基于抗血栓作用的油茶枯餅藥物制備物質(zhì)量表征分析＊

王亞利，張小茜，李林福，武秋紅，路東波，李文霞，石任兵,3＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局中藥經(jīng)典名方有效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)重點實驗室北京100102；2.北京市藥品檢驗所北京102206；3.北京市教委中藥質(zhì)量控制技術(shù)工程中心北京100102）

基于抗血栓作用的油茶枯餅藥物制備物質(zhì)量表征分析＊

王亞利1，張小茜2，李林福1，武秋紅1，路東波1，李文霞1，石任兵1,3＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院國家中醫(yī)藥管理局中藥經(jīng)典名方有效物質(zhì)發(fā)現(xiàn)重點實驗室北京100102；2.北京市藥品檢驗所北京102206；3.北京市教委中藥質(zhì)量控制技術(shù)工程中心北京100102）

目的：優(yōu)選油茶枯餅抗血栓藥效的最佳藥物制備物形式，為篩選油茶枯餅相關(guān)抗血栓藥物奠定研究基礎(chǔ)。方法：采用本課題組前期建立的HPLC-PDA分析法測定油茶枯餅制備物中主要指標(biāo)性成分的含量、含量相對比值、相對量以及出膏率，結(jié)合其抗血栓藥效作用，對油茶枯餅各藥物制備物的質(zhì)量進(jìn)行分析。結(jié)果：3種油茶枯餅制備物的抗血栓作用強(qiáng)弱順序為：富集物＞醇提物＞水提物。與醇提物與水提物相比，油茶枯餅富集物的有效指標(biāo)性成分含量更高，出膏率更低，給藥量更小，抗血栓作用更強(qiáng)。結(jié)論：通過分析有效成分的含量、比例等指標(biāo)，對藥物體系組成的進(jìn)行質(zhì)量分析可知，藥效的顯著提高得益于制備物中各藥效指標(biāo)成分含量的提高及配比的優(yōu)化。

油茶枯餅藥物體系質(zhì)量考量藥學(xué)-藥效

油茶Camellia oleifera Abel為多年生木本油料作物，是中國特有的樹種。油茶籽經(jīng)壓榨制成的油茶油具有清熱解毒、活血散瘀、止痛等功效[1]。油茶枯餅為油茶籽榨油后的剩余物。近年來的文獻(xiàn)報道顯示，油茶枯餅具有抗氧化、抑菌、抗腫瘤、殺蟲等多種藥理活性[2-5]。本課題組前期研究采用腹腔注射家角叉菜膠復(fù)制大鼠血栓模型[6]，通過研究發(fā)現(xiàn)山柰酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、山柰酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷、Canelliasaponin B1、腺苷、腺嘌呤為其發(fā)揮抗血栓作用的主要藥效成分。通過運用本課題組建立的基于藥物體系質(zhì)量評價模式[7-11]，測定油茶枯餅藥物制備物5種藥效成分的含量，確定其在不同制備物中的含量變化。以藥效相關(guān)度作為主要評價標(biāo)準(zhǔn)，提高藥效成分的含量，通過制備使組成比例更加合理，并進(jìn)行藥物制備物“藥學(xué)-藥效”質(zhì)量表征，以確定其具有最佳藥效的藥物制備物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters 2695高效液相色譜儀、Empower Pro軟件系統(tǒng)（上海沃特世科技有限公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；HH-S6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；Sartorius BT25S型十萬分之一電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.1.2 試劑與藥品

山柰酚3-O-[2-O-β-D-木糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷對照品（實驗室自制，批號：20160110，純度≥98%，下文簡稱為“黃酮a”）、山柰酚3-O-[2-O-β-D-半乳糖-6-O-α-L-鼠李糖]-β-D-葡萄糖苷對照品（實驗室自制，批號20160110，純度≥98%，下文簡稱“黃酮b”）；腺嘌呤對照品（北京鼎國公司，批號：150509）、腺苷對照品（北京鼎國公司，批號：KM0529CA14）；CamelliasaponinB1對照品（實驗室自制，批號：20160316，純度≥98%）。甲醇（色譜級，F(xiàn)isher Scientific公司），95%酒精（匯?？苾x科技有限公司），純凈水，其余試劑均為分析純。

角叉菜膠（美國Sigma公司，批號：C1013-25 g）；金納多（德國威瑪舒培博士藥廠，批號：6701014）；生理鹽水（山東華魯制藥有限公司，批號：C13040602）；水合氯醛（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號：20120720）。

油茶枯餅的產(chǎn)地為湖南潤農(nóng)生態(tài)茶油有限公司（批號：20140118），保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)系。油茶枯餅3種制備物分別為按照油茶枯餅制備工藝對油茶枯餅藥材進(jìn)行水提取得到油茶枯餅水提取物、醇提取得到油茶枯餅醇提取物和大孔吸附樹脂純化得到油茶枯餅富集物（由醇提取物富集即得）。

1.1.3 實驗動物及分組情況

180-210 g SPF級SD大鼠48只，雌雄各半（北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司），許可證號：SCXK（京）2012-0001。將實驗動物隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥組、水提物組、醇提物組、富集物組，每籠4只，每組雌雄各1籠。飼養(yǎng)溫度：25℃，濕度40%-55%。

1.2 實驗方法

1.2.1 油茶枯餅藥物制備物有效指標(biāo)性成分含量測定方法考察

在課題組前期建立的含量測定方法基礎(chǔ)上（另發(fā)表）考察其方法學(xué)并進(jìn)行含量測定[12]。

（1）酸性色譜條件

Waters XbridgeTMshield C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長為265 nm（黃酮a，黃酮b），203 nm（皂苷）。流速：1.0 mL·min-1，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：20 μL。流動相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B），洗脫梯度：10%-15.5%A（0-8 min），15.5%-15.5%A（8-16 min），15.5%-37.4%A（16-35 min），37.4%-37.4%A（35-61 min），37.4%-45%A（61-70 min），45%-45%A（70-85 min），45%-60%A（85-90 min）。

（2）中性色譜條件

Waters Xbridge shield RP18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測波長為260 nm（腺嘌呤、腺苷）；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：50 μL。流動相甲醇（A）-水（B），洗脫梯度，5%-5%A（0-12 min）；，5%-31%A（12-25 min）；，31%-31%A（25-30 min)；流速：0.9 mL·min-1。

（3）配制混合對照品溶液

精密稱取各對照品適量，制得含黃酮a、黃酮b、Camelliasaponin B1質(zhì)量濃度分別為0.069 6、0.062 2、0.086 8 mg·mL-1的混合對照品溶液Ⅰ，同法制成含腺苷、腺嘌呤質(zhì)量濃度分別0.006 064、0.002 142 mg·mL-1的混合對照品溶液Ⅱ，兩種對照品溶液均用0.45 μm微孔濾膜濾過，備用。

（4）配制供試品溶液

精密稱取油茶枯餅醇提取物適量，置10 mL棕色容量瓶中，50%甲醇溶解并定容（用于酸性系統(tǒng)下的含量測定），20%甲醇溶解并定容（用于中性系統(tǒng)下的含量測定），搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，備用。由圖1可知，供試品各峰在其測定波長下分離度良好。

1.2.2 抗血栓藥效學(xué)實驗方法

采用致血栓動物模型，給藥組大鼠以每組規(guī)定的藥液灌胃，空白組和模型組灌胃等體積蒸餾水，連續(xù)給藥6天。第7天灌胃1 h后除空白組不作處理外，其余各組動物均予以大鼠皮下注射角叉菜膠溶液造模。灌胃1 h后以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，測定大鼠黑尾長度，之后腹主動脈取血，置于檸檬酸鈉抗凝管，4℃，3 500 r·min-1，離心15 min，分離血漿，用放免法測定血漿中血栓素（Thromboxane，TXB2）和六酮前列腺素（6-keto-prostaglandin F1alpha，6-keto-PGF1a）的含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

2 結(jié)果與分析

2.1 基于抗血栓藥效學(xué)作用結(jié)果

通過檢測血漿中TXB2和6-keto-PGF1a指標(biāo)的含量，探究在相同生藥量下油茶枯餅各制備物對血栓療效的強(qiáng)弱。由表1可知，模型組大鼠黑尾現(xiàn)象明顯，各生化指標(biāo)性與正常組比較有顯著性差異（P＜0.01）。富集物組黑尾長度、TXB2和6-keto-PGF1a與模型組有顯著性差異（P＜0.01），說明其具有顯著的抗血栓藥理作用；醇提物和水提物也有相應(yīng)療效，富集物藥效最強(qiáng)，其次為稀醇提取物，水提物的藥效最弱。通過比較富集物組與陽性藥組結(jié)果可知，TXB2和6-keto-PGF1a的含量均低于陽性藥組，表明其對TXB2和6-keto-PGF1a有良好的作用效果（表1）。

圖1 油茶枯餅稀醇提取物的HPLC色譜圖

表1 油茶枯餅制備物抗血栓藥效結(jié)果（xˉ±s,n=8）

表2 不同藥物制備物形式中5種有效指標(biāo)性成分的平均含量/%（n=3）

2.2 質(zhì)量評價體系

2.2.1 有效指標(biāo)性成分含量分析

精密稱取適量油茶枯餅藥材及3種制備物，采用指標(biāo)成分含量測定方法，對各制備物中指標(biāo)成分的含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，指標(biāo)成分在油茶枯餅富集物中的含量顯著提高（表2）。

2.2.2 各種類制備物出膏率質(zhì)量分析

換算為相同生藥量進(jìn)行分析，計算得到各制備物出膏率及其相對比值，其中水提物出膏率最大，富集物的出膏率最小（表3）。

表3 制備物的出膏率及其相對比值

2.2.3 各指標(biāo)性成分相對含量質(zhì)量分析

以藥材中5種具有抗血栓藥效的指標(biāo)性成分的量為1，在相同生藥量下，基于指標(biāo)性成分的含量和各制備物出膏率，分析各有效指標(biāo)性成分的相對制備含量（即含量×出膏率），其結(jié)果顯示油茶枯餅3中制備物中其指標(biāo)性成分都有所減少（表4）。

2.2.4 含量相對比值質(zhì)量分析

以腺嘌呤含量為參比，將腺嘌呤含量設(shè)為1。與腺嘌呤比較，其他4種主要指標(biāo)性成分所占有比例高低順序為：富集物＞醇提物＞水提物＞藥材。該順序與其抗血栓的藥效強(qiáng)弱一致（表5）。

2.3 基于“藥學(xué)—藥效”對油茶枯餅藥物制備物的質(zhì)量分析

2.3.1 基于油茶枯餅有效指標(biāo)性成分含量分析

各指標(biāo)性成分在不同制備物中的含量有相應(yīng)不同程度變化。以藥材為基準(zhǔn)，其他三種藥物制備物中所含指標(biāo)性成分與藥材相比結(jié)果如下：富集物中5種指標(biāo)性成分的含量變化幅度為：Camelliasaponin B1（5.36）＞黃酮b（5.16倍）＞黃酮a（4.97倍）＞腺苷（3.84倍）＞腺嘌呤（3.31倍）。與水提取物比較，富集物中5種指標(biāo)性成分的含量變化幅度為：Camelliasaponin B1（3.18）＞黃酮b（2.63倍）＞黃酮a（2.44倍）＞腺苷（2.15倍）＞腺嘌呤（1.61倍）。與稀醇提取物相比，富集物中5種指標(biāo)性成分的含量變化幅度為：Camelliasaponin B1（2.08）＞黃酮b（2.02倍）＞黃酮a（1.96倍）≈腺嘌呤（1.96倍）＞腺苷（1.92倍）。通過上述比例結(jié)果分析可知，設(shè)計優(yōu)化油茶枯餅藥物提取富集工藝時，重點關(guān)注并有目的地提高增幅大的各指標(biāo)性成分含量。進(jìn)一步針對藥物藥學(xué)和藥效兩方面進(jìn)行質(zhì)量分析。結(jié)果表明，通過不同的制備過程，個制備物中指標(biāo)性成分比例增大時，其抗血栓作用也有明顯的提升（圖2）。

2.3.2 基于油茶枯餅有效指標(biāo)性成分含量相對比值分析

以腺嘌呤含量為參比（即其含量設(shè)為1），分析不同藥物制備物形式中5種有效指標(biāo)性成分含量與腺嘌呤含量的比值（圖3）。結(jié)合藥效分析，油茶枯餅藥物通過制備優(yōu)化其有效成分比例后，藥效也會相應(yīng)提高。由此可知，在藥物制備過程中，提高藥效應(yīng)不但需要提高有效成分含量，同時也應(yīng)該合理的優(yōu)化各藥效指標(biāo)成分間的配比。

表4 基于有效指標(biāo)性成分相對制備量的油茶枯餅藥物制備物質(zhì)量考量

表5 基于有效指標(biāo)性成分含量相對比值的油茶枯餅藥物制備物質(zhì)量表征

圖2 油茶枯餅藥物制備物中5種有效指標(biāo)性成分含量變化

圖3 油茶枯餅藥物制備物中有效指標(biāo)性成分含量相對比值的變化

2.3.3 基于藥物制備物的出膏率分析

由表3可知，在相同生藥量的條件下，油茶枯餅藥物制備物的出膏率很小。實驗結(jié)果顯示，稀醇提取物、水提物、藥材分別是其富集物出膏率的2.7倍、2.3倍、13倍。基于其抗血栓藥效，對藥物制備物進(jìn)行質(zhì)量分析的結(jié)果顯示，服用量最小的油茶枯餅富集物的藥效卻強(qiáng)于其他2種制備物。由此可知，在藥物制備過程中，藥物有效指標(biāo)成分通過有效富集可以在一定程度上提高藥效。

2.3.4 基于油茶枯餅有效指標(biāo)性成分的相對制備量分析

基于相同生藥量，雖然藥物在制備過程中各指標(biāo)性成分轉(zhuǎn)移量有所不同（圖4），但不會對其藥效有明顯影響。

綜上所述，為了保證油茶枯餅藥物制備物的抗血栓藥效，在制備過程中不僅需要優(yōu)化各成分的含量，而且需要使其相對比值更加合理。在相同生藥量給藥的情況下，相對于油茶枯餅藥材、水提取物、稀醇提取物，油茶枯餅富集物所需服用量更小。在確保藥物體系完整性的前提下，制備過程提高了油茶枯餅抗血栓藥效成分的含量，各指標(biāo)性成分的相對比值也得到進(jìn)一步優(yōu)化，因而其抗血栓藥效得到顯著提高。因此，油茶枯餅抗血栓藥物的最佳制備物是油茶枯餅富集物。

圖4 油茶枯餅藥物制備物各成分相對含量的變化

3 結(jié)語

以藥物體系為導(dǎo)向，藥物在治療某一病癥時是一個有機(jī)的整體，不能將主要成分與其藥效成分相混淆，更不能籠統(tǒng)地認(rèn)為其中所有化學(xué)成分都發(fā)揮治療作用，而要結(jié)合油茶枯餅的抗血栓作用進(jìn)行“藥學(xué)-藥效”關(guān)聯(lián)質(zhì)量分析[13-16]。首先，本研究確定了油茶枯餅的有效部位、有效成分群，通過比較各種制備物形式間的出膏率、指標(biāo)成分含量及相對比例，得出油茶枯餅抗血栓藥效的最佳制備物是油茶枯餅富集物。在藥效指導(dǎo)下制備油茶枯餅藥物制備物，首先要保證藥物體系的完整性，其次要提高有效指標(biāo)性成分的含量，并對各成分間的比例進(jìn)行優(yōu)化，才能大幅提高藥效。因此，本研究對得到油茶枯餅優(yōu)質(zhì)藥物制備物具有一定的參考價值。

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Drug Quality Characterization Consideration of Preparations of Oil Tea Camellia Defatted Cake based onAntithrombotic Effect

Wang Yali1,Zhang Xiaoqian2,Li Linfu1,Wu Qiuhong1,Lu Dongbo1,Li Wenxia1,Shi Renbing1,3
(1.Key Unit of Exploring Effective Substances of Classical and Famous Formulas of the State Administration of Traditional Chinese Medicine,School of Chinese Materia Medica,Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102,China;2.Beijing Institute for Drug Control,Beijing 102206,China; 3.Quality Control Technology and Engineering Center of Chinese Medicine,Beijing Municipal C ommission of Education Beijing 100102,China)

This study was aimed to select the best preparation form of medicinal in camellia cake,based on the optimal antithrombotic agents in oil tea camellia defatted cake to establish the foundation of research.The content of effective index component of the oil tea camellia defatted cake preparation was detected by HPLC-PDA.The quality of medicinal preparation from oil tea camellia defatted cake was characterized based on the content,relative quantity,relative ratio of content,yield rate and antithrombotic effect.The results showed that the effect of antithrombotic of three medicinal preparations from oil tea camellia defatted cake was listed in the following descending order of enrichment,ethanol extract,and water extract.The enrichment was the best preparation form of medicinal in oil tea camellia defatted cake preparation with the highest content of effective index components,the lowest extract rate and the lowest dosage.But it had the best effect of antithrombotic.It was concluded that the significant improvement of efficacy was due to the increase of the content of the components in the preparation and the rationality of the proportion.At the same time, analysis of component quality based on basic composition of drug system through the consideration of effective components of type and quantity,composition and other quality factors can further guide the preparation of drugs.

Oil tea camellia defatted cake,drug system,quality consideration,pharmacy-efficacy

10.11842/wst.2017.03.021

R284

A

（責(zé)任編輯：馬雅靜，責(zé)任譯審：王晶）

2017-01-15

修回日期：2017-02-26

＊北京中醫(yī)藥大學(xué)重點學(xué)科開放課題（2013-ZDXKKF-23）：中藥特性化學(xué)，主持人：石任兵。

＊＊通訊作者：石任兵，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要研究方向：中藥（復(fù)方）藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥物創(chuàng)新研究。