高效液相色譜法測定參味益氣口服液中五味子醇甲的含量

孔凡存　牛家豐　馬梅芳

【摘要】 目的 建立測定參味益氣口服液中五味子醇甲含量的高效液相色譜法（HPLC）。方法 色譜柱：Thermo-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）， 流動(dòng)相：甲醇-水（65：35）；檢測波長：250 nm；流速：0.7 ml/min；柱溫：40℃。結(jié)果 五味子醇甲在12.4～124.0 μg， 線性關(guān)系良好， 加樣回收率99.03%， RSD=0.63%（n=6）。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高， 易于操作， 可以作為控制參味益氣口服液質(zhì)量的重要方法。

【關(guān)鍵詞】 高效液相色譜法；參味益氣口服液；五味子醇甲；含量測定

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.12.097

【Abstract】 Objective To establish a method by high performance liquid chromatography （HPLC） to determine schisandrin content in Shenwei Yiqi oral liquid. Methods Chromatographic column was Thermo-C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm）， with mobile phase as methyl alcohol-water （65：35）. Measurement wavelength was 250 nm， with flow velocity as 0.7 ml/min and column temperature as 40℃. Results Schisandrin showed excellent linear relation in 12.4～124.0 μg， with sample adding recovery rate as 99.03%， RSD=0.63% （n=6）. Conclusion This method is accurate with excellent stability， high reproducibility and easy operation， and it can be taken as an important method to control quality of Shenwei Yiqi oral liquid.

【Key words】 High performance liquid chromatography； Shenwei Yiqi oral liquid； Schisandrin； Content determination

參味益氣口服液為本院制劑， 收載于《山東省醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》第1版第1冊， 由人參、黃芪、五味子、天花粉四味藥物組成， 具有益氣斂陰、清熱生津、安神鎮(zhèn)靜之功效， 用于神經(jīng)衰弱、病后體虛的治療。為進(jìn)一步控制藥品質(zhì)量， 本文探討該制劑中五味子醇甲的含量測定方法， 采用高效液相色譜法對其含量進(jìn)行測定， 取得滿意的效果。

1 儀器與試劑

1. 1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津公司；LC—20AT liquid chromatograph；SPD—20A uv/vis detector；SIL—20A auto sampler；CTO—20A column oven；LC solution色譜工作站）；Thermo-C18色譜柱（4.6mm×150mm， 5 μm）；METTLER TOLEDO XS 205型分析天平（瑞士梅特勒公司）；純水機(jī)（美國Millipore公司；FOEA26810D型）。

1. 2 試劑 甲醇（色譜純， 天津大茂化學(xué)試劑有限公司）；水為新鮮制備的超純水；乙酸乙酯（分析純， 萊陽經(jīng)濟(jì)技術(shù)開發(fā)區(qū)精細(xì)化工廠）；五味子醇甲對照品（批號(hào)：110857-200507）：購自中國食品藥品檢定研究院；參味益氣口服液樣品（批號(hào)20150501、20150502、20150503）；缺少五味子的陰性對照樣品（自制）。

2 方法與結(jié)果

2. 1 色譜條件[1] 色譜柱：Thermo-C18（4.6 mm×150 mm， 5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（65：35）；檢測波長：250 nm；流速：0.7 ml/min；柱溫：40℃；理論塔板數(shù)按五味子醇甲峰計(jì)算不低于2000。

2. 2 檢測波長的選擇 精密稱取適量五味子醇甲對照品， 用甲醇溶解， 配成適宜濃度的五味子醇甲對照品甲醇溶液， 按照光譜法掃描， 發(fā)現(xiàn)五味子醇甲在250 nm波長處有最大吸收， 該吸收峰形良好， 適合做定量分析， 因此選擇250 nm作為檢測波長。

2. 3 對照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲對照品適量， 加適量甲醇溶解并定容， 制成25 μg/ml的五味子醇甲對照品溶液。

2. 4 供試品溶液的制備 精密量取參味益氣口服液樣品5 ml， 置分液漏斗中， 加乙酸乙酯20 ml振搖提取， 提取3次， 將乙酸乙酯提取液合并， 置水浴蒸干， 殘?jiān)舆m量甲醇溶解并分次轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中， 加甲醇稀釋至刻度， 搖勻， 濾過， 取續(xù)濾液， 即得。

2. 5 陰性對照溶液的制備 取缺少五味子的陰性對照樣品， 按照供試品溶液的制備方法， 制備成陰性對照溶液。

2. 6 干擾試驗(yàn) 吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液各10 μl， 按照2.1項(xiàng)下的色譜條件， 分別注入液相色譜儀， 測定。參味益氣口服液供試品色譜中， 在與五味子醇甲對照品色譜相應(yīng)的位置上， 有色譜峰出現(xiàn)， 而缺少五味子的陰性對照溶液在五味子醇甲色譜峰位置處無相應(yīng)峰出現(xiàn)， 表明缺少五味子的陰性對照樣品中， 其他組分對五味子醇甲的測定無干擾。見圖1

甲

2. 7 線性關(guān)系考察 精密稱取五味子醇甲對照品12.4 mg， 置100 ml容量瓶中， 加甲醇溶解并定容至刻度， 搖勻， 作為五味子醇甲對照品貯備液（濃度為0.124 mg/ml）。分別精密量取五味子醇甲對照品貯備液1、2、4、6、8、10 ml， 置10 ml容量瓶中， 用甲醇溶解并定容至刻度， 搖勻， 作為6個(gè)濃度的五味子醇甲對照品溶液， 分別精密吸取10 μl， 注入高效液相色譜儀， 按上述色譜條件測定色譜峰面積， 以五味子醇甲進(jìn)樣量C對吸收峰面積A進(jìn)行線性回歸， 求得回歸方程為 A=15519C-3738（r=0.9999）。表明五味子醇甲在12.4～124.0 μg， 與吸收峰面積之間呈良好的線性關(guān)系。

2. 8 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取五味子醇甲對照品溶液（24.8 μg/ml）

10 μl， 按2.1項(xiàng)下色譜條件， 重復(fù)進(jìn)樣6次， 色譜峰保留時(shí)間穩(wěn)定， 測得五味子醇甲峰面積積分值分別為386154、386225、386094、386111、386358、386079， 平均值為386170， RSD=0.03%（n=6）。表面儀器的精密度良好。

2. 9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照供試品溶液的制備方法制備一批供試品溶液（批號(hào)20150501）， 室溫下分別在制備后0、4、8、12、16、24 h進(jìn)樣測定， 記錄色譜峰面積值分別為427566、427438、427110、427094、426995、426986， 平均值為427198， RSD=0.06%， 表明供試品溶液在室溫下 10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2. 10 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 對同一批參味益氣口服液（批號(hào)20150502）分別制備6份供試品溶液， 按照2.1色譜條件測定， 計(jì)算含量分別為0.1439、0.1433、0.1438、0.1432、0.1439 、0.1437 mg/ml， 平均值為0.144 mg/ml， RSD=0.22%（n=6）。表明方法的重現(xiàn)性良好。

2. 11 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知五味子醇甲含量為0.144 mg/ml的參味益氣口服液9份， 分別精密加入一定量的五味子醇甲對照品， 按2.4項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作， 依法制備供試品溶液， 進(jìn)樣量10 μl， 測定， 按下列公式計(jì)算回收率。見表1。

2. 12 樣品含量測定 取三批參味益氣口服液樣品， 按2.4項(xiàng)下供試品溶液制備方法操作， 按2.1項(xiàng)下色譜條件， 依法測定。見表2。

3 討論

3. 1 五味子具有收斂固澀、益氣生津、補(bǔ)腎寧心之功效， 是本制劑中的主要藥材之一， 五味子醇甲是五味子的主要活性成分之一， 具有鎮(zhèn)靜、保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞等多方面的藥理作用[2-8]， 因此選擇五味子醇甲作為該制劑質(zhì)量控制的指標(biāo)， 既符合中醫(yī)藥君臣佐使配伍理論， 又能滿足現(xiàn)代中藥分析測試的要求， 科學(xué)合理， 可操作性強(qiáng)。

3. 2 實(shí)驗(yàn)的研究階段， 作者從提取溶媒、提取條件等方面對供試品溶液的制備方法進(jìn)行了優(yōu)選。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 乙酸乙酯萃取易于分層， 后續(xù)操作簡便；提取3次以后， 增加提取次數(shù)， 測得五味子醇甲含量不再增加；故確定供試品溶液的提取方法為乙酸乙酯萃取3次。

3. 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 高效液相色譜法測定參味益氣口服液中五味子醇甲的含量， 結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性高， 易于操作， 可以作為控制參味益氣口服液質(zhì)量的重要方法。

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[收稿日期：2016-12-02]