豬細環(huán)病毒數(shù)字PCR定量檢測方法的建立

楊春華，孫 潔，羅秋紅，祝建新，孫思揚，周 延，鐘 毅，夏 彪

（1. 江西出入境檢驗檢疫局，江西南昌 330002；2. 深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518045；3. 南昌大學，江西南昌 330002）

豬細環(huán)病毒數(shù)字PCR定量檢測方法的建立

楊春華1，孫 潔2，羅秋紅1，祝建新1，孫思揚1，周 延3，鐘 毅1，夏 彪1

（1. 江西出入境檢驗檢疫局，江西南昌 330002；2. 深圳出入境檢驗檢疫局，廣東深圳 518045；3. 南昌大學，江西南昌 330002）

[目的]實現(xiàn)豬細環(huán)病毒（TTSuV）的準確定量檢測。[方法]根據(jù)TTSuV的序列特點，設計特異性引物、探針，建立數(shù)字PCR檢測技術(shù)。對數(shù)字PCR反應體系中的引物和探針濃度進行優(yōu)化，分析方法的靈敏度、特異性，并初步應用于進行臨床檢測。[結(jié)果]最終確定TTSuV1a和TTSuV1b數(shù)字PCR反應體系中最佳引物濃度均為250 nmol/L，最佳探針濃度均為 300 nmol/L，TTSuV1a型和TTSuV1b型靈敏度均可達到單個拷貝數(shù)；以豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬細小病毒和豬偽狂犬病毒進行特異性試驗，結(jié)果無交叉反應；批內(nèi)和批間試驗表明，該方法的重復性良好；本實驗室留存的92份血清樣本的檢測結(jié)果與其背景信息一致。[結(jié)論]本研究建立的TTSuV數(shù)字PCR法具有特異性強、靈敏度高、檢測限低等優(yōu)點，可用于TTSuV的定量檢測。

豬細環(huán)病毒；實時熒光PCR；數(shù)字PCR

細環(huán)病毒（Torque Torque Virus，TTV）是1997 年首次發(fā)現(xiàn)的，可感染人[1-2]以及豬、牛、羊、貓、狗等多種動物[3-4]的一種病毒。1999年Leary首次報道了豬細環(huán)病毒（Torque Torque Sus Virus，TTSuV）的存在[3]。該病毒是單股、負鏈、環(huán)狀DNA 病毒[3，5]，無囊膜，在氯化銫（CsCl）溶液內(nèi)的浮密度為1.31～1.35 g/cm3，在糞便、血液、膽汁中的浮密度也大致與其相同。TTSuV的基因組長度約為3.9 kb，具有ORF1 和ORF2兩個開放閱讀框，其中ORF1編碼病毒的衣殼蛋白，ORF2編碼病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白[6]。2011年國際病毒分類委員會（ICTV）將TTSuV重新進行了分類，分為Torque Torque Sus Virus 1和Torque Torque Sus Virus K2，其中常引起豬只感染的Torque Torque Sus Virus 1又分 為Torque Torque Sus Virus 1a和Torque Torque Sus Virus 1b。

目前，關(guān)于TTSuV的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫吸附試驗法（ELISA）、免疫印跡法、PCR凝膠電泳法和實時熒光PCR方法等[7-9]。ELISA法和免疫印跡法操作復雜、費時、特異性不強。實時熒光PCR是目前進行病毒核酸檢測的主流技術(shù)手段。隨著科技的發(fā)展，在實時熒光PCR的基礎上，發(fā)展出了一種核酸檢測絕對定量的新技術(shù)，即數(shù)字PCR技術(shù)。同傳統(tǒng)PCR以及qPCR相比，數(shù)字PCR增加了一步分液的操作，將幾十微升的反應體系分成上百萬個微小的、獨立的反應體系。核酸模板在這種分液的過程中被充分稀釋，理想狀態(tài)下每個小反應體系中至多含有1個分子的核酸模板。分液完成后，收集所有液滴進行常規(guī)PCR擴增，擴增完成后識別熒光信號并計數(shù)，從而得到絕對定量結(jié)果。與qPCR不同，數(shù)字PCR技術(shù)無需設置外部核酸標準，可實現(xiàn)核酸模板的絕對定量分析，在病原體基因檢測方面具有廣闊的應用前景。本研究旨在根據(jù)TTSuV的核酸序列，建立特異性強、敏感性高的TTSuV數(shù)字PCR檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從江西省的4個規(guī)模豬場，采取豬血清樣本92份。

1.2 儀器和試劑

1.2.1 主要儀器。核酸抽提純化系統(tǒng)（MagNA Pure LC2.0，瑞士Roche公司）；Nanodrop 3300超微量紫外分光光度計（美國賽默飛世爾公司）；實時熒光PCR擴增儀（Biorad CFX96，美國Biorad公司）；基因擴增儀（ABI9700，美國ABI公司）；Raindrop數(shù)字PCR儀（美國RainDance Technologies公司）。

1.2.2 主要試劑。病毒DNA提取試劑盒（MagNA Pure LC總核酸分離試劑盒）；實時熒光PCR試劑盒（美國Life Technology公司）；數(shù)字PCR試劑盒（美國RainDance Technologies公司）； PicoGreen雙鏈DNA檢測試劑盒（美國RainDance Technologies公司）。所有引物、探針由大連寶生物公司合成。

1.2.3 引物設計。從GenBank下載TTSuV所有靶基因的序列，用Lasergene進行核酸序列比對，并截取其中最一致的序列，設計實時熒光PCR引物、探針，分別是針對TTSuV1a的Q-F1和Q-R1引物對及探針Q-P1，針對TTSuV1b的Q-F2和Q-R2引物對及探針Q-P2，并驗證其保守性；根據(jù)實時熒光PCR引物所包含的核酸片段，選擇克隆用引物，分別為針對TTSuV1a的引物S1、S2，針對TTSuV1b的引物T1、T2[10]（表1）。

表1 引物序列

1.3 試驗方法

1.3.1 病毒DNA的提取及標準質(zhì)粒模板的制備

1.3.1.1 病毒DNA的提取。用核酸抽提純化系統(tǒng)MagNA Pure LC2.0，并使用該設備配套的核酸提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取樣品總核酸，用60 μL TE緩沖液將其充分溶解，- 20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2 目的基因的克隆、測序。以提取的病毒DNA為模板，分別用引物S1和S2、T1和T2進行TTSuV1a、TTSuV1b的全序列擴增，將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳及鑒定后，獲取重組質(zhì)粒，并進行PCR、酶切及測序驗證，驗證后的重組質(zhì)粒分別命名為T-TTSuV1a和T-TTSuV1b。

1.3.1.3 質(zhì)粒T-TTSuV1a和T-TTSuV1b的定量。用PicoGreen試劑盒中的DNA干粉標準品，按照說明書的要求配制成1 mg/mL的標準品工作液并進行倍比稀釋，用ND3300紫外分光光度計檢測熒光值，作直線回歸，制備標準曲線。同時以1×TE緩沖液作為空白對照，測定質(zhì)粒T-TTSuV1a和T-TTSuV1b及空白對照的熒光值，并根據(jù)標準曲線進行質(zhì)粒濃度的計算。

1.3.2 數(shù)字PCR反應體系及擴增條件的優(yōu)化?；谙冗M行PCR反應，再進行熒光檢測的數(shù)字PCR的原理，在反應體系和反應條件的摸索過程中，先用qPCR驗證引物、探針的可靠性，同時調(diào)整Taq酶、引物探針用量、循環(huán)參數(shù)和循環(huán)條件，使之達到最佳反應條件，再進行數(shù)字PCR反應體系和條件的微調(diào)。

1.3.3 數(shù)字PCR反應的靈敏度。將重組質(zhì)粒T-TTSuV1a和T-TTSuV1b進行梯度稀釋，分別標記為S0～S8，根據(jù)紫外分光光度計測定結(jié)果計算質(zhì)粒濃度在總體積為20 μL的數(shù)字PCR反應體系中加入稀釋好的S0～S8的DNA模板2 μL，使拷貝數(shù)分別為107、106、105、104、103、102、101、100數(shù)量級，進行靈敏度研究。數(shù)字PCR擴增的循環(huán)條件為：95 ℃預變性90 s；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存反應產(chǎn)物。

1.3.4 數(shù)字PCR反應的特異性試驗。按照常規(guī)方法，利用Roche MagNA Pure LC 2.0，對豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬細小病毒（Porcine Parvovlirus，PPV）、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型（Porcinecircovirus type2，PCV2）等病毒提取核酸，分別使用1.3.2的方法，對上述病毒的核酸進行檢測，以確定該方法的特異性（分別以T-TTSuV1a和T-TTSuV1b為陽性對照，DEPC水為陰性對照）。

1.3.5 數(shù)字PCR反應的重復性試驗。分別設置3個不同濃度的重組質(zhì)粒T-TTSuV1a和T-TTSuV1b，應用1.3.2的方法，在同一反應條件下進行5次獨立試驗，以確定此方法的批內(nèi)重復性；連續(xù)5天對相同的樣品進行檢測，以確定此方法的批間重復性。

1.3.6 臨床樣本檢測的初步應用。將本研究建立的數(shù)字PCR檢測方法應用于實驗室檢測，從江西省4個規(guī)模豬場采集血清樣本92份，提取DNA，進行數(shù)字PCR檢測。

2 結(jié)果

2.1 優(yōu)化后的探針濃度及反應條件

采用qPCR對探針的濃度進行優(yōu)化和確定，使TTSuV1a和TTSuV1b反應體系內(nèi)的探針濃度分別 為50、100、150、200、250、300、350和400 nmol/L。當TTSuV1a探針濃度為250 nmol/L時，熒光信號強度較高，且不再隨著濃度的增加而增加；TTSuV1b的最佳探針濃度為300 nmol/L。后續(xù)試驗中，將TTSuV1a和TTSuV1b PCR反應的探針濃度分別設置為250 nmol/L和300 nmol/L。

采用qPCR對反應條件進行優(yōu)化和確定。對T-TTSuV1a標準品10-1的稀釋質(zhì)粒，在53～65 ℃范圍內(nèi)的8個梯度退火溫度，進行熒光定量PCR反應。結(jié)果顯示：溫度越高，擴增效率越低（圖1）；退火溫度為55 ℃時擴增效率最高，E=101.9%。對TTSuV1b標準品10-1的稀釋質(zhì)粒，在53～65℃范圍內(nèi)的8個不同退火溫度，進行熒光定量PCR反應。結(jié)果顯示：溫度越高，擴增效率越低（圖2）；退火溫度為55 ℃時，擴增效率最高，E=97.5%。

T-TTSuV1a和TTSuV1b優(yōu)化后的反應條件均為：95 ℃預變性90 s；95 ℃變性10 s，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸30 s，40個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存反應產(chǎn)物。

圖1 TTSuV1a標準品（10-1）在53～60 ℃范圍內(nèi)的實時熒光PCR反應結(jié)果

圖2 TTSuV1b標準品（10-1）在53～60 ℃范圍內(nèi)的實時熒光PCR反應結(jié)果

應用優(yōu)化后的反應體系和條件進行數(shù)字PCR試驗，TTSuV1a和TTSuV1b擴增的散點圖分別見圖3、圖4。經(jīng)過優(yōu)化的PCR體系對TTSuV的擴增效果良好，其中陽性微滴和陰性微滴明顯分成兩簇，而且中間彌散的微滴數(shù)目很少，表明經(jīng)過優(yōu)化確定的數(shù)字PCR探針濃度和擴增體系適合對TTSuV進行定量分析。

圖3 微滴數(shù)字PCR方法擴增TTSuV1a的散點圖

2.2 數(shù)字PCR反應的靈敏度

將TTSuV1a和TTSuV1b的DNA模板稀釋后，進行數(shù)字PCR反應，反應體系S1～S8生成的可接受總微滴數(shù)和陽性微滴數(shù)分布見圖5（TTSuV1a）和圖6（TTSuV1b）。從圖中可發(fā)現(xiàn)，DNA樣品經(jīng)稀釋后再擴增，其陽性微滴數(shù)目隨著濃度的降低而逐漸減少。在數(shù)字PCR反應中，當20 μL反應液中的拷貝數(shù)為100數(shù)量級時，TTSuV1a檢測到5個擴增，TTSuV1b檢測到4個擴增，且對照組均無擴增，說明數(shù)字PCR對TTSuV1a和TTSuV1b的檢測靈敏度均可達到單個拷貝。

圖4 微滴數(shù)字PCR方法擴增TTSuV1b的散點圖

圖5 數(shù)字PCR方法擴增TTSuV1a的靈敏度

圖6 數(shù)字PCR方法擴增TTSuV1b的靈敏度

2.3 特異性試驗

采用本實驗建立的TTSuV1a和TTSuV1b 實時熒光PCR方法，對TTSuV1a和TTSuV1b及PPV、PCV-2和PRV 3種病毒培養(yǎng)液提取的DNA進行數(shù)字PCR方法特異性驗證。結(jié)果表明，TTSuV1a和TTSuV1b均得到了特異性擴增，其他病毒的檢測均為陰性，且TTSuV1a和TTSuV1b兩者之間無交叉反應，表明建立的數(shù)字PCR方法特異性良好（圖7、圖8）。

圖7 數(shù)字PCR方法擴增TTSuV1a的特異性

圖8 數(shù)字PCR方法擴增TTSuV1b的特異性

2.4 重復性試驗

對TTSuV1a和TTSuV1進行數(shù)字PCR檢測的批內(nèi)和批間重復試驗。分別取模板濃度為103、102、101的TTSuV1a和TTSuV1b質(zhì)粒標準品，在同一反應條件下，分別做5個批內(nèi)重復和批間重復。結(jié)果顯示，TTSuV1a和TTSuV1b數(shù)字PCR方法批內(nèi)重復變異系數(shù)均小于1%，批間重復變異系數(shù)均小于3%（表2、表3），表明方法重復性好。

表2 數(shù)字PCR檢測TTSuV1a批內(nèi)及批間重復試驗結(jié)果

表3 數(shù)字PCR檢測TTSuV1b批內(nèi)及批間重復試驗結(jié)果

2.5 臨床樣品檢測的初步應用

對92份臨床血液樣本提取核酸，采用本研究建立的數(shù)字PCR方法檢測。結(jié)果表明，92份樣品中，陽性樣品份數(shù)為17，每個樣品的檢測結(jié)果均與其背景信息相吻合。

3 討論

當前，動物疫病的主要檢測手段以qPCR為主。qPCR檢測是通過標準曲線來計算樣品中含有的目標基因拷貝數(shù)的，依賴于Ct值的重現(xiàn)性、Ct值與起始模板的線性關(guān)系，其最終計算出的目標基因拷貝數(shù)是相對定量的。在日常動物疫病檢測中，經(jīng)常會出現(xiàn)當靶標序列含量很低時，qPCR的Ct值處于臨界值附近，這時應用qPCR無法得到準確的結(jié)果，需要一種更加靈敏的方法來檢測低含量的核酸，此時數(shù)字PCR技術(shù)應運而生。這是一種新興的定量技術(shù)，其操作步驟是先進行分液，即將一定體積的PCR反應體系快速、均一地制備成數(shù)百萬個皮升大小的油包水液滴，確保真正的單分子擴增。分液完成后，收集所有液滴進行常規(guī)的PCR擴增。與qPCR不同，數(shù)字PCR不對擴增過程進行實時監(jiān)測，而是檢測反應終點的熒光信號。對結(jié)果的判讀是基于反應終點閱讀到的熒光信號強度，結(jié)合無模板對照和陰陽性對照劃出相應的閾值。將信號強度位于閾值之上的微滴判定為陽性微滴，位于閾值之下的判定為陰性微滴，并利用泊松分布統(tǒng)計學公式計算出目的DNA分子濃度。該技術(shù)在檢測時不需構(gòu)建標準曲線，即可直接得到絕對定量。當前，數(shù)字PCR技術(shù)被大力推廣用于特定基因及核酸的絕對定量檢測中，尤其是對微量樣品的絕對定量。數(shù)字PCR以qPCR為基礎，是對單個微滴中的目標基因進行檢測，可直接計算出目標基因DNA分子的個數(shù)，是對起始樣品的絕對定量，適用于需要絕對定量及qPCR中依賴Ct值不能很好分辨檢測結(jié)果的情況。

數(shù)字PCR是一種絕對定量方法。數(shù)字PCR體系中的DNA濃度若過高，會導致微滴不滿足泊松分布原理，使定量結(jié)果顯著偏離真實值，無法實現(xiàn)數(shù)字PCR的準確定量。因此，DNA濃度的準確定量對于方法的建立十分關(guān)鍵。本文對質(zhì)粒模板的濃度測定，未采用傳統(tǒng)的OD260/280測量法，而是采用ND3300紫外分光光度計，結(jié)合PicoGreen雙鏈DNA檢測試劑盒進行。這是因為應用OD260/280測量核酸濃度時，單鏈核苷酸、單核苷酸和樣本中的雜質(zhì)都會對結(jié)果產(chǎn)生干擾，同時光吸收不能區(qū)分DNA和RNA，但PicoGreen染料法能夠排除上述干擾，使得測量的DNA濃度更加準確。本文選取了豬細環(huán)病毒DNA序列的保守區(qū)設計引物探針，并通過qPCR反應測試其特異性，在后續(xù)的數(shù)字PCR試驗中，NTC均沒有檢測到陽性微滴，可見該體系中無污染，無非特異性擴增，方法的特異性良好，經(jīng)反復調(diào)整反應體系確定其最佳濃度，以此來摸索數(shù)字PCR的最佳反應條件和反應體系。

過去，對豬細環(huán)病毒的研究主要集中在檢測方法及感染率的調(diào)查等方面[10-11]。近年來，隨著對其研究的深入，對檢測方法的要求也越來越高，逐漸出現(xiàn)了實時熒光PCR法、PCR-DHPLC等[12-13]。本研究在實時熒光PCR方法的基礎上，將數(shù)字PCR方法引入到該病毒的檢測中，建立了數(shù)字PCR檢測方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對豬細環(huán)病毒的準確定量檢測，且該方法靈敏度高、特異性強、使用方便，可在短時間內(nèi)出具定量結(jié)果，實現(xiàn)了痕量病原檢測，適用于對豬細環(huán)病毒早期感染的鑒定，對豬細環(huán)病毒的致病性及機理的進一步研究具有重要意義。

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（責任編輯：朱迪國）

Development of a Digital PCR Assay for Quantitative Detection of Torque Teno Sus Virus

Yang Chunhua1，Sun Jie2，Luo Qiuhong1，Zhu Jianxin1，Sun Siyang1，Zhou Yan3，Zhong Yi，Xia Biao1

（1. Jiangxi Entry-exit Inspection & Quarantine Bureau，Nanchang，Jiangxi 330002；2. Shenzhen Entry-exit Inspection & Quarantine Burea，Shenzhen，Guangdong 518045；3. Nanchang University，Nanchang，Jiangxi 330002）

[Objective] In order to accurately and quantitatively detect the Torque Teno Sus virus（TTSuV）. [Methods] Specific primers and probes were designed and synthesized based on the sequence of TTSuV，then a digital PCR detection assay（dPCR）was established. After optimizing the working concentration of primers and probes，the sensitivity and specificity of the established reaction system were tested，and preliminary application was carried out. [Results] The optimal concentration of primers for both TTSuV1a and TTSuV1b genes had the same value of 250 nmol/L，and the optimal concentration of probes for the two genes was 300 nmol/L. As to the sensitivity of dPCR method，results showed single copy of TTSuV1a and TTSuV1b could be detected. Then its specificitywas evaluated by detecting TTSuV，Parvovirus（PPV），Porcine circovirus type 2（PCV-2）and Pseudorabies virus（PRV）simultaneously，and no cross reaction was observed. Furthermore，good repeatability of the method was confirmed by intra and inter assay. At last，92 clinical serum samples derived from our laboratory were conducted detection，results of which showed good consistence with their background information. [Conclusion]The established dPCR method was specific，sensitive and repeatable.，and it could be used in quantitative detection of TTSuV.

TTSuV；real-time PCR；digital PCR

S851.34

A

1005-944X（2017）04-0080-07

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.024

江西省科技計劃項目（20151BBF60048）