α3β2與α3β4煙堿型乙酰膽堿受體α和β亞基不同配比的藥理活性研究*

朱曉鵬， 于津鵬， 黃 藝， 雷宇苗， 長孫東亭， 羅素蘭

(海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， ?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海洋學(xué)院藥學(xué)系， 海南 ?？?570228)

·論 著·

α3β2與α3β4煙堿型乙酰膽堿受體α和β亞基不同配比的藥理活性研究*

朱曉鵬， 于津鵬， 黃 藝， 雷宇苗， 長孫東亭， 羅素蘭?

(海南大學(xué)熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， ?？谑泻Ｑ笏幬镏攸c(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 海洋學(xué)院藥學(xué)系， 海南 ?？?570228)

目的： 比較α和β亞基不同配比形成α3β2和α3β4煙堿型乙酰膽堿受體(nAChR)敏感性的差異。方法: 體外轉(zhuǎn)錄獲得α和β亞基的cRNA，采用顯微注射將3種不同配比(α∶β分別為1∶10、1∶1和10∶1)的cRNA注入非洲爪蟾卵母細(xì)胞，利用雙電極電壓鉗檢測受體表達(dá)情況。利用激動劑乙酰膽堿(ACh)和拮抗劑α-芋螺毒素RegIIA (α-CTx RegIIA)檢測在3種配比條件下形成受體藥理活性的差異。結(jié)果: 對于α3β2 nAChR亞型，在3種配比情況下，ACh的半數(shù)有效濃度(EC50)分別為91.2 μmol/L、104.4 μmol/L和130.6 μmol/L， α-CTx RegIIA的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為40.2 nmol/L、36.4 nmol/L和42.3 nmol/L。對于α3β4 nAChR亞型，在3種配比情況下，ACh的EC50分別為44.0 μmol/L、110.0 μmol/L和230.0 μmol/L， α-CTx RegIIA的IC50分別為226.8 nmol/L、71.5 nmol/L和49.4 nmol/L。結(jié)論: α3和β4亞基比例的改變會導(dǎo)致α3β4 nAChR結(jié)構(gòu)和藥理活性的改變。α3和β2亞基比例的改變對α3β2 nAChR結(jié)構(gòu)和活性沒有影響。

煙堿型乙酰膽堿受體； 亞基配比； 藥理活性； 雙電極電壓鉗

煙堿型乙酰膽堿受體(nicotinic acetycholine receptors，nAChRs)屬于配體門控離子通道，在神經(jīng)系統(tǒng)突觸間信號傳遞過程中起重要作用。nAChRs能影響并調(diào)節(jié)一系列生理機(jī)能，如疼痛、抑郁、焦慮、認(rèn)知等[1-2]。這類受體是由α亞基(α2～10)和β亞基(β2～4)共同組成的五聚體復(fù)合物，其中α7亞基比較特殊，可以單獨(dú)形成同型五聚體[3]。包含α3亞基的nAChRs(α3*)是其中重要的一類，主要包括α3β2和α3β4兩種亞型。α3亞基主要位于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其基因是第一個(gè)被克隆的nAChRs亞基基因，與一系列自主神經(jīng)的功能相關(guān)[4]。研究發(fā)現(xiàn)，α3β2 nAChR是視網(wǎng)膜、視神經(jīng)和紋狀體上的一種重要亞型[5]。α3β4 nAChR是自主神經(jīng)元、腎上腺髓質(zhì)、內(nèi)側(cè)韁核、腳間核、松果體和視網(wǎng)膜等部位的一種重要nAChR亞型[6-7]。α和β亞基可以組成不同的nAChRs亞型，如α3β2、α2β2、α3β4、α4β2、α4β4等，不同的nAChRs亞型表現(xiàn)出不同的藥理學(xué)活性，每個(gè)α和β亞基都對nAChRs的藥理學(xué)活性具有重要作用[8]。通常2個(gè)α亞基和3個(gè)β亞基可以形成功能性的五聚體nAChR。當(dāng)α和β亞基比例發(fā)生改變后，能否形成有功能的nAChRs？本研究以大鼠α3β2和α3β4為對象，借助nAChRs激動劑乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和特異拮抗劑探針α-芋螺毒素RegIIA (α-conotoxin RegIIA，α-CTx RegIIA)[9]，擬探討α和β亞基比例發(fā)生改變后，α3β2和α3β4兩種亞型藥理活性的變化。

材 料 和 方 法

1 動物、試劑和儀器

雌性非洲爪蟾(Xenopuslaevis)購自Nasco，實(shí)驗(yàn)室17 ℃飼養(yǎng)3周以上。包含大鼠α3、β2和β4三種nAChRs亞基基因克隆的質(zhì)粒由美國Stephen F. Heinemann 教授(Salk Institute, La Jolla, CA)惠贈。

質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega； DNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒和RNA純化試劑盒購自Thermo Fisher Scienti-fic；ACh、阿托品(atropine)和膠原蛋白酶(collagenase)購自Sigma-Aldrich；限制性內(nèi)切酶、DNA片段純化試劑盒、DNA Marker和RNA Marker購自大連寶生物工程有限公司。色譜級乙腈(acetonitrile，ACN)購自Thermo Fisher Scientific； HEPES購于上海生工生物工程有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純，購自廣州化學(xué)試劑廠。ND96溶液含有96 mmol/L NaCl、2.0 mmol/L KCl、1.0 mmol/L MgCl2·6H2O、1.8 mmol/L CaCl2·2H2O和5 mmol/L HEPES， pH 7.5。α-CTx RegIIA線性肽由上海吉爾生化有限公司合成。

小型水平電泳儀(Bio-Rad)； NanoDrop 2000超微量分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)； Alpha-Imager凝膠成像分析系統(tǒng)(ProteinSimple)；高效液相色譜儀(Waters)；電噴霧電離質(zhì)譜(SHIMADZU)；膜片鉗系統(tǒng)Axon 900A (Molecular Devices)。

2 方法

2.1 nAChRs亞基cRNA的制備 將包含α3、β2和β4亞基基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌(E.coli) DH5α，37 ℃培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒。瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計(jì)檢測質(zhì)粒濃度純度后進(jìn)行酶切。分別采用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ和XhoⅠ對α3、β2和β4亞基質(zhì)粒進(jìn)行酶切。DNA片段純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，線性化的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。分別采用mMESSAGE mMACHINE Kit和MEGAclear Transcription Clean-Up Kit進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄和RNA純化。純化后的RNA，在260 nm波長下測定濃度后，分裝-80 ℃保存。

2.2 不同亞基配比α3β2和α3β4 nAChRs的表達(dá) 取雌性非洲爪蟾，冰浴麻醉后分離質(zhì)量較好的卵母細(xì)胞[10]。將新鮮分離的爪蟾卵母細(xì)胞用含3種抗生素(青霉素10 mg/L、鏈霉素10 mg/L和慶大霉素100 mg/L)的ND96溶液培養(yǎng)，17 ℃培養(yǎng)過夜后，選取動物極和植物極分明、生長狀況良好的卵母細(xì)胞進(jìn)行顯微注射。將α和β亞基的cRNA按照3個(gè)比例混合，α∶β分別為1∶10、1∶1和10∶1。每個(gè)細(xì)胞的注射體積為50.2 nL。注射到每個(gè)蛙卵細(xì)胞的單個(gè)亞基cRNA的量為5～30 ng。注射后的蛙卵，轉(zhuǎn)移至新鮮含抗生素的ND96溶液中，17 ℃培養(yǎng)1～5 d內(nèi)，可以進(jìn)行電生理檢測[11]。電生理實(shí)驗(yàn)條件：鉗制電壓-70 mV， Gain值2 000， filter 100 Hz。ND96溶液重力灌流，流速2 mL/min，在1 min的記錄時(shí)間內(nèi)，給予蛙卵細(xì)胞1 s ACh刺激，促使通道開放，產(chǎn)生內(nèi)向電流。對注射3種比例cRNA的2種亞型α3β2和α3β4 nAChRs，分別采用不同濃度的ACh (1～1 000 μmol/L)誘導(dǎo)其開放。以高濃度ACh (1 000 μmol/L)激活通道產(chǎn)生的電流為分母，計(jì)算不同濃度ACh誘導(dǎo)電流對應(yīng)的反應(yīng)率(Response%)。每個(gè)濃度點(diǎn)取3～6個(gè)蛙卵所記錄的Response%作為統(tǒng)計(jì)結(jié)果。利用GraphPad Prism 6.0軟件，通過非線性擬合方程Response%=100/[1+(EC50/[agonist])nH] (其中nH代表Hill系數(shù))，計(jì)算注射不同比例α和β亞基cRNA后，ACh對形成的α3β2和α3β4 nAChRs亞型的半數(shù)有效濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)。

2.3 α-CTx RegIIA的合成和氧化折疊 為了驗(yàn)證注射3種比例cRNA的α3β2和α3β4 nAChRs對拮抗劑的活性是否存在差異，選擇α-CTx RegIIA作為拮抗劑探針對受體藥理學(xué)活性進(jìn)行檢測。上海吉爾生化有限公司合成RegIIA線性肽，RegIIA線性肽中第2個(gè)和第4個(gè)半胱氨酸(cysteine，Cys)分別用乙酰氨甲基(acetamidomethyl，Acm)保護(hù)。線性粗肽經(jīng)高效液相層析(high-performance liquid chromatography，HPLC)純化純度高于95%，采用兩步法進(jìn)行氧化折疊[12]：鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]反應(yīng)液促使形成第一對二硫鍵(Cys1-Cys3)；碘(I2)氧化促使形成第二對二硫鍵(Cys2-Cys4)。氧化折疊后的最終產(chǎn)物經(jīng)HPLC純化和質(zhì)譜鑒定后，可用于檢測受體藥理活性的變化。

2.4 α-CTx RegIIA與nAChR相互作用的研究 利用Axon 900A雙電極電壓鉗系統(tǒng)，檢測α-CTx RegIIA與α和β不同配比條件下形成不同nAChRs構(gòu)型的相互作用。以ND96溶液為對照，記錄其在細(xì)胞槽中與蛙卵孵育5 min后，在100 μmol/L ACh誘導(dǎo)下產(chǎn)生的電流。當(dāng)該電流平穩(wěn)后，以孵育后誘導(dǎo)開放的第一個(gè)電流軌跡作為基準(zhǔn)。然后，用不同濃度的RegIIA替代ND96，孵育5 min，記錄蛙卵與RegIIA相互作用后產(chǎn)生的電流值。以RegIIA影響后的電流與基準(zhǔn)電流的比值作為Response%。RegIIA給藥濃度范圍1 nmol/L～10 μmol/L，每個(gè)濃度點(diǎn)檢測3～6個(gè)蛙卵細(xì)胞。所得數(shù)據(jù)利用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行分析，通過非線性擬合方程Response% = 100/[1+([toxin]/IC50)nH] (nH代表Hill系數(shù))，計(jì)算α-CTx RegIIA對不同配比條件下形成α3β2和α3β4 nAChRs亞型的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration，IC50)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。電流強(qiáng)度數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示； ACh的EC50和α-CTx RegIIA的IC50以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較采用Bonferroni多重比較的方法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 nAChRs亞基cRNA的制備

提取α3、β2和β4三種亞基的質(zhì)粒，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。3種質(zhì)粒的分子量大小在3 000 bp左右。利用紫外分光光度計(jì)測定3種質(zhì)粒的濃度，α3、β2和β4的對應(yīng)濃度分別為0.379 g/L、0.227 g/L和0.519 g/L，對應(yīng)A260/A280值分別為1.89、1.97和1.88，比值在1.8～2.0之間，濃度和純度均能滿足酶切的要求。酶切后純化3種質(zhì)粒。線性化質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠中的遷移速度較超螺旋質(zhì)粒變慢。α3、β2和β4線性化模板的濃度分別為0.229 g/L、0.321 g/L和0.452 g/L，符合模板濃度要大于0.2 g/L的要求。體外轉(zhuǎn)錄1 h后，獲得3種亞基對應(yīng)的cRNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測，α3、β2和β4對應(yīng)cRNA的大小分別為2 000、2 200和2 800 nt左右。分光光度計(jì)測定3種亞基cRNA的對應(yīng)濃度分別為0.543 g/L、0.388 g/L和0.580 g/L；對應(yīng)A260/A280值分別為1.91、1.95和2.00，濃度和純度可以滿足表達(dá)的要求，見圖1。

2 不同亞基配比α3β2和α3β4 nAChRs的表達(dá)

將制備好的α和β亞基cRNA按照不同的配比(1∶10、1∶1和10∶1)混合后，注入爪蟾卵母細(xì)胞。注射后第2天，對3種配比條件下形成的α3β2和α3β4亞型進(jìn)行電生理檢測。以100 μmol/L ACh為激動劑，誘導(dǎo)通道開放，記錄ACh所誘發(fā)的電流大小。統(tǒng)計(jì)6個(gè)蛙卵電流的平均值進(jìn)行比較(圖2)。對于α3β2亞型，1∶10、1∶1和10∶1配比條件下誘發(fā)的電流對應(yīng)為(681.85±143.91) nA、(719.90±162.40) nA和(620.60±59.89) nA。與1∶1配比條件下形成的α3β2亞型相比，1∶10和10∶1配比條件下形成的α3β2亞型針對ACh誘導(dǎo)產(chǎn)生的電流差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。對于α3β4亞型，1∶10、1∶1和10∶1配比條件下誘發(fā)的電流對應(yīng)為(1 428.38±154.02) nA、(894.48±61.13) nA和(125.20±13.79) nA。與1∶1配比條件下形成的α3β4亞型相比，1∶10和10∶1配比條件下形成的α3β4亞型針對ACh誘導(dǎo)產(chǎn)生的電流差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。為了進(jìn)一步確認(rèn)α3β2和α3β4在不同配比情況下對ACh敏感性的差異，利用不同濃度的ACh測定ACh的EC50(圖3)。與1∶1配比組相比，1∶10和10∶1配比條件下表達(dá)的α3β2亞型EC50的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。ACh對1∶10、1∶1和10∶1配比條件下α3β4亞型的EC50分別為44.0 μmol/L、110.0 μmol/L和230.0 μmol/L。與1∶1配比組相比，ACh對1∶10和10∶1配比條件下表達(dá)的α3β4亞型的EC50差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，其中1∶10配比條件下形成的受體結(jié)構(gòu)對ACh敏感度高，而10∶1配比條件下形成的受體結(jié)構(gòu)對ACh敏感度低，兩者EC50的差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見表1。

Figure 1.Agarose gel electrophoresis of α and β subunit plasmids and RNA. A: α and β subunit plasmids and linear DNA. M: DNA Marker DL10000; 1: the α3 plasmid; 2: the α3 plasmid digested byEcoR I; 3: the β2 plasmid; 4: the β2 plasmid digested byHindⅢ; 5: the β4 plasmid; 6: the β4 plasmid digested byXhoI. B: α and β subunit RNA transcriptioninvitro. M: RNA Marker RL6000; 7: the α3 subunit RNA; 8: the β2 subunit RNA; 9: the β4 subunit RNA.

圖1 α和β亞基質(zhì)粒和RNA電泳圖

Figure 2.Inward current amplitudes of α3β2 and α3β4 nAChRs with different subunit stoichiometries evoked by perfusion with 100 μmol/L ACh. Mean±SD.n=6.**P<0.01vs1∶1 group;##P<0.01vs10∶1 group.

圖2 不同構(gòu)型α3β2和α3β4 nAChR在100 μmol/L ACh誘導(dǎo)下產(chǎn)生的電流

Figure 3.Concentration-response curves of ACh for α3β2 and α3β4 nAChRs with different subunit stoichiometries expressed inXenopusoocytes. Mean±SEM.n=12.

圖3 ACh對不同構(gòu)型α3β2和α3β4 nAChR的劑量效應(yīng)曲線

表1 ACh對注射不同α和β亞基比例形成α3β2和α3β4 nAChRs的半數(shù)有效濃度

Table 1.Half-maximal effective concentrations (EC50) of ACh for α3β2 and α3β4 nAChRs expressed inXenopusoocytes injected with cRNA encoding α and β subunits at different ratios (Mean±SEM.n=12)

α∶βratioα3β2α3β4EC50(μmol/L)HillslopeEC50(μmol/L)Hillslope1∶1091.2±14.21.26(0.76～1.77) 44.0±2.5**1.25(1.08～1.42)1∶1104.4±17.20.90(0.64～1.15)110.0±7.51.60(1.31～1.88)10∶1130.6±11.91.23(0.98～1.48) 230.0±11.8**##2.36(1.87～2.85)

**P<0.01vs1∶1 group;##P<0.01vs1∶10 group.

3 α-CTx RegIIA的合成和氧化折疊

為了進(jìn)一步驗(yàn)證3種配比條件下形成的α3β2和α3β4 nAChRs亞型藥理活性的差異，我們合成了它們的拮抗劑α-CTx RegIIA。通過兩步法氧化折疊得到RegIIA的活性形式肽，其二硫鍵連接方式為Cys1-Cys3和Cys2-Cys4。利用HPLC和質(zhì)譜對得到的RegIIA進(jìn)行鑒定，其洗脫時(shí)間為8.12 min，分子量為1 662.63 Da，與形成2對二硫鍵后的RegIIA理論分子量1 662.64 Da相符，見圖4。

Figure 4.α-CTx RegIIA sequence and HPLC and MS analysis. A: the sequence of α-CTx RegIIA; B: HPLC chromatogram of α-CTx RegIIA with a retention time of 8.12 min; C: mass spectrometry data for α-CTx RegIIA with observed molecular mass of 1 662.63 Da.

圖4 α-CTx RegIIA的序列、高效液相層析和質(zhì)譜鑒定

4 α-CTx RegIIA與nAChR相互作用的研究

利用不同濃度的α-CTx RegIIA與蛙卵相互作用，計(jì)算RegIIA對3種配比條件下形成α3β2和α3β4 nAChRs亞型的IC50(圖5)。對于α3β2亞型，在α3∶β2為1∶10、1∶1和10∶1的配比條件下，Reg-IIA的IC50分別為40.2 nmol/L、36.4 nmol/L和42.3 nmol/L，1∶10和10∶1配比組的IC50分別與1∶1組進(jìn)行比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。對于α3β4亞型，在α3∶β4為1∶10、1∶1和10∶1的配比條件下，Reg-IIA的IC50分別為226.8 nmol/L、71.5 nmol/L和49.4 nmol/L，RegIIA對10∶1配比條件下形成的α3β4構(gòu)型藥理活性與1∶1組比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；RegIIA對1∶10配比條件下形成的α3β4構(gòu)型藥理活性與1∶1組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；1∶10和10∶1兩組IC50進(jìn)行比較，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見表2。

討 論

本實(shí)驗(yàn)通過改變α和β亞基的配比，發(fā)現(xiàn)配比改變后α3β4 nAChR亞型對ACh和拮抗劑α-CTx RegIIA的藥理活性有不同程度的改變，而α3β2 nAChR亞型沒有太多變化。最早認(rèn)為α亞基對神經(jīng)型nAChRs的藥理學(xué)活性起重要作用，α亞基是激動劑的主要結(jié)合部位，含有2個(gè)激動劑結(jié)合位點(diǎn)[13]。后來研究發(fā)現(xiàn)β亞基也對nAChRs的藥理學(xué)活性起重要作用，ACh的結(jié)合位點(diǎn)位于α和β亞基的臨界面[8]。由此我們推測，α3β4 nAChR亞型藥理活性的改變可能是由于α3和β4亞基組成改變后，形成了不同的α3β4構(gòu)型，如 (α3)2(β4)3和(α3)3(β4)2。另外，α3和β4亞基的位置關(guān)系也可能發(fā)生了變化(圖6)，臨界面的改變導(dǎo)致激動劑和拮抗劑與受體結(jié)合活性的變化。

Figure 5.The concentration-response curves of α-CTx RegIIA for α3β2 and α3β4 nAChRs with different subunit stoichiometries. Mean±SEM.n=8.

圖5 α-CTx RegIIA對不同構(gòu)型α3β2和α3β4 nAChR的劑量效應(yīng)曲線

表2 α-CTx RegIIA對不同組成α3β2和α3β4 nAChR的半數(shù)抑制濃度和Hill系數(shù)

Table 2.IC50and Hill slope values of α-CTx RegIIA for α3β2 and α3β4 nAChRs with different subunit stoichiometries (Mean±SEM.n=8)

α∶βratioα3β2α3β4IC50(nmol/L)HillslopeIC50(nmol/L)Hillslope1∶1040.2±5.70.68(0.53～0.83) 226.8±15.3**1.12(0.98～1.26)1∶136.4±5.80.58(0.47～0.69)71.5±7.41.03(0.79～1.28)10∶142.3±4.90.63(0.52～0.74) 49.4±3.5##1.09(0.89～1.29)

**P<0.01vs1∶1 group;##P<0.01vs1∶10 group.

Figure 6.Possible arrangements of α3 and β4 subunits in heteropentameric nAChRs.

圖6 α3和β4亞基在nAChR異五聚體中的分布

不同配比條件下形成α3β4 nAChR亞型藥理活性的差異，有沒有可能是編碼α和β亞基cRNA表達(dá)量的差異或者爪蟾卵母細(xì)胞存在內(nèi)源性α和β亞基影響nAChR的組成，導(dǎo)致受體形成不同構(gòu)型？我們通過幾種辦法驗(yàn)證了這些因素：(1) 給蛙卵細(xì)胞注射不同劑量和不同批次的cRNA；(2) 利用不同批次的爪蟾取卵母細(xì)胞重復(fù)試驗(yàn)；(3) 單獨(dú)注射α或β亞基看能否形成功能性受體。結(jié)果顯示，α和β亞基配比是形成不同構(gòu)型α3β4 nAChR藥理活性差異的主要因素。

研究其它nAChR亞型時(shí)也曾發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，如α4β2 nAChR可以通過改變亞基的配比，從而改變通道的藥理學(xué)活性和功能特征。α4和β2亞基的比例改變后，形成2種不同異構(gòu)型：(α4)2(β2)3和(α4)3(β2)2。這2種構(gòu)型對激動劑和拮抗劑表現(xiàn)出不同的敏感性，對Ca2+也表現(xiàn)出不同的通透性[14-16]。α-CTx作為nAChRs的特異性探針，不僅可以區(qū)分不同的亞型[17]，在nAChRs精細(xì)結(jié)構(gòu)的識別方面也具有重要作用，如：TxID和AuIB這2種α-CTxs對α3和β4亞基在不同配比條件下形成的α3β4 nAChR也表現(xiàn)出不同的藥理學(xué)活性(表3)。其中AuIB對10∶1配比條件下形成的α3β4 nAChR較為敏感，IC50為1.10 μmol/L；而對1∶10配比條件下形成的α3β4 nAChR敏感性較差，IC50為3.00 μmol/L[18]。TxID與AuIB不同，它對1∶1配比條件下形成的α3β4 nAChR最敏感，IC50為12.50 nmol/L；但是對10∶1配比條件下形成的α3β4 nAChR敏感性最差，IC50為64.60 nmol/L[19]。我們推測，這種差異可能是TxID和AuIB在α3β4 nAChR上結(jié)合位點(diǎn)和結(jié)合方式的不同所導(dǎo)致的。RegIIA對3種配比條件下所形成α3β4 nAChR的活性改變趨勢與AuIB相同，但是RegIIA對1∶10和10∶1這2種構(gòu)型的區(qū)分度要優(yōu)于AuIB。關(guān)于α-CTxs與α3β4 nAChR相互作用的分子機(jī)制還需要借助受體突變和分子docking做進(jìn)一步深入研究。但是利用α-CTxs作為工具探針，研究α和β不同配比情況下受體藥理活性的差異對于今后研究受體的精細(xì)結(jié)構(gòu)和生理功能具有重要指導(dǎo)意義。

表3 α-CTx AuIB和TxID對不同構(gòu)型α3β4 nAChR的半數(shù)抑制濃度和Hill系數(shù)

Table 3.IC50and Hill slope values of α-CTx AuIB and TxID for α3β4 nAChR with different subunit stoichiometries

α3∶β4ratioAuIB[18]TxID[19]IC50(μmol/L)HillslopeIC50(nmol/L)Hillslope1∶103.001.0024.001.001∶12.481.3712.501.0510∶11.101.3864.601.50

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Pharmacological activities of α3β2 and α3β4 nicotinic acetycholine receptors with different α and β subunit stoichiometries

ZHU Xiao-peng, YU Jin-peng, HUANG Yi, LEI Yu-miao, ZHANGSUN Dong-ting, LUO Su-lan

(KeyLaboratoryofTropicalBiologicalResourcesofMinistryofEducation,KeyLaboratoryforMarineDrugofHaikou,DepartmentofPharmacyofOceanCollege,HainanUniversity,Haikou570228,China.E-mail:luosulan2003@163.com)

AIM: To compared the differential sensitivity of nicotinic acetycholine receptors (nAChRs) consisting of α and β subunits with different ratios.METHODS: The cRNA of α and β subunits was obtained byinvitrotranscription. The α3β2 and α3β4 nAChR subtypes were expressed inXenopuslaevisoocytes by microinjection of cRNA coding α and β subunits at α∶β ratios of 1∶10, 1∶1 and 10∶1. The pharmacological activities of nAChRs to agonist acetycholine (ACh) and antagonist α-conotoxin (CTx) RegIIA were investigated by two-electrode voltage-clamp techniques.RESULTS: For α3β2 nAChR expressed at the ratios of 1∶10, 1∶1 and 10∶1, the EC50values of ACh were 91.2 μmol/L, 104.4 μmol/L and 130.6 μmol/L, respectively, while the IC50values of α-CTx RegIIA were 40.2 nmol/L, 36.4 nmol/L and 42.3 nmol/L, respectively. For α3β4 nAChR at the ratios of 1∶10, 1∶1 and 10∶1, the EC50values of ACh were 44.0 μmol/L, 110.0 μmol/L and 230.0 μmol/L, respectively, while the IC50values of α-CTx RegIIA were 226.8 nmol/L, 71.5 nmol/L and 49.4 nmol/L, respectively.CONCLUSION: The results imply that the α3 and β4 subunit stoichiometry can change the structure and pharmacological activity of α3β4 nAChR, but the stoichiometry of α3 and β2 subunits has no effect on α3β2 nAChR.

Nicotinic acetycholine receptors; Subunit stoichiometry; Pharmacological activity; Two-electrode voltage-clamp techniques

1000- 4718(2017)06- 0961- 07

2017- 01- 18

2017- 04- 10

國家自然科學(xué)基金重點(diǎn)國際合作項(xiàng)目(No. 81420108028)；國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 41366002)；長江學(xué)者和創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No. IRT-15R15)；海南省高等學(xué)?？茖W(xué)研究項(xiàng)目(No. Hnky2017-16)；海南大學(xué)科研啟動基金資助項(xiàng)目[No. KYQD(ZR)1713]

R962

A

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