Caveolin-1在TGF-β1誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞間質(zhì)化中的作用*

鐘長江， 李建華， 岳喜磊， 許繼德△， 楊春濤， 鄧?yán)蜴?/p>

(1廣州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，廣東 廣州 511436； 2廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院，廣東 廣州 510800； 3黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000)

Caveolin-1在TGF-β1誘導(dǎo)人支氣管上皮細(xì)胞間質(zhì)化中的作用*

鐘長江2， 李建華1， 岳喜磊3， 許繼德1△， 楊春濤1， 鄧?yán)蜴?

(1廣州醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室，廣東 廣州 511436；2廣州市花都區(qū)人民醫(yī)院，廣東 廣州 510800；3黃石市中心醫(yī)院，湖北 黃石 435000)

目的： 探究小窩蛋白1(caveolin-1)在轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE細(xì)胞)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)中的作用。方法: 以16HBE細(xì)胞株為研究對象，免疫熒光、RT-qPCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測16HBE細(xì)胞EMT過程中caveolin-1的mRNA和蛋白表達(dá)；Western blot檢測siRNA干擾caveolin-1對16HBE細(xì)胞EMT的影響。結(jié)果: Caveolin-1廣泛存在于16HBE細(xì)胞膜上，TGF-β1刺激后，caveolin-1的mRNA和蛋白表達(dá)減少(P<0.05)。與TGF-β1組比較，caveolin-1 siRNA和TGF-β1共同作用促進(jìn)了細(xì)胞形態(tài)的轉(zhuǎn)化，抑制了E-鈣黏蛋白的蛋白表達(dá)而促進(jìn)了α-SMA的蛋白表達(dá)(P<0.05)。TGF-β1刺激16HBE細(xì)胞后，AKT和Smad3在30 min磷酸化水平最高，與0 min對照組比較顯著增加(P<0.05)；用siRNA干擾caveolin-1基因后再用TGF-β1刺激16HBE細(xì)胞30 min，下游信號蛋白分子AKT和Smad3的磷酸化水平增高，與TGF-β1組比較顯著增加(P<0.05)。結(jié)論: TGF-β1 能下調(diào) 16HBE 細(xì)胞的caveolin-1表達(dá)水平； caveolin-1可能參與了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE 細(xì)胞EMT過程中TGF-β1/Smad通路和PI3K-AKT通路的活化。

轉(zhuǎn)化生長因子β1； 人支氣管上皮細(xì)胞； 上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化； 小窩蛋白1； 氣道重塑

支氣管哮喘是由包括支氣管上皮細(xì)胞等細(xì)胞和細(xì)胞組份參與的呼吸系統(tǒng)常見慢性多發(fā)病。氣道上皮細(xì)胞脫落、胞間黏附結(jié)構(gòu)喪失和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是哮喘氣道重塑的重要特征。EMT主要表現(xiàn)為上皮細(xì)胞極性喪失，上皮表型標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，胞間及細(xì)胞-基質(zhì)間的黏附性喪失，并且獲得間充質(zhì)細(xì)胞的特性如細(xì)胞獲得遷移能力和表型標(biāo)志物α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表達(dá)增多等。轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、存活、分化和轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)化生長因子，參與組織的纖維化、自身免疫性疾病和腫瘤的形成。研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT，如使I型肺泡上皮細(xì)胞、眼晶狀體上皮細(xì)胞等多種上皮細(xì)胞向間質(zhì)肌纖維母細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，促進(jìn)組織纖維化的發(fā)展[1]。TGF-β1調(diào)節(jié)EMT發(fā)生的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要為Smad 通路、非 Smad 通路、磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB，即AKT)通路等信號調(diào)節(jié)通路[2]。小窩是細(xì)胞表面大小50～100 nm的向細(xì)胞膜內(nèi)凹陷的微區(qū)域，小窩上富含如小窩蛋白1(ca-veolin-1，Cav-1)、TGF-β受體、瞬時受體電位通道和絲裂原激活蛋白激酶激酶1/2(mitogen-activated protein kinase kinase 1/2，MEK1/2)等信號傳導(dǎo)分子[3]。Cav-1是小窩的主要組成部分，參與調(diào)節(jié)許多信號傳導(dǎo)和生化過程，并能在許多膜啟動信號級聯(lián)中起著負(fù)性調(diào)控作用。但在目前未見caveolin-1參與TGF-β1誘導(dǎo)的氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT過程及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的報道。本實(shí)驗(yàn)研究caveolin-1是否參與TGF-β1誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞EMT發(fā)生和有關(guān)機(jī)制，為哮喘預(yù)防和臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細(xì)胞系 人支氣管上皮細(xì)胞系16HBE由廣州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究中心保存和復(fù)蘇。

1.2 主要試劑 胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI-1640培養(yǎng)基購自Gibco；rhTGF-β1購自R&D；牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)和抗E-鈣黏蛋白、p-AKT、AKT、Smad3、p-Smad3、GAPDH多克隆抗體購自CST；兔抗人caveolin-1多克隆抗體購自Bioworld；抗α-SMA多克隆抗體購自Abcam；抗β-actin抗體和ECL試劑盒購自杭州聯(lián)科生物科技有限公司；PrimeScriptTMRT Master Mix Kit 和 SYBR?Premix Ex TaqTMPerfect Real Time 試劑盒購自 TaKaRa；Cav-1基因的siRNA序列由上海吉瑪公司合成，正義鏈為5’-GCGACCCUAAACCUCAATT-3’，反義鏈為5’-UUGAGGUGUUUAGGGUCGCTT-3’。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 含10% FBS的1640培養(yǎng)基體外培養(yǎng)16HBE細(xì)胞，置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.2 間接免疫熒光法檢測caveolin-1在16HBE 細(xì)胞上的表達(dá) 將各組細(xì)胞用 含10% FBS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng) 48 h 后，4% 多聚甲醛溶液固定，室溫下 0.3% Triton X-100 通透，5% BSA 37 ℃封閉 30 min 后分別加入稀釋比例為 1∶100 兔抗人caveolin-1的I 抗100 μL，以 PBS 為對照，4 ℃孵育過夜。次日，于 37 ℃復(fù)溫 30 min，分別加入稀釋比例為 1∶ 100 的 FITC 標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗 100 μL，37 ℃避光孵育 1 h，DAPI 溶液室溫孵育 5～10 min，熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2.3 Real-time PCR 和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測caveolin-1的mRNA和蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組為: FBS(1%) 對照組和10 μg/L TGF-β1組。細(xì)胞分組培養(yǎng) 24 h、48 h 和 72 h 后按Trizol 法提取總RNA，按照PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time)試劑盒說明書操作，合成cDNA。Caveolin-1的上游引物序列為5’-AACCTTGGGGGATGTGCCTAGA-3’， 下游引物序列為5’-CCGCCAAAGGTTTGTTCGC-3’。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件為： 37 ℃ 15 min， 85 ℃ 5 s。然后再按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡPerfect Real Time試劑盒說明書在ABI7500熒光定量PCR儀中進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 30 s； 95 ℃ 5 s， 60 ℃ 34 s，重復(fù)循環(huán)40次；熔解曲線分析95 ℃ 15 s； 60 ℃ 1 min， 95 ℃ 15 s。以18S為內(nèi)參照，以2-ΔΔCt法計算各組caveolin-1的mRNA相對表達(dá)量。

相同分組細(xì)胞處理24 h、48 h 和 72 h后按細(xì)胞裂解液(RIPA) 說明書提取細(xì)胞蛋白。提取蛋白定量后加入SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液，煮沸變性；選用5% 濃縮膠，12% 分離膠進(jìn)行電泳，分別用80 V和100 V電壓。然后在200 mA恒流、4 ℃條件下電轉(zhuǎn)2 h；5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；TBST洗膜 10 min×3次；分別孵育1∶3 000的兔抗人caveolin-1的 I 抗及1∶2 000小鼠β-actin單克隆抗體，4 ℃孵育過夜。TBST 洗膜10 min×3次；再室溫分別孵育與其Ⅰ抗相對應(yīng)的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG及HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG 1 h；TBST 洗膜10 min×3次；加入ECL反應(yīng)，用凝膠成像系統(tǒng)曝光成像，并用ImageJ軟件對所得到的條帶進(jìn)行分析。以β-actin為內(nèi)參照，分析各組caveolin-1的相對含量。

2.4 倒置顯微鏡和 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測siRNA 轉(zhuǎn)染對 EMT 的影響 第 3 代細(xì)胞接種于 6 孔板中，用含10% FBS 的1640培養(yǎng)基培養(yǎng) 12～18 h，細(xì)胞密度 30%～50% 時，再分為轉(zhuǎn)染試劑(mock transfection)對照組、mock transfection+caveolin-1 siRNA組、 TGF-β1 (10 μg/L)組、 TGF-β1+mock transfection+caveolin-1 siRNA組、mock transfection+negative siRNA陰性對照組、TGF-β1+mock transfection + negative siRNA組和GAPDH siRNA+mock transfection 陽性對照組。按轉(zhuǎn)染試劑盒說明書操作進(jìn)行轉(zhuǎn)染 48 h 后，提取細(xì)胞總 RNA，RT-qPCR 檢測各組細(xì)胞中 mRNA 的表達(dá)情況，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染組 mRNA 抑制率達(dá) 80% 左右，合成的 siRNA 序列有效。接種第 3 代細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)分為對照(control)組、siRNA-caveolin-1組、TGF-β1 (10 μg/L)組和caveolin-1 siRNA+TGF-β1 組，處理 48 h后在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并提取細(xì)胞蛋白，Western blot實(shí)驗(yàn)分析各組 E-鈣黏蛋白以及 α-SMA 蛋白的相對含量。

2.5 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β1刺激對16HBE細(xì)胞中磷酸化蛋白的水平 實(shí)驗(yàn)分組同上，取第3代細(xì)胞用TGF-β1 (10 μg/L)作用細(xì)胞0 min、15 min、30 min和60 min后立即收集細(xì)胞提取蛋白，分別檢測AKT和Smad3的磷酸化水平，根據(jù)前面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以TGF-β1刺激以后信號蛋白磷酸化最高的時間點(diǎn)作為觀察點(diǎn)，分別檢測AKT和Smad3的磷酸化水平，各使用Ⅰ抗比例為1∶1 000孵育，以GAPDH為內(nèi)參照，分析各組蛋白的相對含量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，計量資料間的比較在確定方差齊性后采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，如果方差不齊則采用 Welch 法，組間多重比較采用 Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Caveolin-1在16HBE細(xì)胞中的表達(dá)

免疫熒光檢測結(jié)果示，caveolin-1主要存在于16HBE細(xì)胞膜上，見圖1。實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果示，TGF-β1 (10 μg/L) 刺激細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，與對照組比較caveolin-1 mRNA的表達(dá)明顯減少(P<0.05)，且減少的程度具有時間依賴性，見圖2。

2 Caveolin-1 蛋白在16HBE細(xì)胞中的表達(dá)

Western blot法檢測結(jié)果示，與對照組比較，TGF-β1刺激24 h、48 h和72 h后，caveolin-1蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05)，且減少程度具呈時間依賴性，見圖3。

Figure 1.Immunofluorescence staining for Cav-1 (×200). Cav-1 expression in the 16HBE cells was positive.

圖1 Caveolin-1在16HBE細(xì)胞的定位

Figure 2.The mRNA expression of Cav-1 in 16HBE cells. 16HBE cells were treated with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h. The relative mRNA expression level of Cav-1 was normalized to 18S mRNA in the same sample. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group.

圖2 16HBE細(xì)胞中caveolin-1的mRNA表達(dá)

Figure 3.The protein expression of Cav-1 in the 16HBE cells. The 16HBE cells were treated with TGF-β1 for 24 h, 48 h and 72 h. The relative protein expression level of Cav-1 was normalized to β-actin protein in the same sample. Mean±SD.n=4.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 16HBE細(xì)胞中caveolin-1蛋白的表達(dá)

3 siRNA沉默Cav-1基因抑制TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞的形態(tài)改變

倒置顯微鏡下可見正常16HBE細(xì)胞培養(yǎng)48 h后呈貼壁生長，胞間連接緊密，長滿后呈鋪路石樣分布。siRNA沉默Cav-1基因48 h后，部分細(xì)胞伸長變細(xì)，細(xì)胞胞間隙增大。TGF-β1 刺激細(xì)胞48 h 后，細(xì)胞變細(xì)伸長呈梭形，細(xì)胞間隙增大，喪失鋪路石樣特征。用siRNA沉默Cav-1基因24 h再加入TGF-β1刺激細(xì)胞48 h，促進(jìn)了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞形態(tài)改變，見圖4。

Figure 4.The effect ofCav-1 silencing on the morphologic changes of 16HBE cells induced by TGF-β1 (×100). A: the 16HBE cells cultured for 48 h showed a pebble-like shape and clear cell-cell adhesion; B: the 16HBE cells treated withCav-1 siRNA for 48 h showed a pebble-like shape and loss cell-cell adhesion; C: the 16HBE cells treated with TGF-β1 for 48 h showed a decrease in cell-cell contacts and a morphologic shape; D: the 16HBE cells treated withCav-1 siRNA for 24 h and then TGF-β1 for 48 h showed the morphologic changes of the 16HBE cells induced by TGF-β1 was promoted.

圖4 siRNA沉默Cav-1基因促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的形態(tài)改變

4 siRNA沉默Cav-1基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞E-鈣黏蛋白和α-SMA mRNA表達(dá)的影響

實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果示，用siRNA沉默Cav-1基因24 h再用TGF-β1刺激細(xì)胞48 h，與單純TGF-β1組比較， E-鈣黏蛋白的mRNA表達(dá)量顯著減少(P<0.05)，但α-SMA的mRNA表達(dá)量顯著增加(P< 0.05)，見圖5、6。

5 siRNA沉默Cav-1基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞E-鈣黏蛋白和α-SMA 蛋白表達(dá)的影響

Western blot法檢測結(jié)果示，與單純TGF-β1組相比，用siRNA沉默Cav-1基因24 h再用TGF-β1刺激細(xì)胞48 h， E-鈣黏蛋白表達(dá)量顯著減少(P<0.05)，而α-SMA蛋白的表達(dá)量則顯著增加(P<0.05)，見圖7、8。

Figure 5.The effectt ofCav-1 silencing on the mRNA expression of E-cadherin induced by TGF-β1. The relative mRNA expression level of E-cadherin was normalized to 18S mRNA in the same sample. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖5 siRNA沉默Cav-1基因促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)16HBE E-鈣黏蛋白mRNA表達(dá)的減少

Figure 6.The effect ofCav-1 silencing on the α-SMA mRNA expression induced by TGF-β1. The relative mRNA expression level of α-SMA was normalized to 18S mRNA in the same sample. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖6 siRNA沉默Cav-1基因促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)16HBE α-SMA mRNA表達(dá)的增加

Figure 7.The effect ofCav-1 silencing on the E-cadherin protein expression induced by TGF-β1. The relative protein expression level of E-cadherin was normalized to GAPDH in the same sample. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖7 siRNA沉默Cav-1基因促進(jìn)了TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞E-鈣黏蛋白表達(dá)的減少

Figure 8.The effect ofCav-1 silencing on the α-SMA protein expression induced by TGF-β1. The relative protein expression level of α-SMA was normalized to GAPDH in the same sample. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖8 siRNA沉默Cav-1基因促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞α-SMA蛋白表達(dá)的增加

6 siRNA沉默Cav-1基因?qū)GF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞AKT和Smad3磷酸化水平的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示，在TGF-β1(10 μg/L)刺激16HBE細(xì)胞0 min、15 min、30 min和60 min后，下游信號蛋白分子AKT和Smad3在15 min、30 min和60 min均發(fā)生磷酸化，以30 min時磷酸化水平最高，與0 min對照組比較顯著增加(P<0.05)，見圖9、10。用siRNA沉默Cav-1基因24 h再用TGF-β1刺激16HBE細(xì)胞30 min，下游信號蛋白分子AKT和Smad3的磷酸化水平與TGF-β1組比較顯著增加(P<0.05)，見圖11、12。

Figure 9.The effect of TGF-β1 stimulation on the phosphorylation level of AKT protein in the 16HBE cells at diffe-rent time points. Mean±SD.n=4.**P<0.01vs0 min group.

圖9 TGF-β1在不同時點(diǎn)對AKT蛋白磷酸化水平的影響

討 論

哮喘是當(dāng)今威脅人類健康與生活最主要的慢性疾病之一，預(yù)計到2025年會增至4億，并且發(fā)病率和死亡率逐年升高，給世界各國帶來了沉重的社會和經(jīng)濟(jì)的負(fù)擔(dān)，對人類健康構(gòu)成了嚴(yán)重挑戰(zhàn)。

Figure 10.The effect of TGF-β1 stimulation on the phosphorylation level of Smad3 protein in the 16HBE cells at different time points. Mean±SD.n=4.*P<0.05，**P<0.01vs0 min group.

圖10 TGF-β1在不同時點(diǎn)對Smad3蛋白磷酸化水平的影響

Figure 11.The effect ofCav-1 silencing on the phosphorylation level of AKT protein in the 16HBE cells stimulated with TGF-β1. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖11 siRNA沉默Cav-1基因?qū)GF-β1刺激的16HBE細(xì)胞中AKT 蛋白磷酸化的影響

Figure 12.The effect ofCav-1 silencing on the phosphorylation level of Smad3 protein in the 16HBE cells stimulated with TGF-β1. Mean±SD.n=4.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsTGF-β1 group.

圖12 siRNA沉默Caveolin-1基因?qū)GF-β1刺激的16HBE細(xì)胞中Smad3蛋白磷酸化的影響

支氣管哮喘包括氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重構(gòu)3種主要病理特征性改變。氣道重構(gòu)的主要變化為氣道上皮損傷、脫落、上皮下纖維化和氣道壁網(wǎng)狀基底膜增厚等，從而導(dǎo)致氣道順應(yīng)性下降和肺功能的降低。近年來，大量研究指出，哮喘患者肺功能下降與氣道重塑密切相關(guān)[4]。研究表明氣道上皮細(xì)胞在發(fā)生局部損傷或者缺氧或者生長因子等作用下，上皮細(xì)胞的黏附分子如E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，間質(zhì)細(xì)胞特征性α-SMA表達(dá)增加，即發(fā)生了上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化。EMT是氣道重塑的重要特征。

氣道上皮受到損傷后，受損的上皮細(xì)胞能分泌TGF-β1和EGF等細(xì)胞因子，刺激上皮修復(fù)和上皮下成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的增殖，后2種細(xì)胞亦分泌多種細(xì)胞因子，它們共同作用最終導(dǎo)致氣道重構(gòu)。TGF-β1是一種已知的具有多重功能的轉(zhuǎn)化生長因子，在多種腫瘤細(xì)胞中可以誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[5]。Ward等[6]在肺移植慢性排斥反應(yīng)的閉塞性支氣管炎中發(fā)現(xiàn)EMT發(fā)生在支氣管氣道上皮細(xì)胞中，認(rèn)為氣道損傷與氣道重構(gòu)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中我們用TGF-β1作用于人支氣管上皮細(xì)胞，引致16HBE細(xì)胞失去典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣特征，伸長呈梭形，細(xì)胞間隙增大，胞間E-鈣黏蛋白表達(dá)減少，而α-SMA蛋白表達(dá)增加[7]。

小窩是Georgre palade首次從電鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時稱為“外胞漿囊泡”，小窩蛋白是從小窩中分離的一種分子量為21～25 kD的膜整合蛋白質(zhì)。它包括3 種小窩蛋白家族成員小窩蛋白1、小窩蛋白2和小窩蛋白3。小窩蛋白1和小窩蛋白2存在哺乳動物大部分細(xì)胞中如上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等。小窩蛋白2能和小窩蛋白1形成穩(wěn)定的異源寡聚體復(fù)合物，并通過其相互結(jié)合，從而作為小窩蛋白1的輔助蛋白而發(fā)揮作用。小窩蛋白3特異性的表達(dá)于骨骼肌與心肌中，其表達(dá)異?？赡芘c一些肌肉營養(yǎng)不良癥有關(guān)。小窩蛋白1作為小窩的支架蛋白，在許多細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，并主要位于這些細(xì)胞的胞質(zhì)膜上。如在肺組織的各種細(xì)胞膜上，小窩蛋白1表達(dá)約70%[8]。本實(shí)驗(yàn)中我們用免疫熒光定位小窩蛋白1，發(fā)現(xiàn)在人支氣管上皮細(xì)胞中小窩蛋白1主要定位于細(xì)胞膜上。研究報道氯化鎘(CdCl2)和TGF-β1處理肺組織后，肺上皮細(xì)胞中小窩蛋白1的表達(dá)明顯減少[9]。在肺纖維化的肺組織與對照組肺組織相比，發(fā)現(xiàn)小窩蛋白1蛋白及mRNA水平較對照組明顯降低。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了TGF-β1作用于16HBE后小窩蛋白1的mRNA和蛋白表達(dá)明顯減少，并且具有時間依賴性，說明TGF-β1刺激16HBE細(xì)胞后，引起了小窩蛋白1的減少。

肺泡上皮細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞在外界刺激因子的刺激下均能發(fā)生EMT。E-鈣黏蛋白是上皮表型中一種重要的標(biāo)志物，主要存在于胞間黏附結(jié)構(gòu)中。研究表明E-鈣黏蛋白能抑制上皮細(xì)胞發(fā)生遷移和侵襲[10]。細(xì)胞發(fā)生癌變后，E-鈣黏蛋白的表達(dá)明顯減少，引起胞間黏附結(jié)構(gòu)的喪失而發(fā)生遷移；相反，增強(qiáng)E-鈣黏蛋白的表達(dá)卻能穩(wěn)定腫瘤細(xì)胞間的黏附結(jié)構(gòu)從而抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。研究顯示在轉(zhuǎn)基因小鼠的腫瘤模型和細(xì)胞培養(yǎng)模型中可通過敲除掉E-鈣黏蛋白基因誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[11]?？梢奅-鈣黏蛋白表達(dá)的下調(diào)是EMT的一個重要組成部分，E-鈣黏蛋白的缺失也與上皮極性與細(xì)胞黏附結(jié)構(gòu)的降解密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中我們用TGF-β1作用于16HBE細(xì)胞后E-鈣黏蛋白的mRNA和蛋白均明顯下降，用siRNA干擾caveolin-1后發(fā)現(xiàn)，E-鈣黏蛋白也出現(xiàn)了明顯的下降；并且我們先用siRNA干擾caveolin-1后再用TGF-β1刺激16HBE細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，caveolin-1的缺失進(jìn)一步促進(jìn)了TGF-β1刺激后E-鈣黏蛋白的表達(dá)下降，提示caveolin-1可能參與EMT中細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的維持和極性改變。

EMT的另一特征是間充質(zhì)標(biāo)志物如α-SMA蛋白的表達(dá)增加，而α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的主要標(biāo)記物。表達(dá)α-SMA的肌成纖維細(xì)胞是造成細(xì)胞外基質(zhì)異常沉積的主要效應(yīng)細(xì)胞，其合成膠原纖維的能力約是成纖維細(xì)胞的4～5倍；成纖維細(xì)胞灶越多說明纖維化越嚴(yán)重。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞后α-SMA表達(dá)明顯增多，干擾caveolin-1后，TGF-β1刺激后α-SMA的表達(dá)量進(jìn)一步增多，提示caveolin-1的缺失促進(jìn)了EMT中肺上皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。

Caveolin-1下調(diào)與EMT的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制涉及多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括TGF-β1/Smad途徑和非依賴Smad的途徑如PI3K/AKT。研究發(fā)現(xiàn)caveolin-1能阻斷TGF-β1/Smad信號通路[12]，抑制Smad2的磷酸化，從而使得傳導(dǎo)至核的信號減少，影響了EMT相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。而caveolin-1的這些功能主要通過其“腳手架”結(jié)構(gòu)域與TGF-β1受體結(jié)合而發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)中當(dāng)16HBE細(xì)胞用TGF-β1處理后，發(fā)現(xiàn)下游通路中的Smad3蛋白發(fā)生磷酸化，且在30 min達(dá)到高水平，干擾caveolin-1的表達(dá)后，發(fā)現(xiàn)TGF-β1處理后的Smad3蛋白磷酸化明顯增強(qiáng)，提示caveolin-1參與了EMT信號通路中的TGF-β1-Smad途徑。

在經(jīng)歷EMT的上皮細(xì)胞中，TGF-β1通過PI3K激活A(yù)KT，導(dǎo)致哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1，mTORC1)和mTORC2的活化。PI3K的抑制劑能阻止TGF-β1誘導(dǎo)EMT，表明了PI3K-AKT途徑在這一過程中也起著重要的作用。在TGF-β誘導(dǎo)EMT的過程中，mTORC1有助于增加細(xì)胞體積，促進(jìn)蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞遷移和侵襲；而mTORC2是上皮到間充質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)化過渡過程所必需的。AKT的抑制能降低Snail1 的表達(dá)水平[13]，減弱對E-鈣黏蛋白表達(dá)的抑制和MMP9表達(dá)的激活，抑制mTORC2能阻礙侵襲和轉(zhuǎn)移潛能。Zundel等[14]的研究表明caveolin-1表達(dá)下調(diào)抑制了PI3K信號，能增強(qiáng)了成纖維細(xì)胞抗凋亡的能力。Caveolin-1的腳手架區(qū)域能負(fù)性調(diào)控MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的AKT信號，抑制肌腱蛋白C和膠原蛋白集聚，從而抑制纖維化；而用caveolin-1能治療博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化反應(yīng)[15]。我們推測在TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中亦涉及caveolin-1-PI3K/AKT 途徑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：當(dāng)16HBE細(xì)胞用TGF-β1處理，在30 min時AKT磷酸化水平最強(qiáng)，干擾Cav-1基因后，TGF-β1誘導(dǎo)的磷酸化 AKT蛋白明顯增多，說明caveolin-1的缺失促進(jìn)了AKT信號分子的激活，推測caveolin-1可能對TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的EMT有抑制作用，其抑制作用可能涉及到PI3K/AKT信號通路。

綜上所述，caveolin-1主要表達(dá)于16HBE細(xì)胞膜上，TGF-β1誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞caveolin-1的表達(dá)明顯降低，并具有時間依賴性；干擾caveolin-1的表達(dá)后，更進(jìn)一步促進(jìn)了TGF-β1誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞EMT的發(fā)展；其中caveolin-1參與TGF-β1誘導(dǎo)的EMT可能是通過TGF-β1受體通路中的經(jīng)典TGF-β1/Smad通路和非Smad通路中PI3K/AKT通路?？傊琓GF-β1誘導(dǎo)16HBE 中caveolin-1的表達(dá)降低可能是支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。作為氣道重構(gòu)、纖維化和炎癥的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，探討caveolin-1在EMT的表達(dá)及作用機(jī)制，對于進(jìn)一步認(rèn)識哮喘氣道重構(gòu)具有重要意義，為臨床治療哮喘提供了新的方向。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Effect of caveolin-1 on TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transition of human bronchial epithelial cells

ZHONG Chang-jiang2, LI Jian-hua1, YUE Xi-lei3, XU Ji-de1, YANG Chun-tao1, DENG Li-ting1

(1DepartmentofPhysiology,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou511436,China；2HuaduDistrictPeople’sHospitalofGuangzhou,Guangzhou510800，China；3HuangshiCentralHospital，Huangshi435000，China.E-mail:xujide@163.com)

AIM: To investigate the role of caveolin-1 on epithelial-mesenchymal transition (EMT) in human bronchial epithelial (HBE) cells induced by transforming growth factor beta 1 (TGF-β1). METHODS: Immunofluorescence, real-time PCR and Western blot were applied to detect the mRNA and the protein expression of caveolin-1 in the 16HBE cells during EMT. The influence of siRNA-mediated silencing of caveolin-1 on EMT in the 16HBE cells was detected by Western blot.RESULTS: Caveolin-1 was widely present on the cell membrane of the 16HBE cells. The expression of caveolin-1 at mRNA and protein levels was significantly decreased in a time-dependent manner in the 16HBE cells compared with control group (P<0.05) after stimulation with TGF-β1. The morphologic changes of the 16HBE cells induced by TGF-β1 were promoted by caveolin-1 silencing compared with TGF-β1 group. The protein expression of E-cadherin and α-SMA induced by TGF-β1 was promoted by caveolin-1 silencing compared with TGF-β1 group (P<0.05). The phosphorylation levels of AKT and Smad3 were the highest at 30 min and increased significantly compared with control group (P<0.05) after stimulated with TGF-β1. Treatment of the 16HBE cells with TGF-β1 for 30 min after silencing caveolin-1 gene for 24 h significantly increased the phosphorylation levels of AKT and Smad3 compared with TGF-β1 group (P<0.05). CONCLUSION: TGF-β1 down-regulates the expression of caveolin-1 in the 16HBE cells. Caveolin-1 may participate in TGF-β1/Smad pathway and PI3K-AKT pathway, which are the signal transduction pathways for TGF-β1 inducing EMT.

Transforming growth factor β1; Human bronchial epithelial cells; Epithelial-mesenchymal transition; Caveolin-1; Airway remodeling

1000- 4718(2017)06- 1091- 07

2016- 09- 26

2017- 02- 15

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81470205)

R332； R562.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.06.022

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