橙皮苷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化及ICAM-1表達(dá)的影響＊

傅明明，郭姣

（廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局高脂血癥調(diào)肝降脂重點(diǎn)研究室/脂代謝三級(jí)實(shí)驗(yàn)室/廣東省代謝性疾病中西醫(yī)結(jié)合研究中心廣州51006）

橙皮苷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化及ICAM-1表達(dá)的影響＊

傅明明，郭姣＊＊

（廣東藥科大學(xué)中醫(yī)藥研究院國(guó)家中醫(yī)藥管理局高脂血癥調(diào)肝降脂重點(diǎn)研究室/脂代謝三級(jí)實(shí)驗(yàn)室/廣東省代謝性疾病中西醫(yī)結(jié)合研究中心廣州51006）

目的：探討橙皮苷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化及細(xì)胞間黏附因子-1表達(dá)的影響。方法：體外培養(yǎng)RAW264.7巨噬細(xì)胞，橙皮苷作用于未經(jīng)誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞及ox-LDL(50 μg·mL-1）誘導(dǎo)后的RAW264.7巨噬細(xì)胞，將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、ox-LDL模型組和橙皮苷給藥組。MTT法檢測(cè)不同濃度的橙皮苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞活性的影響；用油紅O染色觀察橙皮苷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞內(nèi)脂類(lèi)堆積與泡沫細(xì)胞形成。觀察橙皮苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化的影響；免疫印跡法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞中ICAM-1的蛋白表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢測(cè)RAW264.7巨噬細(xì)胞中ICAM-1的mRNA表達(dá)。結(jié)果：橙皮苷濃度大于或等于5 μM時(shí)，RAW264.7巨噬細(xì)胞存活率大于80%。橙皮苷抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化。橙皮苷能減少泡沫細(xì)胞的ICAM-1蛋白表達(dá)水平。橙皮苷能減少泡沫細(xì)胞ICAM-1 mRNA表達(dá)水平。結(jié)論：橙皮苷能抑制RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化及ICAM-1的蛋白和mRNA表達(dá),提示橙皮苷具有抗動(dòng)脈粥樣硬化臨床應(yīng)用價(jià)值。

橙皮苷RAW264.7巨噬細(xì)胞ICAM-1泡沫細(xì)胞

動(dòng)脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是一個(gè)復(fù)雜的多因素漸進(jìn)性慢性炎癥過(guò)程，單核細(xì)胞穿過(guò)動(dòng)脈內(nèi)皮層進(jìn)入內(nèi)膜并且吞噬脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞是其形成的重要環(huán)節(jié)，細(xì)胞間黏附因子-1（Intercellular Cell Adhesion Molecule-1，ICAM-1）在這一環(huán)節(jié)中起著重要作用[1，2]。橙皮苷（Hesperidin）是一種生物類(lèi)黃酮，主要存在在各種柑橘類(lèi)水果中，也是中藥佛手的主要活性成分[3]。研究表明，橙皮苷能降低人體的膽固醇水平，而且對(duì)血管通透性，脆性和對(duì)各種創(chuàng)傷和應(yīng)激也有一定的保護(hù)作用[3，4]，但橙皮苷對(duì)AS的作用及其作用機(jī)制未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究旨在通過(guò)觀察橙皮苷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化及ICAM-1表達(dá)的影響來(lái)探討其防治AS的作用及可能機(jī)制，為臨床防治AS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試藥

3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；SW-CF-1FD型超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；940型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；TC9600-G-230V型多功能梯度PCR儀（深圳市賽泰克生物科技有限公司）；3111型PikoReal熒光定量PCR儀（中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；BX51TRF型顯微鏡（日本Olympus公司）。

ICAM-1抗體（美國(guó)R&D公司，批號(hào)：GRG0216011）；DMEM培養(yǎng)基和澳洲胎牛血清（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：8116107）；Trizol RNA提取試劑盒和PrimeScriptTMRT Reagant Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司，批號(hào)：AK3601）；ox-LDL（廣州奕源生物科技有限公司，批號(hào)：160511）；橙皮苷（純度≥97.0%，美國(guó)Sigma公司，批號(hào)：BCBQ5716V），化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)中所用細(xì)胞為RAW264.7巨噬細(xì)胞株。細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，加入10%胎牛血清（Fatal Bovine Serun，F(xiàn)BS），在含5%CO2的細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞傳代。將RAW264.7巨噬細(xì)胞分為3組：分別是空白對(duì)照組、模型組和橙皮苷給藥組。用DMSO配制橙皮苷母液，使用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋至所需濃度；ox-LDL使用前用DMEM培養(yǎng)基稀釋到50 μg·mL-1。各組細(xì)胞按各自條件CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育24 h，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。根據(jù)橙皮苷給藥濃度根據(jù)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將RAW264.7細(xì)胞存活率大于80%的最高藥液濃度作為橙皮苷給藥組的最高濃度。

1.3 MTT法檢測(cè)橙皮苷對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的存活率的影響

將RAW264.7巨噬細(xì)胞接種在96孔板上，分為空白組、對(duì)照組和橙皮苷不同劑量（100、50、25、10、5、2.5、1 μM）給藥組，每組平行設(shè)5個(gè)孔，每孔100 uL，置于5%CO2培養(yǎng)箱中37℃孵育24 h后，移去培養(yǎng)上清液，避光加入10 μL MTT溶液（5 mg·mL-1）孵育4 h后除去上清，加入150 μL DMSO溶劑后振蕩10 min，使甲臢充分溶解。用酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔光吸收值。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，確定藥物安全濃度范圍。

1.4 油紅O染色

將細(xì)胞接種在鋪有蓋玻片的六孔板中，給藥24 h后，移除培養(yǎng)基，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定10 min。將固定好的細(xì)胞用PBS沖洗3次，60%異丙醇潤(rùn)洗1遍。將1%油紅O原液與純水按3∶2比例混合過(guò)濾后加入孔中，避光染色15 min，60%異丙醇洗1遍，純水洗1次，然后用水溶性封片劑封片，光學(xué)顯微鏡下觀察拍照。

圖1 橙皮苷的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.5 免疫印跡法

將處理好的細(xì)胞取出培養(yǎng)箱，移去培養(yǎng)基，冰PBS洗3次，加入RIPA裂解液，冰上靜置30 min，裂解完成后，用細(xì)胞刮板將裂解液盡量刮下，4℃12000 rpm離心30 min，吸取上清移至新管。用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒定量蛋白定量。以最低濃度一組為基準(zhǔn)，將蛋白樣品調(diào)至統(tǒng)一濃度后，加入上樣緩沖液，于100℃變性10 min。用10%SDS-PAGE進(jìn)行電泳；然后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，1×TBST洗3次，每次10 min，用5%的脫脂奶粉在室溫下封閉1 h，用1×TBST洗3次后加入一抗（ICAM-1抗體，1∶10 000，1×TBST稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。次日，加入二抗（辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的兔抗羊（IgG 1∶10 000，1×TBST稀釋?zhuān)覝胤跤? h。孵育結(jié)束后，1×TBST洗3次，用化學(xué)發(fā)光法成像儀曝光成像。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

RAW264.7巨噬細(xì)胞按上述分組作用24 h后，傾去培養(yǎng)液，冰PBS洗3次，Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，溶于DEPC水中，-80℃保存。按Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒10 μL體系試劑盒要求進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。選擇β-actin作為內(nèi)參,按Takara要求的加樣體系進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。引物由蘇州泓迅生物科技有限公司設(shè)計(jì)合成。ICAM-1上游引物：5′-TCCGCTACCATCACCGTGTAT-3′；下游引物：5′-TAGCCAGCACCGTGAATGTG-3′。β-actin上游引物：5′-ATGGAGGGGAATACAGCCC-3′；下游引物：5′-TTCTTTGCAGCTCCTTCGTT-3′。TNF-α上游引物：5'-AGGGTCTGGGCCATAGAACT-3′；下游引物：5′-CCACCACGCTCTTCTGTCTAC-3′。IL-1β上游引物：5′-TGCCACCTTTTGACAGTGATG-3′；下游引物：5′-ATGTGCTGCTGCGAGATTTG-3′。IL-6上游引物：5′-ACCAGAGGAAATTTTCAATAGGC-3′。下游引物：5′-TGATGCACTTGCAGAAAACA-3′。反應(yīng)程序：預(yù)變性：95℃10 min；循環(huán)中95℃變性30 s；退火60℃30 s,40個(gè)循環(huán)，溶解曲線分析，測(cè)得的Ct值采用2-△△CT采法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，采用Graphpad prism 6軟件進(jìn)行單因素方差樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MTT法確定橙皮苷作用于RAW264.7巨噬細(xì)胞的安全用藥范圍

RAW264.7細(xì)胞經(jīng)不同濃度的橙皮苷處理后，觀察藥物對(duì)細(xì)胞的毒性程度，存活率小于80%視為此藥物濃度對(duì)細(xì)胞有毒性[5-7]。圖2顯示橙皮苷在濃度大于5 μM時(shí)，細(xì)胞存活率小于80%，對(duì)細(xì)胞有毒性作用（P＜0.01）。橙皮苷在濃度1-5 μM時(shí)，細(xì)胞存活率大于80%，與空白對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異。因此選取5 μM作為細(xì)胞給藥最高濃度，并在此濃度基礎(chǔ)上用DMEM培養(yǎng)基對(duì)橙皮苷倍比稀釋?zhuān)罱K確定1 μM、2.5 μM和5 μM作為細(xì)胞給藥濃度。

2.2 橙皮苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化的影響

油紅O染色后在顯微鏡下觀察顯示，空白對(duì)照組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)無(wú)脂滴堆積（圖3A）。采用50 μg·mL-1ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞24 h后，模型組細(xì)胞出現(xiàn)大量脂質(zhì)堆積（圖3A），符合泡沫細(xì)胞的形態(tài)特點(diǎn)，與空白組對(duì)照組相比有顯著性差異（P＜0.0001）。相比之下，經(jīng)過(guò)橙皮苷（1-5 μM）處理后的RAW264.7細(xì)胞脂滴聚集的現(xiàn)象大幅度減輕，說(shuō)明橙皮苷可顯著抑制ox-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞泡沫化（P＜0.05，P＜0.01)。

2.3 橙皮苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)ICAM-1蛋白表達(dá)水平（圖5）。結(jié)果表明用ox-LDL（50 μg·mL-1）誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞的24 h后，ox-LDL模型組ICAM-1的蛋白表達(dá)高于空白組。但給予橙皮苷（1-5 μM）干預(yù)后，能降低ICAM-1蛋白的表達(dá)水平（P＜0.01，P＜0.001），說(shuō)明橙皮苷能抑制ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞ICAM-1蛋白的表達(dá)。

2.4 橙皮苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞ICAM-1、TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA表達(dá)的影響

逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)結(jié)果表明50 μg·mL-1ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞24 h后，ox-LDL模型組中ICAM-1mRNA的表達(dá)高于空白組，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著差異（P＜0.001）。但給予橙皮苷（1-5 μM）干預(yù)后能顯著降低ICAM-1 mRNA的表達(dá)水平，與模型組比較，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，P＜0.001）。巨噬細(xì)胞泡沫化會(huì)釋放炎性因子，如TNF-α、IL-1β和IL-6，在組織炎性反應(yīng)和病理過(guò)程中起重要作用，可加速AS斑塊的炎性反應(yīng)[8,9]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給予橙皮苷（1-5 μM）干預(yù)后也能抑制炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)（圖5B-C）。

圖2 MTT法檢測(cè)橙皮苷對(duì)RAW264.7細(xì)胞生長(zhǎng)活性的影響

圖3 RAW264.7巨噬細(xì)胞油紅O染色結(jié)果（n=3）

3 討論

在20世紀(jì)90年代初，羅斯博士提出了AS的慢性炎癥假說(shuō)[8]。他在1999年更進(jìn)一步清楚地認(rèn)為AS是一種炎癥性疾病[9]。隨著越來(lái)越多的炎癥細(xì)胞和介質(zhì)不斷地被檢測(cè)到，AS不再被認(rèn)為是一種脂質(zhì)沉積到動(dòng)脈壁上的簡(jiǎn)單疾病，而是血管壁內(nèi)的進(jìn)行性炎癥反應(yīng)[10]。在危險(xiǎn)因素如高膽固醇血癥、胰島素抵抗或肥胖等持續(xù)作用，內(nèi)皮細(xì)胞中粘附分子表達(dá)增加，促使單核細(xì)胞與動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞間的粘附能力增強(qiáng)，導(dǎo)致單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有吞噬作用的巨噬細(xì)胞，攝取脂質(zhì)（主要是ox-LDL）形成泡沫細(xì)胞，致使AS早期的脂質(zhì)條紋形成[11,12]。泡沫細(xì)胞壞死釋放出脂質(zhì)形成脂核，進(jìn)一步形成斑塊，被活化的細(xì)胞釋放促炎癥因子，導(dǎo)致慢性炎癥和斑塊的不穩(wěn)定性，并進(jìn)一步發(fā)展為斑塊破裂和繼發(fā)性血栓形成，甚至引發(fā)急性臨床事件，造成嚴(yán)重后果[2,13]。所以，巨噬細(xì)胞的泡沫化是AS形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化過(guò)程的干預(yù)，可以起到防治AS的效果[14]。

ICAM-1是I型跨膜糖蛋白，屬于免疫球蛋白（Ig）超家族。它存在于AS病變中并且參與AS病變的進(jìn)展。在AS斑塊的形成過(guò)程中，單核細(xì)胞對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附是前者進(jìn)入內(nèi)皮下間隙進(jìn)而轉(zhuǎn)變?yōu)榕菽?xì)胞的關(guān)鍵步驟[1,15]。研究表明ICAM-1在細(xì)胞表面上的交聯(lián)導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并導(dǎo)致幾種促炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，引起更加嚴(yán)重的病變[15]。

圖4 橙皮苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞ICAM-1蛋白表達(dá)的影響

圖5 橙皮苷對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞ICAM-1、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

橙皮苷是一種柑橘類(lèi)水果中含量豐富的生物黃酮類(lèi)化合物。近年來(lái)因其多樣的生物活性引起了許多研究者的關(guān)注[16]。研究顯示橙皮苷具有維持患者滲透壓、增強(qiáng)患者毛細(xì)血管的韌性、降低膽固醇等方面作用[17,18]。越來(lái)越多報(bào)道橙皮苷對(duì)心血管疾病有改善作用[19-21]。最近研究表明橙皮苷可劑量依賴(lài)性地調(diào)節(jié)高脂血癥模型大鼠血脂水平及血液粘滯狀態(tài),提示橙皮苷對(duì)防治高脂血癥具有積極作用[22]。

本實(shí)驗(yàn)采用巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞作為研究對(duì)象，并通過(guò)oxLDL刺激活化巨噬細(xì)胞。結(jié)果顯示，橙皮苷（1-5 μM）能有效地抑制巨噬細(xì)胞的泡沫化并能明顯降低RAW264.7細(xì)胞中ICAM-1的蛋白和mRNA水平的表達(dá)，從而可能抑制巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附，減少細(xì)胞泡沫化。本研究提示橙皮苷可能通過(guò)抑制ICAM-1表達(dá)來(lái)發(fā)揮其抗巨噬細(xì)胞泡沫化作用，為深入研究橙皮苷對(duì)于AS發(fā)病機(jī)制和防治提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Effects of Hesperidin on RAW264.7 Foam Cell FormationAnd Expression of ICAM-1

Fu Mingming,Guo Jiao
(Key Laboratory of Regulating Liver to Low Lipid for Hyperlipidemia Treatment/Third-level Lipid Metabolism Laboratory,State Administration of Traditional Chinese Medicine,Institute of Chinese Medical Sciences, Guangdong Pharmaceutical University/Guangdong Metabolic Disease Research Center of Integrated Chinese and Western Medicine Institute of Chinese and Western Medicine,Guangzhou 510006,China)

This study was aimed to investigate the effects of hesperidin on the macrophage foam cell formation in RAW264.7 cells and the expression of ICAM-1.RAW264.7 cells were culture in vitro and induced by oxLDL(50 μg·mL-1). Furthermore,cells were separated into the control group,oxLDL model group and hesperidin treatment group.The effect of hesperidin on cell viability in RAW264.7 was assessed by MTT assay.Oil Red O staining was examined by foam cells formation.Effect of hesperidin on protein expression of ICAM-1 was analyzed by western blot.In addition,the effect of hesperidin on mRNA expression of ICAM-1 was assessed by RT-PCR.The results showed that the viability should been over 80%after less than or equal to 5 μM hesperidin treatment.Hesperidin decreased the protein expression of ICAM-1 in RAW264.7 cells.Additionally,hesperidin suppressed the mRNA expression of ICAM-1 in RAW264.7 cells.It was concluded that hesperidin can inhibit foam cell formation and the expression of ICAM-1 in RAW264.7 cells.It suggested that hesperidin protect against atherosclerosis.

Hesperidin,RAW264.7 cells,ICAM-1,foam cells

10.11842/wst.2017.03.015

R285.5

A

（責(zé)任編輯：郭嫦娥，責(zé)任譯審：王晶）

2017-03-11

修回日期：2017-03-17

＊廣東省科學(xué)技術(shù)廳2015年度省協(xié)同創(chuàng)新與平臺(tái)環(huán)境建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目（2015A050502050）：基于糖組學(xué)技術(shù)的組分中藥調(diào)節(jié)糖脂代謝的機(jī)制研究，負(fù)責(zé)人：郭姣；廣東省科學(xué)技術(shù)廳2016年省科技發(fā)展專(zhuān)項(xiàng)資金（協(xié)同創(chuàng)新與平臺(tái)環(huán)境建設(shè)方向）項(xiàng)目（2016B050501003）：代謝病中西醫(yī)結(jié)合防治國(guó)際合作基地建設(shè)，負(fù)責(zé)人：郭姣。

＊＊通訊作者：郭姣，博士，教授，主要研究方向：中西醫(yī)結(jié)合防治糖脂代謝病研究。