-hua1, HU Shui-wang1, LIU Ai-hua2, JIANG Yong1

(1DepartmentofPathophysiology,KeyLaboratoryofProteomicsofGuangdongProvince,2DepartmentofRespiratoryDisease,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity，Guangzhou510515,China.E-mail:jiang48231@163.com)

AIM: To explore the effects of stanniocalcin 2 (STC2) on the proliferation, migration and the process of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human hepatocellular carcinoma HepG2 cells. METHODS: The expression levels of STC2 in the hepatocellular carcinoma cell lines and normal liver cells were assessed by Western blot. Colony formation assay was used to test the effect of STC2 on the proliferation of HepG2 cells. The effects of STC2 on the expression of proliferation-related molecules at mRNA and protein levels were determined by RT-qPCR and Western blot. The effect of STC2 on the migration ability was measured by Transwell assay. The mRNA and protein levels of vimentin and E-cadherin inSTC2-overexpressing and -silencing cell lines were detected by RT-qPCR and Western blot. RESULTS: Compared with the normal liver cell line, the protein expression of STC2 was up-regulated in the hepatocellular carcinoma cell lines. The results of colony formation assay indicated that STC2 promoted the proliferation of HepG2 cells. STC2 significantly regulated the proliferation-related gene expression, such as cyclin D1. The results of Transwell assay showed that STC2 enhanced the migration ability of the HepG2 cells and influenced the EMT process.CONCLUSION: STC2 promotes the proliferation of HepG2 cells and affects the expression of proliferation-related genes. STC2 influences the process of EMT and promotes the migration of HepG2 cells.

Hepatocellular carcinoma; Stanniocalcin 2; Epithelial-mesenchymal transition; Cell migration

1000- 4718(2017)06- 1000- 06

2017- 01- 13

2017- 04- 18

國家自然科學(xué)基金資助項目 (No. 81372030)； 廣州市科技計劃項目(No. 201607020016)； 南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院院長基金(No. 2015Z005)

R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.007

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