兩株野鳥源H6N1和H6N8亞型禽流感病毒的遺傳進(jìn)化分析和對(duì)小鼠的感染性研究

蔣文明，李金平，彭 程，王素春，侯廣宇，陳繼明

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

兩株野鳥源H6N1和H6N8亞型禽流感病毒的遺傳進(jìn)化分析和對(duì)小鼠的感染性研究

蔣文明，李金平，彭 程，王素春，侯廣宇，陳繼明

（中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，山東青島 266032）

為了解2016年在江西省鄱陽(yáng)湖野鳥中分離的兩株H6N8和H6N1亞型禽流感病毒（P419和P339）的生物學(xué)特性，本研究對(duì)其進(jìn)行了全基因組序列測(cè)定、受體分析和對(duì)BALB/c小鼠的感染性試驗(yàn)。序列分析結(jié)果顯示，這2個(gè)毒株屬于不同的分支，并經(jīng)歷了不同亞型病毒間的廣泛重組。2個(gè)分離株的HA裂解位點(diǎn)基序均為PQIETR/GLF，符合低致病性禽流感病毒的分子特征。HA蛋白受體結(jié)合位點(diǎn)處第138、226、228位氨基酸殘基分別為丙氨酸（A）、谷氨酰胺（Q）、甘氨酸（G），具有結(jié)合禽樣流感病毒受體的分子特征。受體結(jié)合試驗(yàn)表明，分離毒株僅能結(jié)合禽樣受體。Balb/c小鼠的感染性試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離株只在小鼠的上呼吸道鼻甲中進(jìn)行有限復(fù)制，使小鼠體重發(fā)生輕微變化，未表現(xiàn)明顯臨床癥狀，表明這2株分離株可感染小鼠，但致病力不強(qiáng)。

禽流感病毒；H6亞型；野鳥；感染性

野鳥，特別是水禽，是禽流感病毒（AIVs）的自然儲(chǔ)存庫(kù)[1-2]，所有H1～H16和N1～N9亞型的A型AIVs都曾在野鳥中被發(fā)現(xiàn)過(guò)[3]。1965年，美國(guó)在火雞中首次分離到H6亞型AIVs。隨后該亞型AIVs在全世界范圍內(nèi)的野鳥和家禽中被發(fā)現(xiàn)。1997年，H6亞型病毒在我國(guó)華南地區(qū)的活禽市場(chǎng)中被檢測(cè)到。本研究對(duì)2016年在鄱陽(yáng)湖野鳥中分離的2株H6N1和H6N8亞型AIVs進(jìn)行了全基因組測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析，并對(duì)其進(jìn)行了生物學(xué)特性研究，以期了解該亞型病毒在野鳥中的進(jìn)化和生物學(xué)特性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。2株H6亞型AIVs，A/ wild bird/Jiangxi/P339/2016（H6N1）和A/wild bird/ Jiangxi/P419/2016（H6N8），由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心禽病監(jiān)測(cè)室分離并鑒定；SPF雞胚，購(gòu)自濟(jì)南斯帕法斯家禽有限公司；BALB/c小鼠，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.1.2 主要試劑。QIAamp Viral RNA Mini Kit，購(gòu) 自 Qiagen公 司；HiScript II One Step RT-PCR Kit，購(gòu)自Vazyme公司；DNA膠回收試劑盒、pMD19-T載體、質(zhì)粒提取純化試劑盒、α2，3-sialidase，購(gòu)自Takara公司。

1.2 全基因組序列測(cè)定與分析

將病毒10倍比稀釋后，接種9～11日齡SPF雞胚，純化3代后進(jìn)行病毒增殖及保存。根據(jù)QIAamp Viral RNA Mini Kit操作說(shuō)明，提取病毒RNA，置-70 ℃保存?zhèn)溆?。根?jù)已發(fā)表的文獻(xiàn)[13]合成擴(kuò)增基因組片段的引物。利用HiScript II One Step RT-PCR Kit擴(kuò)增病毒的8個(gè)基因片段。按照DNA膠回收試劑盒說(shuō)明純化回收PCR產(chǎn)物，然后將其與pMD19-T載體連接，將陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海生工進(jìn)行測(cè)序鑒定，對(duì)基因組序列通過(guò)Blast、MegAlian、Mega 6等軟件進(jìn)行分析。

1.3 受體結(jié)合試驗(yàn)

具體方法參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[14]。用PBS制備10%的鵝紅細(xì)胞懸液（Goose red blood cell，GRBC），將每100 μL懸液用1.25 U α2,3-sialidase 37 ℃處理1 h，然后用PBS洗滌2次，配成濃度為0.5%的鵝紅細(xì)胞懸液。同樣制備未經(jīng)處理的0.5%的鵝紅細(xì)胞懸液。將病毒2倍比稀釋后，分別與這2種等量鵝紅細(xì)胞懸液混合作用，記錄發(fā)生完全凝集的最大病毒稀釋度。

1.4 小鼠感染性試驗(yàn)

將病毒經(jīng)鼻腔接種10只6周齡的BALB/c小鼠，106EID50/0.05 mL/只，同時(shí)以等量的PBS接種5只小鼠作為陰性對(duì)照。感染后3 d，處死5只小鼠，剖檢觀察病變，并采集肺、鼻竇、脾、肝和腦組織，進(jìn)行病毒滴定。對(duì)其余小鼠連續(xù)觀察14 d，并每天記錄小鼠的體重變化情況。

2 結(jié)果

2.1 基因組序列的遺傳進(jìn)化分析

以提取的P419和P339分離株RNA為模板，用RT-PCR分別擴(kuò)增其8個(gè)基因片段，然后測(cè)序。將全基因組序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)。結(jié)果顯示，P419病毒的8個(gè)基因片段與來(lái)自韓國(guó)、日本、中國(guó)、越南、危地馬拉等國(guó)家相關(guān)亞型禽流感病毒（野鳥、雞、鴨、鵝）的同源性最高；P339病毒的8個(gè)基因片段與來(lái)自蒙古、中國(guó)、日本等國(guó)家相關(guān)亞型禽流感病毒（野鳥、鴨、鴿）的同源性最高（表1）。

表1 兩株H6亞型分離株基因組與GenBank中病毒的同源性比較

2.2 HA基因序列及遺傳進(jìn)化分析

P419和P339的HA基因編碼區(qū)均為1 701 nt，編碼567個(gè)氨基酸殘基。HA氨基酸序列分析表明，2株H6病毒的HA裂解位點(diǎn)基序?yàn)镻QIETR/GLF，僅有1個(gè)堿性氨基酸，符合低致病性AIVs的分子特征。NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè)分析表明，P419在27、39、306、557位含有4個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，P339在27、39、182、306、498、557位含有6個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。P419和P339在第138、226、228位分別為丙氨酸（A）、谷氨酰胺（Q）、甘氨酸（G），傾向于結(jié)合禽樣受體。

HA基因遺傳進(jìn)化分析顯示，H6亞型AIVs可以分為歐亞譜系和北美譜系。歐亞譜系又可進(jìn)一步分為HN573-like、ST2853-like、ST339-like、Korea545-like和AHL221-like 5個(gè)小分支。其中前3個(gè)分支為前期H6亞型AIVs的主要分支[15]，此次研究中的P419和P339分離株HA基因分別屬于后2個(gè)分支，兩者核苷酸同源性為93.18%（圖1）。

2.3 NA基因序列及遺傳進(jìn)化分析

P419和P339的NA基因編碼區(qū)分別為1 413和1 410 nt，分別編碼471和470個(gè)氨基酸殘基。NetNGlyc 1.0 Server預(yù)測(cè)分析表明，P419在46、54、67、84、144、293、398位含有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)，P339在50、58、63、68、88、146、235位含有7個(gè)潛在的糖基化位點(diǎn)。P419與A/duck/Zhejiang/ D1-6/2013（H3N8）的NA基因核苷酸同源性為97.88%，P339與 A/wild bird/Wuhan/WHHN16/2014（H1N1）的NA基因核苷酸同源性為99.14%。

2.4 內(nèi)部基因序列及遺傳進(jìn)化分析

P419和P339分離株間的PB2、PB1、PA、 NP、M、NS核苷酸同源性分別為95.77%、95.45%、93.96%、97.66%、93.59%、97.08%。2個(gè)分離株的內(nèi)部基因與H7N7、H6N5、H1N1、H10N2、H3N8、H14N3、H11N3、H1N2、H12N8、H5N3、H4N6、H2N8等多種亞型的AIVs核苷酸同源性較高，表明內(nèi)部基因來(lái)源復(fù)雜。

2.5 受體結(jié)合特性

2株病毒只能與未處理的鵝紅細(xì)胞反應(yīng)，不能與處理過(guò)的鵝紅細(xì)胞反應(yīng)（表2），說(shuō)明這2株H6亞型AIVs僅能結(jié)合α2,3-唾液酸。

表2 P419和P339分別與經(jīng)α2,3-唾液酸酶處理的鵝紅細(xì)胞（GRBC）反應(yīng)前后的HA滴度變化

2.6 對(duì)小鼠的感染性

將P419和P339鼻腔接種小鼠后，在剖檢組織中均未發(fā)現(xiàn)肉眼病理變化。接種病毒3 d后，進(jìn)行病毒分離滴定，僅在鼻甲中分離到病毒，在其他組織，如肺、腦、肝、脾組織中，均未分離到病毒（表3）。感染后小鼠體重變化輕微（圖2）。

表3 P419和P339對(duì)小鼠的感染性

圖1 兩株H6病毒基因組遺傳進(jìn)化分析

3 討論

圖2 兩株H6病毒感染后小鼠體重變化

野鳥是AIVs的自然儲(chǔ)存庫(kù)，病毒可隨著宿主的遷徙傳播給其他水禽和家禽。為進(jìn)一步了解我國(guó)野鳥H6亞型AIVs的感染情況，2016年對(duì)鄱陽(yáng)湖地區(qū)的野鳥進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，共分離到2株病毒。序列分析表明，這2株病毒的HA裂解位點(diǎn)處僅有1個(gè)堿性氨基酸，屬于低致病性病毒。HA受體結(jié)合位點(diǎn)分析表明，HA蛋白的第138、226、228位為傾向結(jié)合禽源受體的丙氨酸（A）、谷氨酰胺（Q）、甘氨酸（G）。受體結(jié)合試驗(yàn)也驗(yàn)證了這一點(diǎn)，它們僅能結(jié)合禽樣受體。為進(jìn)一步分析其生物學(xué)特性，對(duì)這2株病毒進(jìn)行了小鼠感染性試驗(yàn)。結(jié)果表明：病毒可在BALB/c的鼻甲中限制性增殖，剖檢組織中均無(wú)肉眼病理變化；小鼠體重變化輕微。這說(shuō)明這2株病毒對(duì)BALB/c小鼠雖有一定的感染性，但致病性不強(qiáng)。

HA基因遺傳進(jìn)化分析結(jié)果顯示，P419和P339分離株的HA基因分別屬于Korea545-like和AHL221-like分支，不同于以前H6病毒常見的HN573-like、ST2853-like、ST339-like分支，說(shuō)明H6病毒HA基因正經(jīng)歷著變異和進(jìn)化?；蚪M分析表明，H6病毒經(jīng)歷了家禽和野鳥病毒間的廣泛重組。該研究對(duì)于理解AIVs不同譜系之間基因交換、不同亞型AIVs之間的重組和進(jìn)化具有重要的意義。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Phylogenetic Analysis on H6N1 and H6N8 Subtype Avian Influenza Virus Strains of Wild Bird-origin and Pathogenicity Study

Jiang Wenming，Li Jinping，Peng Cheng，Wang Suchun，Hou Guangyu，Chen Jiming

（China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032）

Objective to investigate the biological characteristics of two wild bird-origin H6 subtype（H6N1 and H6N8）avian influenza virus（AIV）strains，P419 and P339，which were isolated from wild bird feces in Poyang Lake of Jiangxi Province in 2016 the two isolated strains were sequenced，the receptor binding assay was conducted and the infectivity of the isolates were evaluated in BALB/c mice. Sequence analysis results showed that the two isolates belonged to different clades，and had experienced extensive recombination between different subtypes of AIV. Both of the isolates had a HA cleavage site of PQIETR/GLF，which was consistent with the characteristic of low pathogenic avian influenza virus. Both of the isolates had residues A138，Q226 and G228 at the HA receptor binding sites，suggesting these viruses have molecular characteristic of binding avian-like receptors. Receptor binding assay results showed that the two isolates could only bind avian-like receptors. The infectious experiments results in mice showed that the isolates were able to replicate only in the nasal turbinate of mice and mice had slight body weight change without apparent clinical symptoms，indicating that the two isolates could infect mice，but the pathogenicity could be relatively weak.

avian influenza virus；H6 subtype；wild birds；infectivity

S852.65

A

1005-944X（2017）04-0090-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.026

科技部科技基礎(chǔ)性工作專項(xiàng)（2012FY111000）