多巴酚丁胺聯(lián)合順鉑對(duì)胃癌移植瘤YAP和p—YAP蛋白表達(dá)的影響

樊靜華　高小云　鄭繪霞　肖虹　武麗娜　梁鋼　梁建芳

【摘要】 目的：通過建立胃癌移植瘤模型，觀察多巴酚丁胺聯(lián)合順鉑對(duì)胃癌移植瘤的生長(zhǎng)抑制作用及對(duì)瘤體組織中YAP、p-YAP表達(dá)的影響。方法：采用人胃癌SGC-7901細(xì)胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為5組：空白對(duì)照（CK）組、陰性對(duì)照（NS）組、多巴酚丁胺（DOB）組、順鉑（DDP）組、聯(lián)合用藥（DOB+DDP）組。治療結(jié)束后摘除移植瘤組織，測(cè)量并稱重，計(jì)算抑瘤率。通過Western Blot檢測(cè)YAP和p-YAP蛋白的表達(dá)。結(jié)果：治療結(jié)束后CK、NS、DOB、DDP、DOB+DDP組瘤體終體積依次為（472.09±9.44）、（451.94±16.32）、（410.14±15.39）、（246.69±15.54）和（263.42±19.55）mm3。各組瘤質(zhì)量分別為（0.84±0.02）、（0.82±0.04）、（0.65±0.03）、（0.35±0.01）和（0.35±0.02）g，其中實(shí)驗(yàn)組（DOB、DDP、DOB+DDP）抑瘤率分別為22.67%、58.71%和58.47%，與對(duì)照組（CK、NS）相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。DOB組和DDP組YAP表達(dá)量均低于對(duì)照組（P<0.05），p-YAP表達(dá)量高于對(duì)照組（CK、NS）（P<0.05），DOB+DDP組與對(duì)照組（CK、NS）相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：多巴酚丁胺可能通過下調(diào)YAP，同時(shí)上調(diào)p-YAP的表達(dá)抑制胃癌移植瘤生長(zhǎng)，與順鉑聯(lián)合抑制作用不明顯。

【關(guān)鍵詞】 胃癌； 多巴酚丁胺； 順鉑； YAP； p-YAP

Inhibitory Effect of Dobutamine Combined with Cisplatin on Gastric Implant Tumor and Expression of YAP and p-YAP/FAN Jing-hua，GAO Xiao-yun，ZHENG Hui-xia，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（14）：028-031

【Abstract】 Objective：To investigate the effects of Dobutamine combined with Cisplatin on the growth of human gastric tumor SGC-7901 cell xenografts in nude mice and the possible mechanisms involved in the expression of YAP and p-YAP.Method：The human gastric cancer SGC-7901 cell line subcutaneous transplantation tumor mode were randomly divided into 5 groups：Blank control（CK） group，Negative control（NS） group，Dobutamine（DOB） group，Cisplatin（DDP） group，Dobutamine+Cisplatin（DOB+DDP） group.After the treatment to remove the transplanted tumor tissue，tumor volume and weight were observed .The expression of YAP and p-YAP were evaluated by Western Blotting analysis.Result：Tumor volumes in CK group，NS group，DDP group，DOB group and DDP+DOB group were （472.09±9.44），（451.94±16.32），（410.14±15.39），（246.69±15.54） and （263.42±19.55）mm3.The quality of groups，respectively were （0.84±0.02），（0.82±0.04），（0.65±0.03），（0.35±0.01） and （0.35±0.02）g.Inhibitory rate of the experimental groups were 22.67%，58.71% and 58.47%，the differences were statistically significant compared with the control groups（P<0.05）.Compared with the control groups，YAP expressing quantity of the experimental groups was lower（P<0.05），p-YAP expressing quantity was higher（P<0.05）.Conclusion：Dobutamine may through cutting YAP and raising p-YAP expression inhibit the growth of gastric cancer xenografts in nude mice，while Cisplatin joint inhibitory effect is not obvious.

【Key words】 Gastric cancer； Dobutamine； Cisplatin； YAP； p-YAP

First-authors address：School of Basic Medical Sciences，Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.14.008

《2014全球癌癥報(bào)告》顯示全球癌癥發(fā)病形勢(shì)十分嚴(yán)峻，其中胃癌年新增病例約為40.5萬人，占世界新增病例的42.5%。目前進(jìn)展期胃癌以手術(shù)聯(lián)合化療的綜合治療為主，但5年生存率僅為30%～50%[1]。有關(guān)專家指出基因靶向治療和化療聯(lián)合能夠提高化療藥物的選擇性[2]。研究表明胃癌的發(fā)生與YAP基因表達(dá)異常之間存在相關(guān)性且YAP蛋白可調(diào)節(jié)腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性[3]。前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)多巴酚丁胺作用于YAP蛋白抑制胃癌SGC/7901細(xì)胞系的增殖、遷移能力[4]。本研究應(yīng)用裸鼠移植瘤模型，觀察多巴酚丁胺對(duì)胃癌移植瘤的抑制作用和傳統(tǒng)化療藥順鉑的協(xié)同作用，為胃癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 人胃癌SGC-7901細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫，BALB/C裸鼠購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司（合格證號(hào)SCXK湘2011-0003），雄性，4周齡左右，共28只，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)SPF級(jí)的動(dòng)物飼養(yǎng)室。

1.2 主要試劑和藥品 RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（杭州四季青）；多巴酚丁胺（浙江瑞新藥業(yè)）；順鉑（江蘇豪森藥業(yè)）；YAP多克隆抗體、p-YAP多克隆抗體（Cell Signaling）；（DAB顯色試劑盒（北京中杉）。

1.3 裸鼠模型的建立及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組 將SGC-7901細(xì)胞置于胎牛血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，配置4.0×107個(gè)/mL的細(xì)胞懸液備用。取裸鼠于右季肋部皮下接種細(xì)胞懸液0.1 mL，腫瘤生長(zhǎng)至直徑約5 mm。剔除3只腫瘤直徑未長(zhǎng)至規(guī)定大小的裸鼠后，剩余的25只隨機(jī)分為5組，每組5只：空白對(duì)照（CK）組：不作處理；陰性對(duì)照（NS）組：每日每次腹腔注射生理鹽水；多巴酚丁胺（DOB）組：腹腔注射多巴酚丁胺（10 mg/kg，1次/d）[5]；順鉑（DDP）組：腹腔注射順鉑（2.5 mg/kg，隔日一次）[6]；聯(lián)合用藥（DOB+DDP）組：腹腔注射多巴酚丁胺10 mg/kg，

1次/d，隔日聯(lián)合順鉑2.5 mg/kg。結(jié)束治療后脫頸處死裸鼠，摘除移植瘤組織，稱重并測(cè)量移植瘤長(zhǎng)（a）、寬（b），按公式V（mm3）=ab2/2計(jì)算移植瘤體積，繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，并計(jì)算抑瘤率。抑瘤率=（空白對(duì)照組腫瘤質(zhì)量-實(shí)驗(yàn)組腫瘤質(zhì)量）/空白對(duì)照組腫瘤質(zhì)量×100%。

1.4 Western blot檢測(cè)YAP、p-YAP、GAPDH 稱取瘤組織，反復(fù)研磨，加入RIPA裂解液，取相同體積的蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，DAB法顯色拍照。應(yīng)用Image J圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析，分別以YAP和p-YAP與GAPDH的比值作為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)強(qiáng)度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，采用單因素方差分析（one-way ANOVA）；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用 字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 移植瘤體積變化 各組移植瘤體積均隨時(shí)間而增大，治療結(jié)束后CK組終體積為（472.09±9.44）mm3，NS組終體積為（451.94±16.32）mm3，DOB組終體積為（410.14±15.39）mm3，NS組終體積為（246.69±15.54）mm3，DDP組終體積為（263.42±19.55）mm3，見圖1。CK組和NS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。DOB組、DDP組、DOB+DDP組裸鼠移植瘤體積較對(duì)照組（CK、NS）減?。≒<0.05），其中DOB+DDP組體積抑制作用優(yōu)于DOS組（P<0.05），但是與DDP組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 裸鼠體重及瘤質(zhì)量變化 治療后DOB組、DDP組、DOB+DDP組移植瘤質(zhì)量分別為（0.65±0.03）、（0.35±0.01）和（0.35±0.02）g，與對(duì)照組（CK、NS）相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中DOB+DDP組比DOB組抑瘤率更強(qiáng)（P<0.05），見表1。

2.3 Western blotting檢測(cè)結(jié)果 DOB組、DDP組YAP表達(dá)量均低于對(duì)照組（CK、NS）（P<0.05），p-YAP表達(dá)量高于對(duì)照組（CK、NS）（P<0.05）。（DOB+DDP）組與對(duì)照組（CK、NS）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見圖2、3。

3 討論

多巴酚丁胺屬于G蛋白偶聯(lián)受體（GPCR）激動(dòng)劑，臨床上廣泛用于治療心肌梗死、心力衰竭等。然而除了傳統(tǒng)的心血管作用外，有研究發(fā)現(xiàn)多巴酚丁胺在體外實(shí)驗(yàn)中能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)[7-8]。本研究從裸鼠在體水平觀察多巴酚丁胺和傳統(tǒng)化療藥物順鉑對(duì)胃癌移植瘤的抑制作用。

YAP即Yes相關(guān)蛋白，由定位于染色體11q22的YAP基因編碼，是Hippo信號(hào)通路中起關(guān)鍵作用的細(xì)胞內(nèi)連接蛋白[9]。正常情況下YAP以磷酸化形式（p-YAP）積聚于胞質(zhì)中，無轉(zhuǎn)錄激酶活性。一旦Hippo通路失活，活化后的YAP逐漸轉(zhuǎn)入胞核，與轉(zhuǎn)錄因子TEAD相結(jié)合，進(jìn)而激活下游基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，胃腺癌患者中癌組織較非腫瘤性上皮組織YAP表達(dá)水平增高[11]，而且沉默YAP，能抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖和侵襲[12]。對(duì)胃癌患者的研究也發(fā)現(xiàn)YAP蛋白高表達(dá)患者生存率明顯低于低表達(dá)者[13]。

近年很多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，GPCR信號(hào)通路與Hippo-YAP通路密切相關(guān)[14-16]。Kim等[17]研究發(fā)現(xiàn)，多巴酚丁胺作用于GPCR配體促進(jìn)Hippo-YAP的活動(dòng)，同時(shí)Bao等[7]也發(fā)現(xiàn)多巴酚丁胺通過作用于腎上腺素受體能夠誘導(dǎo)YAP磷酸化，使人骨肉瘤U20S細(xì)胞失去致癌活性。Fujii[18]也發(fā)現(xiàn)多巴酚丁胺可以抑制YAP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子的活性，抑制YAP誘導(dǎo)的細(xì)胞生長(zhǎng)。

從腫瘤生長(zhǎng)曲線看出，用藥第16天開始，單獨(dú)使用10 mg/kg的多巴酚丁胺組移植瘤體積生長(zhǎng)開始減慢，可見該劑量多巴酚丁胺對(duì)胃癌移植瘤具有潛在的抗腫瘤抑制效能，但生長(zhǎng)曲線減緩趨勢(shì)不太明顯。順鉑組移植瘤體積增長(zhǎng)明顯減慢，表明傳統(tǒng)化療藥物順鉑能夠抑制胃癌移植瘤的增長(zhǎng)。結(jié)束治療后DDB組、DDP組和DOB+DDP組抑瘤率分別為22.67%、58.71%和58.47%，基本與腫瘤體積的抑制結(jié)果符合。本次實(shí)驗(yàn)的蛋白分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)DOB組YAP含量降低同時(shí)p-YAP含量增加，說明多巴酚丁胺可能通過作用于YAP基因，增強(qiáng)YAP的磷酸化水平來抑制胃癌移植瘤的生長(zhǎng)，與Cravo等[19]的研究結(jié)果相符。DDP組YAP下調(diào)、p-YAP上調(diào)，是因?yàn)轫樸K作為一種廣譜抗癌藥物，在DNA損傷下，YAP被磷酸化，p-YAP作為促凋亡因子調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)[20]。本實(shí)驗(yàn)中DOB+DDP組與DDP組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說明順鉑與多巴酚丁胺聯(lián)合時(shí)可能并不能增強(qiáng)順鉑的作用，也可能與本實(shí)驗(yàn)中聯(lián)合使用的頻率、療程、藥物作用方式等有關(guān)，而且許多研究也強(qiáng)調(diào)Hippo-YAP調(diào)控具有復(fù)雜性。

綜上所述，多巴酚丁胺對(duì)胃癌移植瘤具有一定的生長(zhǎng)抑制作用，其抑瘤作用可能Hippo-YAP通路有關(guān)，但與順鉑聯(lián)合作用的具體機(jī)制待進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2017-01-18） （本文編輯：程旭然）