從脊柱內(nèi)鏡手術(shù)摘除組織中分離髓核間充質(zhì)干細(xì)胞及其生物學(xué)特征鑒定*

尚玉攀， 吳 昊， 曾曉麗, 鄭力恒， 余 俊， 肖黔龍， 屠 美, 張嘉晴△

(暨南大學(xué) 1附屬第一醫(yī)院骨科， 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系， 3理工學(xué)院生物材料系， 廣東 廣州 510632； 4仁伯爵綜合醫(yī)院， 澳門醫(yī)學(xué)科技研究協(xié)會(huì)， 中國(guó) 澳門 999078)

從脊柱內(nèi)鏡手術(shù)摘除組織中分離髓核間充質(zhì)干細(xì)胞及其生物學(xué)特征鑒定*

尚玉攀2， 吳 昊1， 曾曉麗2, 鄭力恒4， 余 俊2， 肖黔龍2， 屠 美3, 張嘉晴2△

(暨南大學(xué)1附屬第一醫(yī)院骨科，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，3理工學(xué)院生物材料系， 廣東 廣州 510632；4仁伯爵綜合醫(yī)院， 澳門醫(yī)學(xué)科技研究協(xié)會(huì)， 中國(guó) 澳門 999078)

目的： 利用經(jīng)皮內(nèi)鏡下腰椎間盤切除術(shù)獲取來(lái)源明確的髓核組織，結(jié)合組織塊培養(yǎng)法高效分離培養(yǎng)人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells，hNP-MSCs), 并鑒定其生物學(xué)特征。方法: 收集6例腰間盤突出癥手術(shù)摘除的髓核組織，利用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)。取第3～6代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，采用CCK-8檢測(cè)增殖能力；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物；并分別向成骨、成脂和成軟骨方向誘導(dǎo)分化，用油紅O染色、茜素紅染色及阿利新藍(lán)染色對(duì)分化結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果: 成功從椎間盤內(nèi)鏡摘除的髓核組織中分離培養(yǎng)具有增殖能力的細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示細(xì)胞高表達(dá)CD29、CD44、CD90、CD73和CD105等間充質(zhì)干細(xì)胞抗原，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD45。生長(zhǎng)曲線顯示符合正常間充質(zhì)干細(xì)胞增殖特征。茜素紅染色、阿利新藍(lán)染色及油紅O染色均呈陽(yáng)性，說(shuō)明分離培養(yǎng)的細(xì)胞具有向成骨、成軟骨和成脂肪誘導(dǎo)分化的能力。結(jié)論: 首次結(jié)合椎間盤內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)和組織塊培養(yǎng)法，體外高效分離培養(yǎng)了具有自我更新能力和多向分化潛能的hNP-MSCs。

經(jīng)皮內(nèi)鏡下腰椎間盤切除術(shù)； 組織塊培養(yǎng)法； 人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞

近年來(lái)，椎間盤退變及其引起的下腰痛發(fā)病率逐年升高，已成為45歲以下的人群失去勞動(dòng)力或勞動(dòng)力下降的主要原因之一，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)[1]。目前治療椎間盤退變的方法僅只能暫時(shí)減輕或緩解疼痛癥狀，并不能從根本上逆轉(zhuǎn)椎間盤退變的病理過(guò)程，還有加重病情的風(fēng)險(xiǎn)[2]。以間充質(zhì)干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程技術(shù)為退變椎間盤進(jìn)行再生和修復(fù)帶來(lái)了新的希望，成為目前最有潛力的治療途徑[3-5]。然而，對(duì)人類椎間盤髓核干細(xì)胞缺乏足夠了解，是阻礙這一技術(shù)發(fā)展的主要原因。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，椎間盤髓核組織內(nèi)存在一種可貼壁生長(zhǎng)、表達(dá)一系列間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物、可三系誘導(dǎo)分化的細(xì)胞。該細(xì)胞滿足國(guó)際細(xì)胞治療學(xué)會(huì)(International Society for Cellular Therapy，ISCT)提出的間充質(zhì)干細(xì)胞判定準(zhǔn)則[6]，被命名為人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞(human nucleus pulposus mesenchymal stem cells，hNP-MSCs)。由于人類髓核組織獲取來(lái)源極其有限，目前NP-MSCs的研究數(shù)據(jù)主要來(lái)自于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[7-9]，但是動(dòng)物數(shù)據(jù)的翻譯解釋對(duì)應(yīng)到人類細(xì)胞研究有其不可克服的局限性。

目前絕大多數(shù)文獻(xiàn)采用酶消化法分離脊柱開(kāi)放手術(shù)摘除組織來(lái)獲取hNP-MSCs。由于開(kāi)放手術(shù)難以對(duì)髓核和其它組織進(jìn)行精細(xì)分離，摘除組織往往夾雜有髓核周圍的纖維軟骨組織或韌帶組織，造成細(xì)胞來(lái)源混雜。酶消化法單獨(dú)采用Ⅱ型膠原酶或結(jié)合Ⅰ型膠原酶將手術(shù)摘取組織置于37 ℃下消化5 h 左右[10-11]，存在著步驟繁瑣、失敗率高、費(fèi)用昂貴等缺陷[12]。而分離間充質(zhì)干細(xì)胞有另一種方法，即組織塊培養(yǎng)法[13-14]。相比酶消化法，組織塊培養(yǎng)法操作時(shí)間較短且步驟更簡(jiǎn)便[15]。然而目前尚未見(jiàn)運(yùn)用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的報(bào)道。鑒于酶消化法分離hNP-MSCs的方法成功率低，細(xì)胞數(shù)量少，細(xì)胞活性受影響，已嚴(yán)重制約hNP-MSCs研究發(fā)展，本研究首次結(jié)合椎間盤內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)和組織塊培養(yǎng)法，探索新型高效體外分離培養(yǎng)hNP-MSCs的方法并對(duì)獲取細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特征鑒定，為促進(jìn)椎間盤退變的細(xì)胞治療提供新的實(shí)驗(yàn)方法和理論基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1 人髓核組織的獲取

標(biāo)本來(lái)源于暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科收治的6例L4/5～L5S1腰椎間盤突出癥患者，年齡19～49歲，手術(shù)方式為經(jīng)皮內(nèi)鏡下腰椎間盤切除術(shù)。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)同意，患者均簽署知情同意書。

2 主要儀器試劑

DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清(Gibco)；胰蛋白酶(Sigma)；CCK-8(Kumamoto)；青霉素和鏈霉素(HyClone)；人MSCs 成骨誘導(dǎo)試劑盒、成軟骨誘導(dǎo)試劑盒、成脂誘導(dǎo)試劑盒(Cyagen)；酶標(biāo)儀(Lecia)；L-谷氨酰胺(Sigma)。

3 組織塊培養(yǎng)法分離獲取NP-MSCs

無(wú)菌條件下用 PBS 清洗人髓核組織3遍，齒鑷及眼科剪將髓核組織剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小，然后使用吸管將組織塊逐一種植入預(yù)先用含20%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基浸泡過(guò)的T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，密度大概為20～25塊/瓶。放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3 h后，待組織塊完全貼到培養(yǎng)瓶上，加入2 mL含20%胎牛血清、1%谷氨酰胺、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，此后每隔2天換液1次。觀察貼壁組織周圍的細(xì)胞生長(zhǎng)情況，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合度時(shí)，用胰蛋白酶消化傳代。

4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

hNP-MSCs按照5×104/cm2接種于6孔板，培養(yǎng)后每日用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長(zhǎng)狀況并拍照。

5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面因子

取第3代長(zhǎng)勢(shì)良好的NP-MSCs，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合時(shí)收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L保存在1.5 mL的EP管中；每管中分別加入相應(yīng)hNP-MSCs表面因子 CD29、CD44、CD90、CD73、CD105、CD34和CD45的抗體各10 μL，室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，CellQuest軟件分析結(jié)果。

6 hNP-MSCs增殖能力的檢測(cè)

取第3代的hNP-MSCs，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞懸液密度，按照每孔4×104細(xì)胞、500 μL培養(yǎng)基接種于24孔板，每組3個(gè)復(fù)孔。以不含細(xì)胞的培養(yǎng)液為空白對(duì)照。將24孔板放置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育培養(yǎng)，分別于接種后1、3、5、7、9、11和13 d檢測(cè)細(xì)胞的增殖情況。每到一個(gè)時(shí)點(diǎn)，抽出一個(gè)橫向試驗(yàn)，向每孔小心加入50 μL CCK-8溶液，孵育2 h后用檢測(cè)波長(zhǎng)為450 nm的酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(A)值，繪制細(xì)胞增殖曲線。

7 hNP-MSCs的三系分化

7.1 成脂誘導(dǎo)分化 取第3代的hNP-MSCs細(xì)胞，用0.25%的胰蛋白酶消化以后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L均勻接種于6孔板中，用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng),直至細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到95%融合，將培養(yǎng)液更換成成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)液。成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中添加0.5 mmol/L地塞米松、10 μmol/L胰島素和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤。每隔2 d更換1次成脂誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)3周后進(jìn)行油紅O染色[16]，并進(jìn)行拍照保存。

7.2 成骨誘導(dǎo)分化 取第3代的hNP-MSCs，0.25%的胰蛋白酶消化以后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L均勻接種于6孔板中，用含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)至70%融合后，將培養(yǎng)液更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的低糖DMEM培養(yǎng)基，并添加10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L維生素C。對(duì)照組中添加常規(guī)培養(yǎng)基。每隔2 d更換1次成骨誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后用茜素紅S進(jìn)行染色[16]，并拍照保存。

7.3 成軟骨誘導(dǎo)分化 取第3代的hNP-MSCs，0.25%的胰蛋白酶消化以后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×109/L 均勻接種于6孔板中，用含10%特級(jí)胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)培養(yǎng)至 90%以上融合后，將培養(yǎng)液更換為成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)液。成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：含10%胎牛血清、1%谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基添加0.1 μmol /L地塞米松、10 μg/L TGF-β1、6.25 mg/L轉(zhuǎn)鐵蛋白、6.25 mg/L胰島素和50 mg/L維生素C。對(duì)照組中添加常規(guī)培養(yǎng)基。每隔2 d更換1次成軟骨誘導(dǎo)液。誘導(dǎo)培養(yǎng)3周后用阿利新藍(lán)進(jìn)行染色，并拍照保存。

結(jié) 果

1 人髓核組織標(biāo)本大體情況

本實(shí)驗(yàn)6例患者均順利完成椎間盤內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)摘取退變髓核組織，由于手術(shù)視野無(wú)出血，組織辨別清晰，利用生理鹽水使標(biāo)本基本保持原本的形態(tài)和理化特性。術(shù)中將取出的標(biāo)本分為髓核組織、纖維環(huán)組織和韌帶組織。髓核組織為白色粘彈性物質(zhì)，退變的髓核組織呈破棉花絮狀，正常的髓核組織呈膠凍狀，較年輕患者膠凍狀態(tài)更加明顯。纖維環(huán)組織和韌帶組織鏡下可辨別，質(zhì)地較韌，不予保留。每例患者均取到髓核組織有20～40 g，見(jiàn)圖1。

Figure 1.Percutaneous endoscopic lumbar discectomy removal of nucleus pulposus tissues.

圖1 從脊柱內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)摘除的髓核組織

2 人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性

經(jīng)光學(xué)倒置顯微鏡觀察，組織塊接種7 d后，組織塊周圍可見(jiàn)零星的一些細(xì)胞游出，形態(tài)多為梭形。10～12 d，有更多的細(xì)胞從組織塊中游出，細(xì)胞大小較均一，形態(tài)多為典型的長(zhǎng)梭形，少數(shù)為多角形，向四周呈單層貼壁生長(zhǎng)。15 d后，去除組織塊，細(xì)胞達(dá)到90%左右的融合。細(xì)胞傳至第3代時(shí)，形態(tài)變?yōu)榫坏乃笮?，均呈現(xiàn)紡錘樣長(zhǎng)梭形，見(jiàn)圖2。

Figure 2.Morphology of human nucleus pulposus mesenchymal stem cells (×100)．A， B: passage 0; C: passage 3.

圖2 不同代的人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)

3 人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)至第三代的hNP-MSCs表面因子 CD29、CD44、CD90、CD73和CD105呈陽(yáng)性表達(dá)，其陽(yáng)性率分別是100%、100%、100%、99.96%和99.99%；而CD34和CD45呈陰性表達(dá)，其陽(yáng)性率分別為0.55%和0.46%，見(jiàn)圖3。

Figure 3.The flow cytometry results of cell surface markers on hNPMSCs at passage 3．

圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) hNP-MSCs 表面因子表達(dá)

4 細(xì)胞增殖能力

由生長(zhǎng)曲線可知，細(xì)胞傳代后前5 d增殖不是很明顯，5～7 d進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，8～13 d開(kāi)始增殖緩慢。正常細(xì)胞量傳代后，4～5 d即可傳代1次，而本實(shí)驗(yàn)做細(xì)胞增殖能力檢測(cè)時(shí)，為更準(zhǔn)確觀察細(xì)胞增殖過(guò)程，細(xì)胞種植密度低，13 d后進(jìn)入平臺(tái)期，見(jiàn)圖4。

Figure 4.Growth curve detection of passage 3 human nucleus pulposus mesenchymal stem cells

圖4 第3代人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線

5 成脂誘導(dǎo)分化情況

hNP-MSCs用成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞慢慢開(kāi)始形變，細(xì)胞內(nèi)部出現(xiàn)微小的脂滴，肉眼可見(jiàn)，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)的脂滴越來(lái)越多，越來(lái)越大。此時(shí)，形變成脂肪細(xì)胞的數(shù)目也隨之增多，誘導(dǎo)3周后，油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量的紅染顆粒，見(jiàn)圖5A。

6 成骨誘導(dǎo)分化情況

在更換成骨誘導(dǎo)液1周左右，普通倒置顯微鏡下可以觀察到部分細(xì)胞發(fā)生了形變，呈圓形狀大概誘導(dǎo)至第10天左右，會(huì)出現(xiàn)絮狀物沉積在細(xì)胞表面，隨著成骨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，沉積物質(zhì)越來(lái)越多，誘導(dǎo)3周后對(duì)細(xì)胞進(jìn)行茜素紅S染色鑒定并拍照，結(jié)果見(jiàn)圖5B。

7 成軟骨誘導(dǎo)分化情況

在更換成軟骨誘導(dǎo)液21 d后，阿利新藍(lán)染色結(jié)果顯示，hNP-MSCs成軟骨誘導(dǎo)后，染色呈強(qiáng)陽(yáng)性，細(xì)胞外基質(zhì)被染成藍(lán)色，見(jiàn)圖5C。

討 論

本研究獲取6例行脊柱內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)的髓核組織，通過(guò)組織塊貼壁培養(yǎng)，5～7 d可在光鏡下觀察到細(xì)胞從組織塊中移行出來(lái)，形態(tài)多為長(zhǎng)梭形。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞特異性表面抗原 CD29、CD44、CD90、CD73和CD105(皆高于99%)，不表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志CD34和CD45(<1%)，根據(jù)ISCT標(biāo)準(zhǔn)，完全符合間充質(zhì)干細(xì)胞的特征[6]。CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示第3代人髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈典型的S形，符合干細(xì)胞的生長(zhǎng)規(guī)律[17]，且具有較好的增殖能力。進(jìn)一步對(duì)多向分化潛能檢測(cè)，結(jié)果表明成脂誘導(dǎo)3周時(shí)油紅O染色，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大量的紅染顆粒，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞能夠向脂肪細(xì)胞分化。這與之前認(rèn)為hNP-MSCs不能分化為脂肪細(xì)胞的報(bào)道截然不同[18]。此外，成骨與成軟骨誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞能夠向成骨及成軟骨細(xì)胞方向分化。說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)分離出的hNP-MSCs具有較高的多向分化潛能。

Figure 5.Multilineage differentiation of hNP-MSCs. A: oil red O staining after adipogenic induction (×200)； B: alizarin red staining after osteogenic induction (×100)； C: alcian blue staining after chondrogenic induction (×200).

圖5 第3代hNP-MSCs的成脂、成骨和成軟骨分化

本研究首次將組織塊培養(yǎng)法結(jié)合脊柱內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)獲取髓核組織，運(yùn)用到hNP-MSCs分離培養(yǎng)研究中，獲得了具有間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)的、可持續(xù)擴(kuò)增的髓核來(lái)源的細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分析和多向分化潛能鑒定，所分離細(xì)胞符合國(guó)際間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)。而且不使用消化酶，細(xì)胞狀態(tài)更好。本研究所用的方法大大減少了實(shí)驗(yàn)操作步驟，將實(shí)驗(yàn)時(shí)間從5 h縮短到1 h，同時(shí)降低了難度。節(jié)約了成本，且收獲的原代細(xì)胞產(chǎn)量較酶消化法更多，能夠很好地保持髓核間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性。更重要的是，本研究首次探索利用脊柱內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)獲取髓核組織，通過(guò)高分辨率的視鏡系統(tǒng)對(duì)組織準(zhǔn)確分離，精確去除纖維環(huán)軟骨和韌帶組織，克服了開(kāi)放手術(shù)來(lái)源的標(biāo)本混雜其它組織的缺陷，有利于細(xì)胞純化。此外，研究發(fā)現(xiàn)hNP-MSCs的生物活性可能與髓核組織退變程度密切相關(guān)[19]。本研究可通過(guò)微創(chuàng)手術(shù)高分辯內(nèi)鏡系統(tǒng)對(duì)髓核組織進(jìn)行在體觀察，結(jié)合術(shù)前影像學(xué)更準(zhǔn)確地評(píng)估椎間盤退變的程度，為研究hNP-MSCs活性與椎間盤退變程度之間的關(guān)系提供更可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

總之，本研究首次將組織塊培養(yǎng)法結(jié)合脊柱內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)獲取髓核組織，運(yùn)用到hNP-MSCs分離培養(yǎng)研究中，為基于hNP-MSCs的再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究提供新的實(shí)驗(yàn)方法和理論基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Isolation and identification of nucleus pulposus mesenchymal stem cells from tissues removed by percutaneous endoscopic lumbar discectomy

SHANG Yu-pan2, WU Hao1, ZENG Xiao-li2, CHEANG Lek-hang4, YU Jun2, XIAO Qian-long2, TU Mei3, ZHANG Jia-qing2△

(1DepartmentofOrthopedics,TheFirstAffiliatedHospital，2DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,SchoolofBasicMedicine，3DepartmentofBiologicalMaterial,CollegeofScienceandEngineering，JinanUniversity,Guangzhou510632,China;4CentroHospitalarCondedeS?oJanuário,MacauMedicalScience&TechnologyResearchAssociation，Macau999078,China.E-mail:zhangjiaqing@jnu.edu.cn)

AIM: To explore a novel method to isolate human nucleus pulposus mesenchymal stem cells (hNP-MSCs)invitroand to identify their biological characteristics. METHODS: The explant culture method was employed to isolate hNP-MSCs from nucleus pulposus tissue obtained by percutaneous endoscopic lumbar discectomy (PELD). The isolated cells were passaged for purification and culturedinvitrofollowed by morphological observation. The cell proliferation ability was detected by CCK-8 assay. Growth curves of the cells were drawn and surface antigens were detected by flow cytometry. The cells at the 3rd～6th passages were induced for adipogenic, osteogenic and chondrogenic differentiation, and examined by oil red O staining, alizarin red staining and Alcian blue staining. RESULTS: The cells with self-renewal were obtained from nucleus pulposus tissue obtained by PELD. The results of flow cytometry analysis revealed that the cells were positive for CD29, CD44, CD90, CD73 and CD105, but negative for CD34 and CD45. The proliferative capacity was consistent with the growth characteristics of MSCs and multilineage differentiation potential was identified. CONCLUSION: A novel method to efficiently isolate and culture hNP-MSCs， PELD combined with explant culture method， was established, which would promote the study of regenerative medicine based on hNP-MSCs.

Percutaneous endoscopic lumbar discectomy; Explant culture method; Human nucleus pulposus mesenchymal stem cells

1000- 4718(2017)06- 1147- 06

2016- 11- 15

2017- 03- 28

中央高?；究蒲谢?No. 21615436)；廣東科技項(xiàng)目基金(No. 2016B090913004)；廣東科技項(xiàng)目基金(No. 201508020035)；暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院科研培育專業(yè)基金項(xiàng)目(No. 511005024)

R616.5； R361

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.032

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△通訊作者 Tel: 020-85220256; E-mail: zhangjiaqing@jnu.edu.cn