六氧化四砷對乳腺癌MCF—7細胞增殖、遷移 及侵襲能力的影響

劉秋雨+裴日周+錢林林+連增林

摘要：目的 觀察六氧化四砷（As4O6）對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、遷移及侵襲能力的影響，探討其作用機制。方法 體外培養(yǎng)人乳腺癌MCF-7細胞，不同濃度As4O6對細胞進行干預(yù)。MTT法檢測細胞增殖，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，劃痕愈合實驗檢測細胞遷移能力，半定量RT-PCR檢測細胞周期蛋白E1（Cyclin E1）、細胞周期蛋白A2（Cyclin A2）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）、p21和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）mRNA表達情況。結(jié)果 As4O6對MCF-7細胞增殖有明顯抑制作用，且呈劑量依賴性（P<0.01）；與對照組（0 μmol/L）比較，As4O6濃度為9、12、15 μmol/L時，MCF-7細胞凋亡率明顯增加（P<0.05，P<0.01）；As4O6高（3 μmol/L）、低（1 μmol/L）濃度均可有效抑制MCF-7細胞的遷移能力（P<0.01）；隨As4O6濃度增加，Cyclin E1、Caspase-3、p21 mRNA表達明顯升高，Cyclin A2、MMP-9 mRNA表達明顯降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 As4O6對乳腺癌MCF-7細胞增殖、周期、侵襲及遷移能力有明顯抑制作用，其機制可能與增強Cyclin E1、Caspase-3、p21及抑制Cyclin A2、MMP-9 mRNA表達有關(guān)。

關(guān)鍵詞：六氧化四砷；乳腺癌細胞；細胞凋亡；細胞增殖；侵襲；遷移；細胞周期

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.011

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）06-0044-05

Abstract： Objective To observe the effects of tetra-atsenic oxide （As4O6） on the proliferation， migration and invasion of human breast cancer MCF-7 cells； To explore its potential mechanism. Methods The human breast cancer MCF-7 cells were regarded as the research object and cultured in vitro， with different concentrations of As4O6 using to intervene in MCF-7 cells. The cell proliferation was detected by MTT assay； the flow cytometry and wound-healing assay were used to detect the cell apoptosis and migration， respectively. The expressions of Cyclin E1， Cyclin A2， Caspase 3， p21 and MMP-9 mRNA were accessed by semi quantitative RT-PCR. Results As4O6 had a significant inhibitory effect on the proliferation of MCF-7 cells in a dose dependent manner. Compared with the control group （0 μmol/L）， the apoptosis rate increased significantly when the concentration of As4O6 was 9， 12， 15 μmol/L （P<0.01）. Either As4O6 at high （3 μmol/L） or low （1 μmol/L） concentration could effectively inhibit the migration of MCF-7 cells （P<0.01）. With the increasing concentration of As4O6， the expressions of Cyclin E1， Caspase 3， and p21 mRNA significantly increased， while the expressions of Cyclin A2 and MMP-9 mRNA significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion As4O6 can significantly inhibit the proliferation， cycle， invasion and migration of breast cancer MCF-7 cells， and the mechanism may be related to the increase of expressions of cyclin E1， caspase 3， p21 and inhibition of expressions of cyclin A2 and MMP-9.

Key words： tetra-arsenic oxide； breast cancer cells； cell apoptosis； cell proliferation； invasion； migration； cell cycle

砷劑是古老的抗腫瘤藥物，以常見的氧化劑和硫化劑等形式存在。《本草綱目》載：“砒石又名信石、砒霜，可治爛肉、蝕瘀及腐瘰?！彪m然砷劑被沿用至今，但其毒性限制了其適用范圍。三氧化二砷（As2O3）是最廣為熟知的砷劑，臨床用于急性早幼粒細胞白血病及多種腫瘤的治療。六氧化四砷（As4O6）對子宮頸癌細胞[1]、人胃癌細胞[2]、上皮癌細胞[3]等均有一定抑制作用，但其對乳腺癌的干預(yù)研究鮮有報道。因此，本研究觀察不同濃度As4O6對人乳腺癌MCF-7細胞增殖、凋亡、周期和侵襲、遷移能力的影響，為As4O6干預(yù)乳腺癌的分子作用機制提供依據(jù)。endprint

1 實驗材料

1.1 細胞

人乳腺癌MCF-7細胞株，中國科學院上海細胞庫。

1.2 藥物及制備

As4O6，純度99.99%，韓國Chonjisan Co.， Ltd.公司。稱取一定量As4O6溶解于水中，配制成5 mmol/L母液，過濾，室溫保存?zhèn)溆?，臨用時以培養(yǎng)基稀釋至不同濃度。

1.3 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶、MEM培養(yǎng)液，Hyclone公司。MTT（Amresco）、二甲基亞砜（DMSO，Amresco）、青鏈霉素混合液（Solarbio）、RT-PCR試劑盒和Trizol，日本TaKaRa公司。Annexin V-FITC細胞凋亡試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司，引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司設(shè)計合成。FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司），YT-CJ-2ND型超凈工作臺（北京亞泰），MCO-175 CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO），BDS200倒置相差顯微鏡（奧特光學），MULTLSKAN MK3酶標儀（美國Thermo公司），BIOMATE型紫外可見分光光度計（美國Thermo公司），GE4852型PCR儀（杭州柏恒科技有限公司），Champ Gel 5000型全自動凝膠成像系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測MCF-7細胞增殖

取對數(shù)生長期的人乳腺癌MCF-7細胞株，0.25%胰酶消化后，用含10%FBS MEM培養(yǎng)液稀釋成2.5×104個/mL細胞懸液，以200 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。分別設(shè)置空白孔、調(diào)零孔和As4O6給藥孔。As4O6給藥濃度分別為4、8、16、32、64 μmol/L，200 μL/孔，每組設(shè)6個復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。每孔加5 mg/mL MTT溶液20 μL，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加100 μL DMSO，室溫振蕩15 min。待沉淀完全溶解后，于酶標儀570 nm處測定光密度（OD）。計算細胞存活率（實驗組OD值÷對照組OD值×100%）。

2.2 流式細胞術(shù)檢測MCF-7細胞凋亡

取對數(shù)生長期細胞，以1×105個/mL密度接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后加入含10%FBS MEM培養(yǎng)液稀釋的各濃度As4O6溶液（0、1、3、6、9、12、15 μmol/L）繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集所有細胞，嚴格按照Annexin V-FITC試劑盒說明書進行操作，流式細胞術(shù)檢測MCF-7細胞凋亡。

2.3 劃痕愈合實驗檢測MCF-7細胞遷移、侵襲能力

收集對數(shù)生長期MCF-7細胞，以2.5×105個/mL密度接種于6孔板中，2 mL/孔，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至細胞長滿培養(yǎng)板后，吸棄上清液，用10 μL吸頭在6孔板上劃“一”字，PBS輕輕沖洗2次。每孔分別加入不含F(xiàn)BS MEM培養(yǎng)液稀釋的各濃度As4O6溶液（0、1、3 μmol/L），各設(shè)3個復(fù)孔，100倍倒置顯微鏡下，分別于藥物作用0、24、48 h拍照。計算劃痕愈合率[（0 h劃痕面積-24/48 h劃痕面積）÷0 h劃痕面積×100%]。

2.4 RT-PCR檢測細胞周期、凋亡及遷移相關(guān)基因的表達

采用Trizol兩步法提取MCF-7細胞內(nèi)的總RNA，測定OD260/OD280值。按TaKaRa RT-PCR試劑盒說明合成cDNA第一鏈，以此cDNA為模板進行PCR反應(yīng)。PCR退火溫度及循環(huán)數(shù)：β-actin為58 ℃、30循環(huán)，p21為60.5 ℃、40循環(huán)，細胞周期蛋白E1（Cyclin E1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）為58 ℃、30循環(huán)，細胞周期蛋白A2（Cyclin A2）為57.7 ℃、40循環(huán)，基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）為60.5 ℃、45循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳。引物序列見表1。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，多組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

4 結(jié)果

4.1 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響

MTT法結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度As4O6干預(yù)后，MCF-7細胞生長受到明顯抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。隨As4O6濃度增加，MCF-7細胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴性，見圖1。

4.2 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)分別檢測了不同濃度As4O6對MCF-7細胞的凋亡作用，Annexin V-FITC/PI雙參數(shù)檢測顯示，細胞機械損傷程度非常小，細胞因機械損傷的數(shù)目很少（<1%）。當As4O6濃度為1、3、6 μmol/L時，細胞凋亡率均<10%，與對照組（0 μmol/L）比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。因此，在0～3 μmol/L間選擇適當濃度，研究As4O6對MCF-7細胞遷移侵襲作用的影響。隨As4O6濃度增加（9、12、15 μmol/L），細胞凋亡率升高，與0 μmol/L比較，細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見圖2。

4.3 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細胞遷移能力的影響

與0 μmol/L比較，低濃度（1 μmol/L）和高濃度（3 μmol/L）As4O6對MCF-7細胞的遷移能力均有明顯抑制作用（P<0.01），隨As4O6濃度增加，抑制作用明顯增強，呈劑量依賴性，見圖3。

4.4 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細胞凋亡和周期相關(guān)基因表達的影響endprint

瓊脂糖凝膠電泳法檢測凋亡（Caspase-3、p21）和周期（Cyclin A2、Cyclin E1）相關(guān)基因表達情況。結(jié)果表明，As4O6作用于MCF-7細胞24 h后，隨As4O6給藥濃度增加，Cyclin E1、p21 mRNA表達呈升高趨勢，Cyclin A2 mRNA表達呈遞減趨勢，呈劑量依賴性；在As4O6高濃度（15 μmol/L）時，Caspase-3、p21、Cyclin A2、Cyclin E1 mRNA表達水平與0 μmol/L比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖4。

4.5 六氧化四砷對乳腺癌MCF-7細胞基質(zhì)金屬蛋白酶-9基因表達的影響

MMP-9與侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，其mRNA表達隨As4O6濃度增加而逐漸降低。高濃度（15 μmol/L）As4O6與0 μmol/L比較，MMP-9 mRNA表達差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），見圖5。

5 討論

研究表明，As4O6可通過引起腫瘤細胞凋亡[4]、抑制腫瘤血管新生[5]、增加實體腫瘤對放射的敏感性[6]等多種方式發(fā)揮抗腫瘤藥效作用。但其對乳腺癌的作用機制尚不明確，而乳腺癌在全球女性癌癥患病率排名居首，迫切需要有效的治療藥物。因此，研究As4O6治療乳腺癌的作用機制十分必要。

細胞凋亡和周期是衡量腫瘤細胞的重要指標，細胞增殖和細胞凋亡之間的失衡也可導(dǎo)致腫瘤生成。本研究結(jié)果表明，As4O6對乳腺癌MCF-7細胞增殖抑制作用明顯，并隨As4O6濃度增加而增強，當濃度達到64 μmol/L時，細胞存活率<50%。當濃度為9、12、15 μmol/L時，作用于MCF-7細胞24 h可明顯引起凋亡。Caspase-3和p21是與細胞凋亡關(guān)系密切的2種基因，正常情況下細胞質(zhì)中Caspase-3無活性，以酶原形式存在，當細胞受到凋亡信號刺激時，它被一系列反應(yīng)激活后誘導(dǎo)細胞凋亡發(fā)生[7]。同時，p21基因的過表達可促進細胞凋亡，并可使細胞周期阻滯于G1、G2或S期。而本研究結(jié)果表明，隨As4O6濃度增加，Caspase-3和p21均呈增加趨勢，且流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明，MCF-7細胞凋亡情況與上述特點相符，提示As4O6可通過促進MCF-7細胞凋亡途徑達到抑制腫瘤細胞增殖目的。為進一步明確As4O6對MCF-7細胞的作用機制，本研究檢測了細胞周期相關(guān)基因（Cyclin A2和Cyclin E1）的表達情況。Cyclin A2為一種細胞周期的正向調(diào)節(jié)蛋白，可與細胞周期依賴性激酶（CDK1和CDK2）形成復(fù)合物，在細胞周期G1/S和G2/M轉(zhuǎn)換中發(fā)揮調(diào)節(jié)DNA合成和促進細胞有絲分裂的雙重作用，同時，Cyclin E1是G1期重要的調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵蛋白，促進細胞周期的G1/S移行過程，并且是移行過程中的主要限速因子，一旦Cyclin E1基因擴增或表達失控則可能誘發(fā)腫瘤[8-10]。本研究結(jié)果表明，As4O6可抑制Cyclin A2基因的表達，經(jīng)As4O6干預(yù)后，MCF-7細胞Cyclin A2表達顯著降低，表明As4O6可以通過干預(yù)細胞周期達到治療目的。而Cyclin E1與Cyclin A2的結(jié)果相反，As4O6干預(yù)后，MCF-7細胞Cyclin E1表達顯著升高，這一現(xiàn)象可能與細胞周期阻滯相關(guān)。因此，更加明確了As4O6對MCF-7細胞凋亡和周期相關(guān)基因的作用機制。

乳腺癌是由乳房組織病變導(dǎo)致的癌癥，由于乳腺癌細胞喪失了正常細胞的特性，細胞之間的黏附能力下降，容易發(fā)生脫落，形成的游離癌細胞可隨血液或淋巴液散布周身，使乳腺癌發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。MMP-9是腫瘤細胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的主要參與者。由于Ⅳ型膠原是構(gòu)成細胞外基質(zhì)的基本骨架，而MMP-9分泌的明膠酶可降解Ⅳ型膠原[11]，因此MMP-9在腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移過程中起到關(guān)鍵作用。本研究結(jié)果表明，經(jīng)As4O6干預(yù)后，MCF-7細胞MMP-9 mRNA表達呈降低趨勢，提示As4O6可通過抑制MMP-9基因的表達有效抑制乳腺癌MCF-7細胞的侵襲能力。進一步結(jié)合劃痕愈合實驗結(jié)果，表明As4O6可有效抑制乳腺癌MCF-7細胞的侵襲和遷移能力。

綜上所述，As4O6可通過干預(yù)細胞凋亡、細胞阻滯、細胞侵襲及遷移能力等多途徑發(fā)揮藥效。As4O6可促進乳腺癌MCF-7細胞凋亡，將其阻滯在S期，破壞腫瘤細胞DNA合成來抑制細胞增殖，其機制可能與p21、Caspase-3、Cyclin E1、Cyclin A2有關(guān)。此外，As4O6可通過抑制MMP-9分泌，阻止細胞基底膜降解，達到對MCF-7細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的抑制作用。

參考文獻：

[1] KIM Y W， BAE S M， LEE K H， et al. Retraction：comparison of As2O3 and As4O6 in the detection of SiHa cervical cancer cell growth inhibition pathway[J]. Cancer Res Treat，2007，39（1）：47.

[2] CHUNG W H， KOO H J， KUH H J， et al. Anti-proliferative effect of tetra-arsenic oxide （TetraAs） in human gastric cancer cells in vitro[J]. Kor Pharm Sci，2007，37（5）：305-309.

[3] WOO S H， PARK M J， AN S， et al. Diarsenic and tetraarsenic oxide inhibit cell cycle progression and bFGF- and VEGF-induced proliferation of human endothelial cells[J]. J Cell Biochem， 2005，95（1）：120-130.endprint

[4] PARK I C， PARK M J， WOO S H， et al. Tetraarsenic oxide induces apoptosis in U937 leukemic cells through a reactive oxygen species-dependent pathway[J]. Int J Oncol，2003，23（4）：943-948.

[5] PARK M J， PARK I C， BAE I J， et al. Tetraarsenic oxide， a novel orally administrable angiogenesis inhibitor[J]. Int J Oncol， 2003，22（6）：1271-1276.

[6] PARK S G， JUNG J J， WON H J， et al. Tetra-arsenic oxide （Tetras） enhances radiation sensitivity of solid tumors by anti-vascular effect[J]. Cancer Lett，2009，277（2）：212-217.

[7] ZHANG Y， GOODYER C， LEBLANC A. Selective and protracted apoptosis in human primary neurons microinjection with active caspase-3，-6，-7 and -8[J]. J Neurosci，2000，20（22）：8384-8389.

[8] LI H P， JI J F， HOU K Y， et al. Prediction of recurrence risk in early breast cancer using human epidermal growth factor 2 and cyclin A2[J]. Chin Med J （Engl），2010，123（4）：431-437.

[9] 吉愛軍，唐金海.乳腺癌術(shù)后患者Cyclin A1、A2、D1、E1表達及其臨床意義[J].南京醫(yī)科大學學報，2010，30（9）：1290-1294.

[10] 王敏，李惠平，趙紅梅，等.Bcl-2、cyclin A2和PI3K在激素受體陰性乳腺癌中的表達及意義[J].中國微創(chuàng)外科雜志，2013，13（8）：713-723.

[11] ARVELO F， COTTE C. Metalloproteinases in tumor progression[J]. Invest Clin，2006，47（2）：185-205.

（收稿日期：2016-12-09）

（修回日期：2016-12-19；編輯：向宇雁）endprint