沙苑子中沙苑子苷A制備方法優(yōu)化研究

王 敏，肖順麗，曹青云，李 琦，關(guān)亮俊，張宏桂

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

·實(shí)驗(yàn)研究·

沙苑子中沙苑子苷A制備方法優(yōu)化研究

王 敏，肖順麗，曹青云，李 琦，關(guān)亮俊，張宏桂

（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100102）

目的 以沙苑子為原料，研究簡(jiǎn)單、高效的提取、分離、純化沙苑子苷A的方法。方法 以沙苑子苷A的含量為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法優(yōu)化醇提工藝，所得浸膏經(jīng)萃取、聚酰胺、硅膠柱分離，甲醇重結(jié)晶純化沙苑子苷A，用波譜法、薄層色譜（TLC）法、高效液相色譜（HPLC）法檢查純度。結(jié)果 最佳提取工藝條件為，提取次數(shù)為3次，加20倍乙醇，提取時(shí)間為90 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%；分離純化的沙苑子苷A經(jīng)波譜法、TLC法檢查與對(duì)照品一致，經(jīng)HPLC法檢測(cè)純度超過(guò)98.50%。結(jié)論 優(yōu)選出的最佳提取工藝提取率高、穩(wěn)定性好，可為沙苑子苷A的工業(yè)化生產(chǎn)工藝提供指導(dǎo)。分離工藝已達(dá)到中藥質(zhì)量檢測(cè)用化學(xué)對(duì)照品技術(shù)要求，所選用的分離、純化方法簡(jiǎn)單、安全，可行性強(qiáng)，成本低且效率高。

沙苑子；沙苑子苷A；制備；工藝優(yōu)化

沙苑子為豆科植物扁莖黃芪 Astragaluscomplanatus R.Br的干燥成熟種子[1]，分布于東北、華北及西北地區(qū)[2]。本品始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘性溫，歸肝、腎經(jīng)，有溫補(bǔ)肝腎、固經(jīng)、縮尿、明目等功效，用于腎虛腰痛、遺精早泄、白濁帶下、小便余瀝、眩暈?zāi)炕璧炔“Y[1]。沙苑子主要含黃酮類(lèi)、三萜類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、氨基酸等成分，其中黃酮類(lèi)是沙苑子的主要有效成分，具有許多藥理活性，而沙苑子苷A是沙苑子中主要的生物活性成分之一，具有保護(hù)肝細(xì)胞、抑制肝纖維化形成的作用[3－8]。沙苑子苷A是2015年版《中國(guó)藥典（一部）》中規(guī)定的沙苑子藥材質(zhì)量檢測(cè)的對(duì)照品[1]。為研究出更簡(jiǎn)單、高效的沙苑子苷A的制備方法，本試驗(yàn)中用聚酰胺、硅膠柱層析分離，甲醇重結(jié)晶的方法，快速、高效制得高純度的沙苑子苷A?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 1525型高效液相色譜儀[包括Waters 2489型紫外可見(jiàn)檢測(cè)器，SunfireTMC18色譜柱（150 mm× 4.6mm，5μm），美國(guó)Waters公司]；BS223S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；薄層色譜及柱色譜用聚酰胺（浙江臺(tái)州化工廠）；薄層色譜及柱色譜用硅膠（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

乙腈（色譜純，賽默飛世爾科技有限公司）；沙苑子苷A對(duì)照品（批號(hào)111803－201403）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于98.5%；沙苑子藥材購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定為Astragalus complanatusR.Br的干燥近成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 沙苑子苷A含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：SunfireTMC18柱（150mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈－0.25%磷酸水溶液（24∶76）；檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm；流速：1.0m L／min；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10μL。理論板數(shù)按沙苑子苷A峰計(jì)應(yīng)不低于4 000。取對(duì)照品溶液、供試品溶液各10μL，按擬訂色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定，其色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，對(duì)照品溶液、供試品溶液中沙苑子苷A峰的保留時(shí)間一致。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱(chēng)取沙苑子苷A對(duì)照品5mg，精密稱(chēng)定，加60%乙醇溶解并定容至50mL容量瓶中，搖勻，制成質(zhì)量濃度為0.1 g／L的對(duì)照品溶液[9－13]。

供試品溶液：取沙苑子藥材30 g，置圓底燒瓶中用60%乙醇回流提取，將濾液置已恒重過(guò)的蒸發(fā)皿中，回收乙醇后轉(zhuǎn)移至真空干燥箱中至恒重，得到干浸膏，研細(xì)，稱(chēng)取0.05 g，精密稱(chēng)定，加10m L 60%乙醇溶解，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲30min，冷卻至室溫后稱(chēng)定質(zhì)量，60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取沙苑子苷A對(duì)照品溶液0.4，0.8，1.6，3.2，6.4mL，置10mL容量瓶中，加60%乙醇定容，搖勻，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，分別吸取10μL注入液相色譜儀，在266 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，記錄沙苑子苷A的峰面積。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品質(zhì)量濃度（X，g／L）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程 Y＝3.5×107X＋8 991.9，r＝0.999 2（n＝5）。結(jié)果表明，沙苑子苷A質(zhì)量濃度在0.004～0.064 g／L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取質(zhì)量濃度為0.016 g／L的對(duì)照品溶液10μL，按擬訂色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為1.23%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱(chēng)取相同質(zhì)量的浸膏6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果沙苑子苷A的平均含量為0.063 6%，RSD為1.52%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10μL，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積。結(jié)果的 RSD為1.78%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的浸膏6份，每份約0.05 g，分別加入沙苑子苷A對(duì)照品（0.016 g／L）2 m L，再加60%乙醇，超聲溶解，定容至10 m L容量瓶中，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 醇提工藝優(yōu)選

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

按 L9（34）正交表設(shè)計(jì)沙苑子苷 A的醇提工藝路線，以沙苑子苷A的含量為醇提評(píng)價(jià)指標(biāo)，以提取次數(shù)（因素A）、乙醇量倍數(shù)（因素B）、提取時(shí)間（因素C）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（因素D）為影響因素進(jìn)行優(yōu)化，其因素水平見(jiàn)表2。

2.2.2 正交試驗(yàn)及結(jié)果

精密稱(chēng)取9份沙苑子粗粉，每份30 g，浸泡0.5 h，按 L9（34）正交表的條件回流提取，提取完畢后，過(guò)濾，將濃縮液轉(zhuǎn)移至已恒重過(guò)的蒸發(fā)皿中，置真空干燥箱中干燥至恒重，得總浸膏。精密量取0.05 g干浸膏，用60%乙醇定容至10mL容量瓶中，搖勻，備用。結(jié)果見(jiàn)表3和表4。可見(jiàn)，以沙苑子苷A含量為指標(biāo)，因素A各水平間有顯著性差異（P＜0.05），故選擇均值最大的水平，因素B，C，D無(wú)顯著性差異。

表1 沙苑子苷A加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表2 醇提工藝優(yōu)選因素水平表

表3 沙苑子醇提正交試驗(yàn)及結(jié)果(n＝9)

表4 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.2.3 最佳醇提工藝確定

根據(jù)大規(guī)模實(shí)際生產(chǎn)的要求，本著節(jié)約的原則，確定沙苑子苷A的最佳提取工藝為A3B3C2D2，即提取次數(shù)為3次，加20倍乙醇，提取時(shí)間為90min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%。

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

按以上結(jié)果分析的最佳醇提工藝，分別各取3批樣品進(jìn)行試驗(yàn)，比較和驗(yàn)證最佳提取工藝的可靠性，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢?jiàn)，最佳工藝條件下所得結(jié)果與正交試驗(yàn)結(jié)果相當(dāng)，表明本提取工藝研究所得結(jié)果可靠。

表5 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 分離純化

取沙苑子藥材1 kg，按A3B3C2D2工藝條件提取，即用20倍量70%乙醇提取3次，每次90 min，提取液過(guò)濾，合并，將濾液回收至無(wú)醇味。乙酸乙酯萃取4次，合并乙酸乙酯層，減壓濃縮，置通風(fēng)櫥揮干。加少量水溶解，濕法上樣于聚酰胺柱，依次用水及10%和15%甲醇洗脫，收集15%甲醇洗脫部位，回收溶劑，干燥，100～200目硅膠拌樣，細(xì)粉過(guò) 80目篩干法上樣，用乙酸乙酯 －甲醇－水（V∶V∶V，8∶1∶0.6）洗脫，流分至1個(gè)柱體積后點(diǎn)聚酰胺薄層板發(fā)現(xiàn)開(kāi)始有沙苑子苷A析出，為沙苑子苷A粗品。收集流分，收集液減壓回收溶劑后，點(diǎn)聚酰胺板合并有相同目標(biāo)物的流分。將粗品用甲醇溶解成過(guò)飽和狀態(tài)，放入冰箱，低溫重結(jié)晶，重復(fù)3次，干燥后即得淡黃色沙苑子苷A純品。

2.4 結(jié)構(gòu)鑒定

沙苑子苷A純品為淡黃色粉末，鹽酸－鎂粉反應(yīng)呈櫻紅色；酸水解后溶液遇斐林試劑呈陽(yáng)性反應(yīng)，三氯化鋁反應(yīng)呈黃色；二氯氧鋯－枸櫞酸反應(yīng)鮮黃色消退。1H－NMR（DMSO－d6）：δ8.15（2H，d，J＝8.9 Hz，H－2′，6′），7.15（2H，d，J＝8.9 Hz，H－3′，5′），6.77（1H，d，J＝2.2 Hz，H－8），6.39（1H，d，J＝2.2 Hz，H－6）；5.48（1H，d，J＝7.5 Hz，H－1″），5.02（1H，d，J＝5.1 Hz，H－1″）。根據(jù)以上數(shù)據(jù)分析，與文獻(xiàn)[13]報(bào)道一致，故確定為沙苑子苷A。

2.5 純度測(cè)定

2.5.1 薄層色譜（TLC）檢測(cè)

分別以甲醇－水（2∶3）、丙酮－水（1∶2）為展開(kāi)劑，在聚酰胺薄膜上進(jìn)行展開(kāi)。另于硅膠G板上，以乙酸乙酯－甲醇－水（6∶1∶0.6）進(jìn)行展開(kāi)，以1%AlCl3乙醇溶液為顯色劑，在紫外燈365 nm波長(zhǎng)下觀察。結(jié)果樣品與對(duì)照品 Rf值相同，均無(wú)雜質(zhì)斑點(diǎn)。

2.5.2 高效液相色譜（HPLC）檢測(cè)

色譜條件同2.1.1項(xiàng)，檢測(cè)波長(zhǎng)分別為220，254，266，365 nm，樣品用色譜甲醇溶解。取沙苑子苷A對(duì)照品與樣品10μL進(jìn)樣，相應(yīng)樣品與對(duì)照品出峰時(shí)間一致，按面積歸一化法計(jì)算，沙苑子苷A的純度均達(dá)到98.50%，說(shuō)明樣品純度符合化學(xué)對(duì)照品的質(zhì)量要求。

3 討論

現(xiàn)有文獻(xiàn)關(guān)于沙苑子苷A提取分離純化的報(bào)道較少，且專(zhuān)利多采用反相硅膠、凝膠等，生產(chǎn)成本較高，純化過(guò)程使用的氯仿，毒性較大。另有文獻(xiàn)報(bào)道采用超聲提取[14－15]的工藝，但提取成本較高，實(shí)用性有待進(jìn)一步探討。

本試驗(yàn)中的制備工藝包括優(yōu)化提取、萃取、聚酰胺、硅膠柱分離、甲醇重結(jié)晶4個(gè)步驟，可簡(jiǎn)單、快速地從沙苑子中分離出符合2015年版《中國(guó)藥典（一部）》標(biāo)準(zhǔn)的沙苑子苷A對(duì)照品，為沙苑子苷A的相關(guān)研究和實(shí)際生產(chǎn)提供依據(jù)。

此外，本試驗(yàn)中采用價(jià)格便宜的聚酰胺和硅膠柱分離，節(jié)省了生產(chǎn)成本；僅用乙酸乙酯萃取，在保證萃取完全的條件下，減少了萃取次數(shù)及試劑的使用；所用重結(jié)晶的試劑為甲醇，其毒性低，對(duì)環(huán)境污染性小，可回收利用，可用于工業(yè)生產(chǎn)。

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Preparation M ethod of Com p lanatuside A from Astragalus Complanatus

Wang Min，Xiao Shunli，Cao Qingyun，Li Qi，Guan Liangjun，Zhang Honggui
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing，China 100102）

Ob jective To study a simple and efficient method of extracting，separating and purifying of Complanatoside A from Astragalus Complanatus.M ethods The extraction process was optimized by orthogonal test.The extract was separated by extraction，polyamide and silica gel column，and Complanatoside A was purified by methanol recrystallization.The purity was checked by spectral，TLC，HPLC methods.Resu lts The optimum extraction conditions were as follows：the extraction time was 3 times，the ratio of liquid to material was 1∶20，the extraction time was 90 min，and the ethanol concentration was 70%.The separation and purification of Complanatoside A accorded with the reference was tested by spectral TLC method.The purity was more than 98.50% tested by HPLC method.Conclusion The best extraction process has the advantages of high extraction rate and good stability，which can provide guidance for the industrial production process of Complanatoside A.The separation process has reached the technical requirements of chemical reference materials for traditional Chinese medicine quality detection.The separation and purification method is simple，safe，feasible，low cost and high efficiency.

Astragalus Complanatus；Complanatuside A；preparation；process optimization

TQ 460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)08－0001－04

2017－01－06；

2017－02－23)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.08.001

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目[3 1 0 7 0 3 2 8]。

王敏（1991－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)基礎(chǔ)，（電子信箱）wangminm18＠163.com。

張宏桂（1 9 5 5－），男，教授，研究方向?yàn)橹兴幩幮镔|(zhì)應(yīng)用及體內(nèi)代謝，（電話）0 1 0－8 4 7 3 8 6 4 2（電子信箱）b z y 7 1 4＠163.com。