菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝優(yōu)化及比較

段宙位,何 艾,竇志浩,王世萍,劉 佳,謝 輝,*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所,海南?？?571100; 2.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228)

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菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝優(yōu)化及比較

段宙位1,何 艾1,竇志浩1,王世萍1,劉 佳2,謝 輝1,*

(1.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所,海南?？?571100; 2.海南大學(xué)食品學(xué)院,海南海口 570228)

為篩選適合菠蘿蜜果皮黃酮的提取方法,以得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),應(yīng)用酶法和有機(jī)溶劑浸提法提取其果皮中的黃酮類化合物,在單因素基礎(chǔ)上,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn),優(yōu)化提取工藝,并對(duì)兩種提取方法結(jié)果進(jìn)行比較評(píng)價(jià)。結(jié)果表明,酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮最佳工藝條件為：果膠酶用量300 U/g、乙醇濃度80%(v/v)、溫度55 ℃、pH5.5、底物質(zhì)量濃度45 g/L,時(shí)間2.0 h;有機(jī)溶劑浸提最佳工藝條件為：乙醇濃度80%(v/v),溫度55 ℃,料液比1∶20(g/mL),時(shí)間2.5 h;酶法提取黃酮類化合物得率和純度分別為4.98%、12.60%,高于有機(jī)溶劑浸提法的3.05%、8.92%,提取物的抗氧化性強(qiáng)于有機(jī)溶劑浸提法,說(shuō)明酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮優(yōu)于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提法。

菠蘿蜜果皮,黃酮,提取,抗氧化活性

菠蘿蜜又稱苞蘿、牛肚子果,是?？浦参锬静ぬ}(ArtocarpusheterophyllusLam.)的果實(shí),有“熱帶水果皇后”之稱[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),每年我國(guó)熱區(qū)菠蘿蜜產(chǎn)量接近120萬(wàn)噸[2],菠蘿蜜產(chǎn)量高,果實(shí)碩大營(yíng)養(yǎng)豐富,以鮮食為主,在此過(guò)程中產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物——果皮、果腱等約占整果的40%～60%[3],這些物質(zhì)常被丟棄,既浪費(fèi)資源又污染環(huán)境。研究表明,菠蘿蜜果皮中含有糖類、多酚、黃酮、果膠等多種具有生物活性的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[4],應(yīng)用前景廣闊。

黃酮主要存在于植物根、葉、皮等組織中,具有抗凝血、降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗抑郁等[5-6]功效。國(guó)內(nèi)外關(guān)于黃酮的提取研究報(bào)道較多,主要有溶劑萃取法[7],微波、超聲波和酶輔助提取法[8]等,關(guān)于菠蘿蜜黃酮的研究也有相關(guān)報(bào)道,如郝倩等[8]用溶劑浸提法從菠蘿蜜葉中提取黃酮,提取率為5.796%;鄧夢(mèng)琴等采用溶劑浸提法[9]和超聲波輔助提取法[10]從菠蘿蜜果皮中提取黃酮,提取率分別為20.35%和6.92%。然而,關(guān)于酶輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮及提取工藝比較的研究較少,而酶法(主要是纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等)提取黃酮,具有反應(yīng)條件溫和、效率高等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)以菠蘿蜜果皮為原料,應(yīng)用酶法提取其中的黃酮類化合物,比較酶法與傳統(tǒng)方法提取菠蘿蜜果皮黃酮得率、純度及體外抗氧化性,以期篩選出適合菠蘿蜜果皮黃酮的提取方法,為綜合利用菠蘿蜜資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿蜜 購(gòu)于?？谑兴袌?chǎng);1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、過(guò)硫酸鉀 Sigma公司;果膠酶(100000 U/g)、纖維素酶(50000 U/g) 江蘇銳陽(yáng)生物技術(shù)有限公司。

TU-1810分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;TH2-C-1搖床 太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菠蘿蜜果皮黃酮提取工藝流程 菠蘿蜜果皮→清洗→烘干(55 ℃)→粉碎→過(guò)篩(40目)→浸提(酶法和有機(jī)溶劑浸提法)→過(guò)濾→粗提物。

1.2.2 菠蘿蜜果皮黃酮得率的測(cè)定

1.2.2.1 黃酮含量的測(cè)定 參考硝酸鋁顯色法[11]。移取0.25 mL樣液于10.0 mL比色管中,用蒸餾水定容至5.0 mL。加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL,混勻靜置6 min;再加入10%硝酸鋁溶液0.5 mL,混勻靜置6 min;再向其中加入1 mol/L氫氧化鈉溶液4.0 mL,混勻靜置15 min。同時(shí)用蒸餾水做空白對(duì)照,于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)方程的建立 按照上述方法測(cè)定蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品吸光值,以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),建立標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=11.975x-0.0325,R2=0.9996,蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.02～0.10 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2.3 得率計(jì)算 按照公式y(tǒng)(%)=(A+0.0325)×40×V×100/(11.975×1000m)計(jì)算得率,式中:y為黃酮得率;A為樣液吸光值;m為樣品質(zhì)量(g);40為稀釋倍數(shù);V為樣液體積。

1.2.3 酶輔助有機(jī)溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮

1.2.3.1 酶的篩選 稱取20 g菠蘿蜜果皮樣品,按酶活力400 U/g添加果膠酶、纖維素酶、混合酶(纖維素酶活力∶果膠酶活力=1∶1),用80%乙醇(v/v),在底物質(zhì)量濃度45 g/L,50 ℃,pH5條件下浸提3.0 h,測(cè)定樣液吸光值,計(jì)算得率。

1.2.3.2 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響 變動(dòng)乙醇濃度(50%、60%、70%、80%、90%,v/v),按酶活力400 U/g添加果膠酶,在50 ℃、pH5、底物質(zhì)量濃度45 g/L下浸提3.0 h菠蘿蜜果皮,測(cè)定上清液吸光度,計(jì)算得率。

1.2.3.3 溫度對(duì)黃酮得率的影響 變動(dòng)溫度(40、45、50、55、60 ℃),按酶活力400 U/g添加果膠酶,用80%乙醇(v/v),在底物質(zhì)量濃度45 g/L,pH5條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測(cè)定上清液吸光度,計(jì)算得率。

1.2.3.4 pH對(duì)黃酮得率的影響 調(diào)節(jié)浸提液pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5),按酶活力400 U/g添加果膠酶,用80%乙醇(v/v),在底物質(zhì)量濃度45 g/L,55 ℃條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測(cè)定上清液吸光度,計(jì)算得率。

1.2.3.5 底物質(zhì)量濃度對(duì)黃酮得率的影響 變動(dòng)底物質(zhì)量濃度(25、45、65、85、105 g/L),按酶活力400 U/g添加果膠酶,用80%乙醇(v/v),在55 ℃,pH5.5條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測(cè)定上清液吸光度,計(jì)算得率。

1.2.3.6 酶用量對(duì)黃酮得率的影響 添加不同量果膠酶(100、200、300、400、500 U/g)于浸提液中,用80%乙醇，在底物質(zhì)量濃度65 g/L,55 ℃,pH5.5條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測(cè)定上清液吸光度,計(jì)算得率。

1.2.3.7 時(shí)間對(duì)得率的影響 變動(dòng)提取時(shí)間(1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h),按酶活力300 U/g添加果膠酶,用80%乙醇(v/v),在底物質(zhì)量濃度65 g/L,55 ℃,pH5.5條件下浸提菠蘿蜜果皮3.0 h,測(cè)定上清液吸光度,計(jì)算得率。

1.2.3.8 酶輔助有機(jī)溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮工藝優(yōu)化 選擇影響菠蘿蜜果皮黃酮得率較大的四個(gè)因素乙醇濃度、溫度、pH、底物質(zhì)量濃度做正交實(shí)驗(yàn),因素水平如表1所示。

表1 酸輔助提取正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogoral test of enzyme extraction

1.2.4 有機(jī)溶劑浸提菠蘿蜜果皮黃酮工藝優(yōu)化 根據(jù)菠蘿蜜果皮黃酮的提取條件,選定乙醇濃度、溫度、時(shí)間、料液比作為有機(jī)溶劑浸提法的考察因素,以得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),進(jìn)行單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)。參照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇影響菠蘿蜜果皮黃酮得率的四個(gè)因素乙醇濃度、溫度、料液比、時(shí)間做正交實(shí)驗(yàn),因素水平如表2所示。

表2 有機(jī)溶劑提取正交實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels forms of orthogonal test of solvent extraction

1.2.5 體外抗氧化實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定 參考段宙位等[12]的方法,略有修改。取2 mL不同濃度的樣品溶液,加入2 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液,混合后在室溫下避光反應(yīng)30 min,以80%乙醇調(diào)零,在517 nm處測(cè)其吸光度Ai;同時(shí)測(cè)定2 mL 80%乙醇與2 mL樣品溶液混合后的吸光度Aj以及2 mL DPPH溶液與2 mL 80%乙醇混合后的吸光度A0。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)]/A0×100

1.2.5.2 ABTS自由基清除率的測(cè)定 參考Dudonne等[13]的方法,略有修改。取5.0 mL、7 mmol/L的ABTS溶液,加入88.0 μL、140 mmol/L的過(guò)硫酸鉀,置于暗處反應(yīng)12～16 h,形成ABTS自由基儲(chǔ)備液。在734 nm處,用體積分?jǐn)?shù)為70%(v/v)乙醇將ABTS自由基儲(chǔ)備液稀釋至吸光度為0.70±0.02,備用。準(zhǔn)確量取0.1 mL不同濃度樣品溶液,加入3.9 mL ABTS+·溶液,混勻,在室溫下反應(yīng)6 min,于734 nm處測(cè)定吸光度(AE)。同時(shí)吸取3.9 mL ABTS+·溶液,加入0.1 mL 70%的乙醇溶液于734 nm處測(cè)定吸光度(AB)。ABTS自由基清除率按下式計(jì)算:

ABTS自由基清除率(%)=[1-(AB-AE)]/AB×100

式中:AB空白樣吸光度;AE為試樣吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)的平均值,采用Excle 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,Origin 8.5軟件繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶輔助有機(jī)溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮

2.1.1 酶的篩選 由圖1可知,采用果膠酶輔助乙醇提取菠蘿蜜果皮黃酮,得率最高,這是因?yàn)椴ぬ}蜜果皮中果膠含量較多,根據(jù)酶的專一性特性,果膠酶較易破壞菠蘿蜜果皮中果膠的組織結(jié)構(gòu),便于黃酮溶出。因此,選擇果膠酶輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮類化合物。

圖1 酶種類變化對(duì)菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.1 Effect of different enzyme on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.2 乙醇濃度對(duì)黃酮得率的影響 由圖2可知,隨著乙醇濃度增加得率先增加后降低,80%(v/v)乙醇下菠蘿蜜果皮黃酮得率取得最大值。這可能是因?yàn)橹参镏悬S酮的極性與結(jié)構(gòu)不同,菠蘿蜜果皮黃酮極性與80%(v/v)乙醇極性相當(dāng),易溶于80%(v/v)乙醇,此時(shí)若變化乙醇濃度則改變了乙醇極性,不利于菠蘿蜜果皮黃酮的溶出。

圖2 乙醇濃度對(duì)菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on the yield of flavonoid from jackfruit peel

圖3 溫度對(duì)菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響 Fig.3 Effect of temperature on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.3 溫度對(duì)黃酮提取率的影響 由圖3可知,隨著溫度升高得率先增加后降低,55 ℃下,菠蘿蜜果皮黃酮得率最高。這可能是因?yàn)楣z酶破壞菠蘿蜜果皮(果膠)結(jié)構(gòu)的最適溫度為55 ℃,在最適溫度下酶活力最強(qiáng),升高或降低溫度都會(huì)降低酶的活力,減緩催化反應(yīng)進(jìn)程,引起得率降低。

2.1.4 pH對(duì)黃酮提取率的影響 由圖4可知,pH5.5時(shí),菠蘿蜜果皮黃酮得率最高,調(diào)高或調(diào)低pH得率均降低。這是因?yàn)楣z酶在pH5.5條件下,較易破壞菠蘿蜜果皮中果膠組織結(jié)構(gòu),此時(shí)催化反應(yīng)能力最強(qiáng),若改變pH,均會(huì)降低果膠酶破壞菠蘿蜜果皮細(xì)胞壁能力,進(jìn)而引起得率下降。

圖4 pH對(duì)菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.4 Effect of pH value on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.5 底物質(zhì)量濃度對(duì)黃酮提取率的影響 由圖5可知,當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為65 g/L時(shí),菠蘿蜜果皮黃酮得率基本取得最大值。這是因?yàn)楫?dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度大于65 g/L時(shí),隨著溶劑比例減小,溶劑未能充分萃取菠蘿蜜果皮黃酮,黃酮溶出減少;當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度小于65 g/L時(shí),溶劑萃取菠蘿蜜果皮黃酮趨于飽和,得率變化不大。

圖5 底物質(zhì)量濃度對(duì)菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.5 Effect of substrate concentration on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.6 酶用量對(duì)黃酮提取率的影響 由圖6可知,隨著果膠酶用量增加,菠蘿蜜果皮黃酮得率先增加后基本不變。這是因?yàn)槊赣昧?00 U/g時(shí)能保證果皮果膠酶解完全,增加酶用量對(duì)黃酮浸提影響不大。因此,酶用量選擇300 U/g為宜。

圖6 酶用量對(duì)菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.6 Effect of enzyme dose on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.7 酶解時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響 由圖7可知,浸提時(shí)間大于2 h時(shí),菠蘿蜜果皮黃酮得率基本不變。這是因?yàn)椴ぬ}蜜果皮黃酮溶出是一個(gè)緩慢-動(dòng)態(tài)過(guò)程,浸提時(shí)間2 h時(shí),黃酮溶出趨于完全。因此,浸提時(shí)間選擇2 h為宜。

圖7 時(shí)間對(duì)菠蘿蜜果皮黃酮得率的影響Fig.7 Effects of different extraction time on the yield of flavonoid from jackfruit peel

2.1.8 正交實(shí)驗(yàn) 由表3可知,影響果膠酶輔助有機(jī)溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮的四個(gè)因素次序?yàn)锳>B>D>C,最優(yōu)水平A2B2C1D2,即乙醇濃度80%(v/v),溫度55 ℃,pH5.5,底物質(zhì)量濃度45 g/L。按照A2B2C1D2條件進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn),菠蘿蜜果皮黃酮得率為4.98%(以干重計(jì),w/w),高于鄧夢(mèng)琴等[9]從菠蘿蜜果皮中提取黃酮得率為2.35%的研究結(jié)果,說(shuō)明果膠酶輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮效果較好。

表3 酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮結(jié)果Table 3 Result of flavonoid with enzyme extraction from jackfruit peel

2.2 有機(jī)溶劑提取正交實(shí)驗(yàn)

由表4可知,影響有機(jī)溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮得率的四個(gè)因素次序?yàn)锳>B>C>D,最優(yōu)水平A2B2C3D2,即乙醇濃度80%(v/v),溫度55 ℃,料液比1∶20 (g/mL),時(shí)間2.5 h。按照A2B2C3D2條件補(bǔ)加實(shí)驗(yàn),得黃酮得率為3.05%(以干重計(jì),w/w),低于酶法輔助乙醇提取菠蘿蜜果皮黃酮的得率。

表4 有機(jī)溶劑提取菠蘿蜜果皮黃酮結(jié)果Table 4 Result of flavonoid with solvent extraction from jackfruit peel

2.3 兩種提取方法結(jié)果比較

由上述結(jié)果可知,酶法輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮類化合物時(shí)間為2.0 h,低于有機(jī)溶劑浸提法的2.5 h;得率為4.98%(w/w),高于有機(jī)溶劑浸提法的3.05%(w/w);純度為12.60%,高于有機(jī)溶劑浸提法的8.92%,說(shuō)明采用酶法提取黃酮耗時(shí)較短,得率、純度較高,優(yōu)于有機(jī)溶劑浸提法。酶法輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮浸提物清除DPPH與ABTS自由基IC50分別為0.041、0.092 mg/mL,低于有機(jī)溶劑浸提法的0.072、0.116 mg/mL,說(shuō)明酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮浸提物的抗氧化性強(qiáng)于有機(jī)溶劑浸提法。綜上,酶法輔助提取菠蘿蜜果皮黃酮優(yōu)于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提法。

3 結(jié)論

以菠蘿蜜果皮為原料,采用酶法和傳統(tǒng)溶劑浸提法提取黃酮類化合物,在單因素的基礎(chǔ)上,通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。比較了酶法與有機(jī)溶劑浸提法提取菠蘿蜜果皮黃酮類化合物得率、純度與體外抗氧化性。酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮最佳工藝條件為果膠酶用量300 U/g、乙醇濃度80%(v/v)、溫度55 ℃、pH5.5、底物質(zhì)量濃度45 g/L、時(shí)間2.0 h;傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取最佳條件為乙醇濃度80%(v/v),溫度55 ℃,料液比1∶20(g/mL),時(shí)間2.5 h;酶法提取黃酮類化合物得率和純度分別為4.98%、12.60%,高于有機(jī)溶劑浸提法的3.05%、8.92%,提取物的抗氧化性強(qiáng)于有機(jī)溶劑浸提法,說(shuō)明酶法提取菠蘿蜜果皮黃酮優(yōu)于傳統(tǒng)有機(jī)溶劑浸提法。

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Optimization and comparison of extraction technology of flavonoids from jackfruit peel

DUAN Zhou-wei1,HE Ai1,DOU Zhi-hao1,WANG Shi-ping1,LIU Jia2,XIE Hui1,*

(1.Institute of Processing & Design of Agroproducts,Hainan Academy of Agricultural Science,Haikou 571100,China;2.Collage of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

The aim was to select the suitable method for extracting flavonoids from jackfruit peel,used extraction yield as evaluation index,the flavonoids was extracted by enzymatic assistant ethanol and organic solvent methods.Based on single factor test,an orthogonal design was applied to optimize extraction process.Comparison of the two methods was evaluated for extraction results.The optimum results for the extraction of flavonoids were achieved by ethanol and pectinase assistant extraction. The subsidiary conditions were as follows:additional amount of pectinase 300 U/g,extraction solvent 80%(v/v)ethanol,temperature 55 ℃,pH value 5.5,time 2.0 h and the substrate concentration 45 g/L.The optimum conditions of organic solvent were found to be extraction at 55 ℃ for 2.5 h using 80% aqueous ethanol with a solid-to-liquid ratio of 1∶20(g/mL).The highest extraction yield and purity of pectinase enzymolysis method were 4.98% and 12.60%,much higher than 3.05% and 8.92% of traditional extraction by organic solvent. Meanwhile,the extraction of enzymatic method revealed stronger antioxidant activity. The results of experiment indicated that the pectinase enzymolysis method was superior to traditional extraction by organic solvent.

jackfruit peel;flavonoids;extraction;antioxidant activity

2016-11-30

段宙位(1985-)，男，碩士，助理研究員，研究方向：營(yíng)養(yǎng)與功能食品研究，E-mail:universeduan@163.com。

*通訊作者:謝輝(1975-)，男，碩士，副研究員，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與保鮮，E-mail:790586793@qq.com。

海南省省屬科研院所技術(shù)開(kāi)發(fā)研究專項(xiàng)(KYYS-2015-10)。

TS255.3

B

1002-0306(2017)10-0242-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.038