替米考星長效混懸劑的研制與質量評價

李明璐，鄒本革，畢可東，徐 玉

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學海都學院，山東萊陽 265200；）

替米考星長效混懸劑的研制與質量評價

李明璐1，鄒本革2，畢可東1，徐 玉1

（1. 青島農(nóng)業(yè)大學，山東青島 266109；2. 青島農(nóng)業(yè)大學海都學院，山東萊陽 265200；）

[目的]利用現(xiàn)代緩釋技術，以替米考星為原料藥，研制出溶解度較高、療效強、可減少給藥次數(shù)的替米考星長效混懸劑，并對其進行質量評價，為該藥的批量生產(chǎn)提供可靠依據(jù)。[方法]通過正交優(yōu)化法選擇最優(yōu)處方，并對最優(yōu)處方進行含量測定試驗、穩(wěn)定性試驗和藥動學試驗。[結果]替米考星長效混懸劑最佳處方為：替米考星原料藥2.5g/100 mL，有機溶媒（1，2-丙二醇:乙醇=9:1）占比65%，潤濕劑（吐溫-80）0.3%，助懸劑（羥丙甲纖維素）5%，抗氧劑（無水亞硫酸鈉）0.03%；含量測定結果為合格；影響因素試驗發(fā)現(xiàn)替米考星長效混懸劑對高溫和強光照敏感，對濕度不敏感；加速試驗和長期試驗發(fā)現(xiàn)替米考星長效混懸劑穩(wěn)定性良好；藥動學試驗發(fā)現(xiàn)替米考星長效混懸劑和實驗室自制替米考星溶液的AUC分別為43.164 9 μg·h·mL-1和26.206 5 μg·h·mL-1，替米考星長效混懸劑的相對生物利用度為164.71%。[結論]本試驗制得的替米考星長效混懸劑含量合格、穩(wěn)定性良好、相對生物利用度高，可以批量生產(chǎn)，用于大型養(yǎng)殖場的大規(guī)模給藥。

替米考星；混懸劑；含量；穩(wěn)定性；藥動學；生物利用度

替米考星是由泰樂菌素半合成的一種大環(huán)內酯類抗生素，其抗菌活性強，主要作用于革蘭氏陽性菌，對某些革蘭氏陰性菌、支原體等也有效。替米考星對胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌、畜禽支原體的抗菌活性高，被廣泛應用于由敏感菌引起的畜禽肺炎和乳房炎[1-3]。替米考星味極苦，限制了其在預混劑和飲水劑方面的應用，而普通注射液又需要大量的人力頻繁給藥，不便于大規(guī)模養(yǎng)殖場的使用。故本試驗利用現(xiàn)代緩釋技術，以替米考星為原料藥，研制出溶解度較高、療效強、可減少給藥次數(shù)的替米考星制劑。

我國在獸藥長效制劑方面的研究起步較晚，目前主要有口服緩釋制劑、注射用緩釋制劑、透皮緩釋制劑、植入緩釋制劑及其他固體分散體、脂質體、微球、微囊等[4-9]?？紤]到替米考星的理化性質及注射用緩釋制劑生物利用度高、毒性低、給藥方便、起效快等因素，本試驗決定制備一種替米考星長效混懸劑。

1 材料

1.1 試驗儀器

LC-1000高效液相色譜儀，山東魯南瑞紅化工儀器有限公司生產(chǎn)；KQ5200E超聲波清洗器，上?？茖С晝x器有限公司生產(chǎn)；DHG-9023A型電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精密試驗設備有限公司生產(chǎn)；BCM-100型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司生產(chǎn)；YP-250GSP綜合穩(wěn)定性試驗箱，上海邁捷實驗設備有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗藥品

替 米 考 星 原 料 藥（96.3%）， 批 號A20130401，山東齊魯制藥有限公司產(chǎn)品；1,2-丙二醇，批號20141130，天津市博迪化工有限公司產(chǎn)品；無水乙醇，批號20141201，青島愛得旺化工科技有限公司產(chǎn)品；吐溫-80，批號20150302，青島愛得旺化工科技有限公司產(chǎn)品；羥丙甲纖維素，批號20140822，青島愛得旺化工科技有限公司產(chǎn)品；無水亞硫酸鈉，批號20140707，天津市巴斯夫化工有限公司產(chǎn)品；注射用水，批號20150610，實驗室自制；普通營養(yǎng)瓊脂，批號20140701，北京陸橋技術有限公司產(chǎn)品；0.9%氯化鈉溶液，批號20141118，青島愛得旺化工科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗動物

12只體重（4±0.5）kg的成年健康中華田園犬，雌雄各半，購自青島市城陽區(qū)動物市場。試驗過程飼喂不含抗生素的全價日糧。

2 方法

2.1 替米考星長效混懸劑處方的篩選與優(yōu)化

采用單因素法篩選各藥物輔料，篩選出4種輔料：機溶媒為（1,2-丙二醇:乙醇=9:1），潤濕劑為（吐溫-80），助懸劑為（羥丙甲纖維素），抗氧劑為（無水亞硫酸鈉）。根據(jù)上述篩選結果，選定溶媒、潤濕劑、助懸劑、抗氧化劑4個因素，每個因素3個水平，進行正交試驗，按L9（34）正交表設計實驗。按正交表所列處方分別制備20 mL 25%替米考星長效混懸劑9份，過濾、滅菌后進行替米考星含量測定試驗、重分散性試驗和沉降容積比試驗。含量變化值要求在2%以內，重分散性次數(shù)越少越好，沉降容積比不低于50%，綜合考察后選擇最優(yōu)處方。

2.2 含量測定試驗

采用高效液相色譜法測定供試替米考星長效混懸劑的含量，共3批，每批2瓶。

2.3 穩(wěn)定性試驗

2.3.1 影響因素試驗。包括高溫、高濕和強光照射試驗[10]。取3批不同批次的供試替米考星長效混懸劑，分別于60 ℃，25 ℃、相對濕度75%，照度為（4 500±500）Lx的條件下放置10天，在第5天和第10天取樣，用高效液相色譜法測定其含量、重分散性和沉降容積比。

2.3.2 加速試驗。取3批不同批次的供試替米考星長效混懸劑于溫度（40±2）℃、相對濕度（75±5）%條件下放置6個月，分別于試驗期間的第1、2、3和6個月末取樣，用高效液相色譜法測定其含量、重分散性和沉降容積比。

2.3.3 長期試驗。取3批不同批次的供試替米考星長效混懸劑于溫度（25±2）℃、相對濕度（60±10）%條件下放置12個月，分別于試驗期間的第0、3、6、9和12個月末取樣，用高效液相色譜法測定其含量、重分散性和沉降容積比。

2.4 藥動學試驗

選用12只體重（4±0.5）kg的成年健康中華田園犬，隨機分為兩組，雌雄各半。給藥前，取每只犬的空白血漿1 mL作為空白對照。分別將替米考星長效混懸劑和實驗室自制替米考星溶液（方法：精密稱定磷酸替米考星2.5 g，溶于100 mL注射用水，置于數(shù)顯恒溫磁力攪拌器攪拌至完全溶解，過濾、滅菌得25%磷酸替米考星注射液）以20 mg/ kg.b.w的劑量肌肉注射兩組犬。給藥后，分別于15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，前臂橈靜脈采血2 mL裝于有肝素鈉的離心管中，3 000 r/min離心20 min，取血漿-20 ℃冷藏備用。

向裝有血樣的離心管加入4 mL乙腈，充分混勻后，3 000 r/min離心20 min。取上層的含藥層，加入適量1 moL/L NaOH溶液至pH=9，使用氯仿提取2次，3 000 r/min離心20 min，合并氯仿層，置于通風櫥中揮發(fā)至干燥，加入流動相溶解，漩渦震蕩1 min，冷藏備用。取樣，使用高效液相色譜法檢測。

采用WinNonlin軟件，對數(shù)據(jù)進行非房室模型分析，得出藥動學參數(shù)。

3 結果

3.1 替米考星長效混懸劑處方篩選與優(yōu)化

根據(jù)表1試驗結果，以含量為X、重分散性為Y、沉降容積比為Z，進行綜合評分。綜合得分=X+1/Y+Z。對綜合得分進行直觀分析，結果見表2。

表1 L9（34）正交試驗結果

由表2可知：極差大小順序為A＞B＞C＞D，表明溶媒比例影響最大，其次是潤濕劑和助懸劑，抗氧劑影響最小。其中A因素：K1＜K2＜ K3；B因素：K1＜K2＜K3；C因素：K2＜K1＜K3；D因素：K1＜K3＜K2。由此得出最優(yōu)處方為A3B3C3D2，即有機溶媒占比為65%，潤濕劑占比為0.3%，助懸劑占比為5%，抗氧劑占比為0.03%。

表2 正交試驗綜合得分

按照最優(yōu)處方制備樣品3批，測定滅菌前后替米考星原料藥含量變化值（表3）。結果表明，3批樣品滅菌前后含量變化都小于2%，符合標準。且通針性試驗結果為易，表明通針性良好。

表3 三批樣品含量變化值

3.2 含量測定

含量測定結果（表4）表明，供試品含量變化均小于2%，符合藥典規(guī)定，檢驗合格。

表4 供試品含量測定結果

3.3 穩(wěn)定性試驗

高溫、高濕和強光照射試驗結果表明，在高溫試驗和強光照射試驗中，供試品藥物含量稍有下降，重分散次數(shù)隨取樣時間延長而增多，沉降容積比稍有下降；高濕試驗中，供試品藥物含量幾乎不變，重分散次數(shù)不隨取樣時間延長而增多，沉降容積比幾乎無變化（表5～7）。綜上所述，替米考星長效混懸劑對溫度敏感，儲存運輸時應避免高溫；對濕度不敏感；對光敏感，成品包裝應具有遮光功能。

表5 高溫試驗結果

表6 高濕試驗結果

表7 強光照射試驗結果

加速試驗結果表明，供試替米考星長效混懸劑藥物含量稍有降低，重分散性次數(shù)隨時間延長有增多，沉降容積比數(shù)值稍有減小，但所有變化均符合獸藥典要求（表8）。綜上所述，該替米考星長效混懸劑穩(wěn)定性好。

表8 加速試驗結果

長期試驗結果表明，供試替米考星長效混懸劑藥物含量稍有降低，重分散性次數(shù)隨時間延長，僅增多1～2次，沉降容積比數(shù)值稍有減小，所有變化均符合獸藥典要求（表9）。綜上所述，該替米考星長效混懸劑穩(wěn)定性好。

表9 長期試驗結果

3.4 藥動學試驗

對試驗犬肌注給藥后，替米考星長效混懸劑組和實驗室自制替米考星溶液組測得的血藥濃度與時間數(shù)據(jù)見表10，藥時曲線見圖1。

表10 兩種制劑的血藥濃度（n=6）

圖1 兩種制劑血藥濃度-時間曲線

結果顯示，替米考星長效混懸劑組在2 h達到峰濃度2.285 μg/mL，而實驗室自制替米考星溶液組1 h即達到峰濃度2.126 μg/mL，且前者較后者峰濃度高，說明前者較后者在犬體內吸收程度高。替米考星長效混懸劑組在犬體內血藥濃度可達96 h，而實驗室自制替米考星溶液組在犬體內的血藥濃度在72 h時即低于檢測限，說明前者較后者在犬體內作用時間長。

WinNonlin軟件數(shù)據(jù)分析結果顯示，替米考星長效混懸劑在犬體內的末端消除半衰期為21.839 0 h，而實驗室自制替米考星溶液在犬體內的末端消除半衰期為13.605 1 h，表明后者在犬體內的消除速度較前者快；前者的藥時曲線下面積為43.164 9 μg· h·mL-1，而后者為26.206 5 μg·h·mL-1，表明前者在犬體內的藥物吸收程度較后者高（表11）。

表11 藥動學參數(shù)

根據(jù)下面公式計算得出替米考星長效混懸劑的相對生物利用度為164.71%。

4 討論

在試驗中，有機溶媒使用的是少量乙醇與1,2-丙二醇混合液，目的是提高混懸劑的通針性，而最終選擇的比例為1,2-丙二醇:乙醇=9:1，這是因為乙醇肌肉注射時濃度超過10%對組織刺激性較大。

含量測定及穩(wěn)定性試驗的結果中，替米考星含量均在24.95%～24.99%之間，說明制備的混懸劑中替米考星溶解度高，達到了替米考星含量為25%的預期標準，解決了替米考星可溶性差的難題。但由于時間原因，長期試驗只進行了12個月。截至第12個月，供試替米考星長效混懸劑含量未見明顯減少，重分散性良好，沉降容積比接近于1。若要測得準確有效期，還需繼續(xù)觀察。

藥動學試驗結果表明，本試驗制得的替米考星長效混懸劑在犬體內的血藥時間延長，生物利用度提高。其原因在于試劑配方中的羥丙甲纖維素具有助懸和緩釋作用，既提高了難溶性藥物替米考星的溶解度，又延緩了替米考星的擴散溶出，達到了長效治療的目的。

5 結論

本試驗確定了替米考星長效混懸劑的最優(yōu)處方為：替米考星原料藥2.5g，有機溶媒（1,2-丙二醇：乙醇=9:1）65%，潤濕劑0.3%，助懸劑5%，抗氧化劑0.03%，注射用水至全量100 mL。經(jīng)制劑的含量測定試驗、穩(wěn)定性試驗和藥動學試驗，證明其質量合格。

[1]劉曉萍，趙恒壽. 替米考星的研究進展及其應用[J]. 四川畜牧獸醫(yī)，2008，35（4）：33-34.

[2]宋福杰，劉明春，符特. 替米考星的應用研究進展[J]. 現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)，2006（7）：63-65.

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[4]柴暉麗，喬賽毛措，周毛加. 淺談獸藥緩控釋制劑的研究進展[J]. 青海畜牧獸醫(yī)雜志，2014， 44（3）：40-42.

[5]王艷玲，劉晨光，郝智慧. 獸藥緩控釋制劑的研究進展[J]. 中國獸藥雜志，2008，42（11）：42-46.

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（責任編輯：朱迪國）

Preparation and Quality Evaluation of Tilmicosin Long-action Suspension

Li Minglu1，Zou Benge2，Bi Kedong1，Xu Yu1

（1. Qingdao Agricultural University，Qingdao，Shangdong 266109；2. Haidu College of Qingdao Agricultural University，Laiyang，Shangdong 265200）

[Objective]In order to develop the Tilmicosin long-action suspension with characteristics of high solubility，good curative effect and low administration frequency by using modern slow-release technology and taking Tilmicosin ingredient as raw materials，so as to provide reliable basis for mass production on the basis of preliminary quality evaluation.[Methods]Choosing the optimal prescription through orthogonal optimization method，then content determination，stability and pharmacokinetic tests were conducted towards the optimized prescription. [Results]The proportions of the prescription for the Tilmicosin long-action suspension listed below：Tilmicosin ingredients（2.5 g/100 mL），Organic solvent（1,2-propylene glycol:ethanol = 9:1）accounting for 65%，Wetting agent（Twain-80）accounting for 0.3%，Suspended aid（Hydroxypropyl methyl cellulose）accounting for 5%，and Antioxidant（Anhydrous sodium sulfite）accounting for 0.03%. Results of content determination test manifested as qualified. Sensitivity test showed Tilmicosin long-action suspension was sensitive to high temperature and strong light，but it wasn′t humidity-sensitive. Accelerated test and long-term test indicated the long-action suspension had good stability. According to pharmacokinetic test result，the AUC of Tilmicosin long-action suspension and laboratory homemade Tilmicosin solution were 43.164 9 μg·h·mL-1and 26.206 5 μg·h·mL-1，respectively. The relative bio-availability of the suspension was 164.71%. [Conclusions]The developed Tilmicosin long-action suspension was of qualified content determination，good stability and high relative bio-availability，it could be carried out mass production and applied in large-scale farms.

Tilmicosin；suspension；content；stability；pharmacokinetic；bio-availability

S859.79

B

1005-944X（2017）04-0094-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.027