動(dòng)脈斑塊內(nèi)骨橋蛋白靶向的新型超聲對比劑的制備及體外實(shí)驗(yàn)研究

茍?zhí)锾铮?敏，王亞斌，韓 東，喬紅玉，黃 旭，許夢琪，汪 奇，戴志飛，馮旭陽*，曹 豐*

(1第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院心血管內(nèi)科，西安 710032;2解放軍總醫(yī)院心血管內(nèi)科，北京 100853;3北京大學(xué)工學(xué)院，北京100871)

2015年中國心血管病報(bào)告顯示，心血管病為我國居民的首位死因，占疾病死亡構(gòu)成的40%以上，而冠心病更是威脅居民健康的第二大疾病，其中急性心肌梗死死亡率自2005年始呈快速上升趨勢［1］。急性心肌梗死多由冠狀動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊在多種誘因下破裂導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈阻塞引起，因此，早期評(píng)估不穩(wěn)定斑塊刻不容緩。

當(dāng)今應(yīng)用于臨床的診療手段尚存在一定缺陷，如冠狀動(dòng)脈造影、冠狀動(dòng)脈CT造影(coronary computed tomography angiography，CCTA)和血管內(nèi)超聲(intravascular ultrasound，IVUS)等雖然可以評(píng)估斑塊解剖結(jié)構(gòu)，但對斑塊內(nèi)早期分子事件無法檢測。新興的分子影像技術(shù)從分子生物學(xué)水平對生物內(nèi)環(huán)境變化進(jìn)行識(shí)別及量化，近年來在更加精細(xì)化的診斷及治療中呈現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景［2］。

不穩(wěn)定斑塊由薄纖維帽、包含脂質(zhì)和活化巨噬細(xì)胞的較大壞死物核心及微鈣化構(gòu)成［3］。骨橋蛋白(osteopontin，OPN)是一種磷酸化糖蛋白，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生時(shí)巨噬細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞均有表達(dá)，我們前期研究結(jié)果表明在由巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)形成的泡沫細(xì)胞中OPN表達(dá)明顯增加［4－6］。超聲對比劑有很好的臨床應(yīng)用前景，本研究以O(shè)PN為靶點(diǎn)，將OPN抗體與包裹全氟溴辛烷(perfluorooctyl bromide，PFOB)的聚乳酸納米顆粒(poly lactic acid nanoparticles，PLA NPs)偶聯(lián)，制備靶向超聲造影劑，并對造影劑的體外尋靶及成像能力進(jìn)行初步驗(yàn)證。

1 材料與方法

1．1 材料

小鼠單核/巨噬細(xì)胞系 RAW264．7購自美國ATCC細(xì)胞庫。PLA購自山東省醫(yī)療器械研究所，PFOB、聚乙烯醇、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、1－(3－二甲氨基丙基)3－乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、2－(N－嗎啡啉)乙磺酸(MES)購自美國Sigma公司，二氯甲烷購自國藥試劑公司，NH2-PEGCOOH購自北京凱正公司，標(biāo)記別藻青蛋白(allophycocyanin，APC)的OPN抗體、小鼠IgG抗體購自北京博奧森公司，CCK-8試劑盒購自日本同仁公司。超聲波破碎儀購自美國 Misonix公司(Sonicator 4000)，超聲診斷儀購自深圳邁瑞公司(DC-8)，粒度分析儀購自美國 Brookhaven公司(90Plus/ZetaPALS)，共聚焦顯微鏡購自日本Olympus公司(FV1000)。

1．2 方法

1．2．1 PLA NPs的制備 取100 mg PLA、4 ml二氯甲烷、100 μl PFOB充分混勻，加入20 ml PVA水溶液(2%)，冰浴超聲2 min得到乳劑，室溫?cái)嚢? h使二氯甲烷充分揮發(fā)。所得混合液5000 g離心5 min，取沉淀部分去離子水清洗離心并充分分散重懸，取100 μl液體凍干計(jì)算總量。

1．2．2 PLA NPs的表征 取微量樣品分散于超純水中，檢測PLA NPs的水合粒徑，適量樣品滴于銅網(wǎng)上，2%磷鎢酸染色后透射電鏡觀察粒子形態(tài)及粒徑大小。

1．2．3 攜 OPN抗體靶向PLA NPs的制備 以與PLA摩爾比為1∶500的比例計(jì)算所需EDC及NHS，與PLA NPs在MES緩沖液(pH5．5)中室溫反應(yīng)1 h活化顆粒表面羧基，后于PBS緩沖液中加入與PLA摩爾比為1∶3的NH2-PEG-COOH，室溫?cái)嚢?8 h完成親水性修飾。

將OPN抗體原液(1 mg/ml)50 μl 100 k超濾管中除去牛血清白蛋白。PEG-PLA NPs置于MES緩沖液中，以與PEG摩爾比為1∶10加入EDC及NHS室溫反應(yīng)30 min活化末端羧基，PBS緩沖液中與OPN抗體室溫避光攪拌過夜，所得產(chǎn)物經(jīng)離心重懸得到Anti-OPN-PEG-PLA-PFOB(OPN NPs)。

1．2．4 PLA NPs的細(xì)胞毒性檢測 將對數(shù)生長期細(xì)胞以104/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞長至70%后分別加入不同濃度梯度(0．00，0．01，0．02，0．05，0．10，0．20，0．50 mg/ml)的靶向探針懸液孵育 6 h。每孔加入100 μl新鮮培養(yǎng)基和10 μl CCK-8溶液后孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度(A450nm)。

1．2．5 OPN NPs的體外尋靶實(shí)驗(yàn) 將 RAW264．7細(xì)胞以3×105/皿接種于數(shù)塊共聚焦皿中，與氧化低密度脂蛋白(oxygenized low density lipoprotein，ox-LDL)80 μg/ml共孵育24 h誘導(dǎo)泡沫細(xì)胞形成，設(shè)實(shí)驗(yàn)組(OPN NPs)和無關(guān)對照組(Anti-IgG-PEGPLA-PFOB，IgG NPs)，分別加入終濃度為0．2 mg/ml的納米顆粒各1 ml，孵育4 h。4%多聚甲醛固定，DAPI染核后于激光共聚焦顯微鏡下觀察攝取結(jié)果。

1．2．6 OPN NPs的體外顯像實(shí)驗(yàn) 將OPN NPs稀釋至5 mg/ml，取1 ml注入乳膠管中，以去離子水作為對照組，無氣水為透聲窗，Mindray DC-8超聲診斷儀進(jìn)行成像，探頭頻率為12 MHz，機(jī)械指數(shù)為0.453。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用SPSS20．0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示。兩組數(shù)據(jù)組間差異采用t檢驗(yàn)，比較多組數(shù)據(jù)組間差異，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)。以P＜0．05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 探針的表征

PLA NPs以串聯(lián)方式通過碳二亞胺法先后進(jìn)行PEG親水性修飾及抗體偶聯(lián)(圖1A)，透射電鏡結(jié)果顯示顆粒呈球形或類球形，表面較光滑，粒徑100～300 nm，形態(tài)規(guī)則，未見明顯的團(tuán)聚及粘連現(xiàn)象(圖1B)。粒度分析儀顯示顆粒水合粒徑約為(267．60 ±82．40)nm(圖1C)。

2．2 探針的毒性檢測

CCK-8結(jié)果顯示，不同濃度的探針(0．00，0.01，0.02，0.05，0.10，0.20，0.50 mg/ml)相較于對照組，細(xì)胞活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(A450nm:1.13±0.05，1.11±0.04，1.10±0.05，1.08 ±0.04，1.08 ±0.06，1.06±0.04，1.02±0.07;P ＞0.05)，可見實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，所構(gòu)建的納米顆粒未顯現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。以空白對照組細(xì)胞存活率為100%，當(dāng)探針濃度達(dá)到0.50 mg/ml時(shí)，細(xì)胞存活率仍＞90%。

2．3 探針的細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)

激光共聚焦顯微鏡下見標(biāo)記抗體的APC染料呈現(xiàn)紅色熒光，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)紅色熒光信號(hào)強(qiáng)于無關(guān)對照組(圖2A)。熒光半定量結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組OPN NPs攝取量顯著高于無關(guān)對照組IgG NPs(P＜0．05;圖2B)，說明探針靶向識(shí)別性能佳。

2．4 探針的乳膠管超聲成像

乳膠管超聲成像示納米探針在反向脈沖諧波(pulse inversion harmonic imaging，PIHI)模式下顯示為點(diǎn)狀密集高回聲(圖3A)，在較高機(jī)械指數(shù)(MI=0．453)下信號(hào)無衰減，表明納米顆粒無明顯破裂，支持動(dòng)態(tài)觀察，可長時(shí)間顯影?？瞻讓φ战M去離子水在相同造影模式下為無回聲液性暗區(qū)(圖3B)。

3 討論

分子影像已經(jīng)逐漸成為生物醫(yī)學(xué)及材料化學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。通過對材料包殼及核心的修飾，可達(dá)到多種診斷模式互補(bǔ)，并對疾病的治療起到輔助作用。本課題組曾將抗體與四氧化三鐵納米顆粒偶聯(lián)，成功制備出可用于不穩(wěn)定斑塊識(shí)別的磁共振成像納米探針［5，7］。本實(shí)驗(yàn)選擇廣泛應(yīng)用且廉價(jià)易得的超聲造影技術(shù)，制備納米超聲造影劑。

相較于臨床應(yīng)用的超聲造影劑如聲諾維(SonoVue)等，納米超聲造影劑不易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)識(shí)別吞噬，血液循環(huán)時(shí)間長，組織穿透能力強(qiáng)。同時(shí)納米超聲造影劑依賴聚集效應(yīng)顯影，這就要求所選擇的靶點(diǎn)靈敏度高［8］。OPN不僅在活化的巨噬細(xì)胞中過表達(dá)，同時(shí)其可促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞重構(gòu)及纖維變性，尸檢結(jié)果示微鈣化灶內(nèi)OPN含量明顯增加［9，10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合不穩(wěn)定斑塊中炎癥反應(yīng)泡沫細(xì)胞富集和微鈣化形成的特點(diǎn)，以O(shè)PN作為靶點(diǎn)，可同時(shí)識(shí)別不穩(wěn)定斑塊兩種關(guān)鍵的預(yù)測因素，理論上較單一靶點(diǎn)成像能力更佳。

圖1 探針的表征Figure 1 Characterization of PLA NPs

圖2 靶向OPN納米探針的體外尋靶實(shí)驗(yàn)Figure 2 Targeting test of OPN NPs in vitro

圖3 靶向OPN納米探針的體外超聲成像Figure 3 Ultrasound imaging of OPN NPs in vitro

與磷脂微泡造影劑對比，高分子微泡造影劑穩(wěn)定性佳，抗聲壓能力強(qiáng)，且在攜載藥物方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢［11］。PLA為美國FDA批準(zhǔn)的可用于生物工程領(lǐng)域的材料，PLA可降解支架已成功應(yīng)用于臨床［12］，其在體內(nèi)可降解為乳酸和羥基乙酸參與代謝，以二氧化碳和水排出體外。PFOB性質(zhì)穩(wěn)定，攜氧能力強(qiáng)，已有多項(xiàng)研究表明其可用于在體超聲成像［13］。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)制備的靶向造影劑具有生物相容性好、穩(wěn)定性佳、可敏感識(shí)別靶向分子、成像能力優(yōu)良的特點(diǎn)。根據(jù)前人研究成果推測，本探針可用于經(jīng)體表大血管成像，同時(shí)已有學(xué)者對IVUS的對比劑成像功能進(jìn)行探索［14］，相較臨床使用的超聲診斷儀，IVUS的高頻換能器穿透力弱但分辨率更佳，結(jié)合本探針的使用，理論上可對未來冠狀動(dòng)脈斑塊的易損性評(píng)估提供參考。

目前針對不穩(wěn)定斑塊各種組分的標(biāo)志物尚在進(jìn)一步發(fā)掘中，識(shí)別不穩(wěn)定斑塊的影像學(xué)手段也有較多選擇［15］。本實(shí)驗(yàn)所選材料PLA和PFOB具有獨(dú)特的載藥及多模態(tài)成像優(yōu)勢，尚待進(jìn)一步研究。我們?nèi)孕铇?gòu)建并優(yōu)化可應(yīng)用于臨床的靶向分子探針，做到更加精確的斑塊成分識(shí)別及性質(zhì)診斷，指導(dǎo)臨床治療，并對材料進(jìn)行載藥修飾，以期實(shí)現(xiàn)診療一體化。

［1］ 陳偉偉，高潤霖，劉力生，等．《中國心血管病報(bào)告 2015》概要［J］．中國循環(huán)雜志，2016，31(6):521－528．DOI:10．3969/j．issn．1000-3614．2016．06．001．Chen WW，Gao RL，Liu LS，et al．Summary of Chinese Cardiovascular Disease Report 2015［J］．Chin Circ J，2016，31(6):521 －528．DOI:10．3969/j．issn．1000-3614．2016．06．001．

［2］ Gao D，Sun X，Gao L，et al．Recent advances in molecular imageguided cancer radionuclide therapy［J］．Curr Drug Targets，2015，16(6):634 －644．DOI:10．2174/1389450116666150-531155513．

［3］ Shaw LJ，Narula J，Chandrashekhar Y．The never-ending story on coronary calcium:is it predictive，punitive，or protective［J］?J Am Coll Cardiol，2015，65(13):1283 － 1285．DOI:10．1016/j．jacc．2015．02．024．

［4］ Qiao R，Qiao H，Zhang Y，et al．Molecular imaging of vulnerable atherosclerotic plaques in vivo with osteopontin-specific upconversion nanoprobes［J］．ACS Nano，2017，11(2):1816 － 1825．DOI:10．1021/acsnano．6b07842．

［5］ Qiao H，Wang Y，Zhang R，et al．MRI/optical dual-modality imaging of vulnerable atherosclerotic plaque with an osteopontintargeted probe based on Fe3O4nanoparticles［J］．Biomaterials，2017，112:336 －345．DOI:10．1016/j．biomaterials．2016．10．011．

［6］ 喬紅玉，王亞彬，高 磊，等．骨橋蛋白靶向磁性納米探針對動(dòng)脈斑塊的分子成像［J］．中華老年多器官疾病雜志，2016，15(4):283 － 288．DOI:10．11915/j．issn．1671-5403．2016．04．067．Qiao HY，Wang YB，Gao L，et al．Molecular imaging of atherosclerotic plaques via osteopontin targeted Fe3O4nanoparticles［J］．Chin J Mult Organ Dis Elderly，2016，15(4):283－288．DOI:10．11915/j．issn．1671-5403．2016．04．067．

［7］ Wang Y，Chen J，Yang B，et al．In vivo MR and fluorescence dual-modality imaging of atherosclerosis characteristics in mice using profilin-1 targeted magnetic nanoparticles［J］．Theranostics，2016，6(2):272 －286．DOI:10．7150/thno．13350．

［8］ 張美琴，周彩云，羅 紅．納米級(jí)超聲造影劑的技術(shù)進(jìn)展［J］．華西醫(yī)學(xué)，2012，27(10):1585－1587．Zhang MQ，Zhou CY，Luo H．Technical progress of nanoscale ultrasound contrast agent［J］．West China Med J，2012，27(10):1585－1587．

［9］ Tousoulis D，Siasos G，Maniatis K，et al．Novel biomarkers assessing the calcium deposition in coronary artery disease［J］．Curr Med Chem，2012，19(2):901 －920．DOI:10．2174/092986712799034833．

［10］ Quattrocelli M，Spencer MJ，McNally EM．Outside in:the matrix as a modifier of muscular dystrophy［J］．Biochim Biophys Acta，2017，1864(3):572 －579．DOI:10．1016/j．bbamcr．2016．12．020．

［11］朱建平，超聲分子成像技術(shù)的應(yīng)用進(jìn)展［J］．功能與分子醫(yī)學(xué)影像學(xué)，2015，4(1):558 －561．DOI:10．3969/j．issn．2095-2252．2015．01．001．Zhu JP．The progress of the application of ultrasonic molecular imaging technology［J］．Funct Mol Med Imaging，2015，4(1):558 －561．DOI:10．3969/j．issn．2095-2252．2015．01．001．

［12］Lee CH，Yu CY，Chang SH，et al．Promoting endothelial recovery and reducing neointimal hyperplasia using sequential-like release of acetylsalicylic acid and paclitaxel-loaded biodegradable stents［J］．Int J Nanomedicine，2014，9:4117 － 4133．DOI:10．2147/IJN．S67721．

［13］ Li H，Wang P，Wang X，et al．Perfluorooctyl bromide traces selfassembled with polymeric nanovesicles for blood pool ultrasound imaging［J］．Biomater Sci，2016，4(6):979 － 988．DOI:10．1039/c6bm00080k．

［14］ Dixon AJ，Kilroy JP，Dhanaliwala AH，et al．Microbubble-mediated intravascular ultrasound imaging and drug delivery［J］．IEEE Trans Ultrason FerroelectrFreq Control， 2015， 62(9):1674 －1685．DOI:10．1109/TUFFC．2015．007143．

［15］ Bourantas CV，Garcia-Garcia HM，Torii R，et al．Vulnerable plaque detection:an unrealistic quest or a feasible objective with a clinical value［J］?Heart，2016，102(8):581 －589．DOI:10．1136/heartjnl-2015-309060．