豬偽狂犬病毒變異株AH02LA單因子發(fā)病模型的建立

毛愛(ài)民，范 鋒，王繼春，馮志新，華利忠，劉劍鋒

（1. 無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無(wú)錫 214016；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210014）

豬偽狂犬病毒變異株AH02LA單因子發(fā)病模型的建立

毛愛(ài)民1，范 鋒1，王繼春2，馮志新2，華利忠2，劉劍鋒3

（1. 無(wú)錫市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，江蘇無(wú)錫 214016；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇南京 210014；3. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，江蘇南京 210014）

2011年以來(lái)，豬偽狂犬病毒（PRV）變異株在我國(guó)多地區(qū)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究以主要豬病病原為陰性的仔豬為基礎(chǔ)，建立了PRV變異株AH02LA單因子發(fā)病模型，并研究了其主要病理學(xué)變化。研究發(fā)現(xiàn)PRV會(huì)引起仔豬非化膿性腦炎，這一病理變化將有助于豬偽狂犬病的臨床快速準(zhǔn)確診斷。

豬偽狂犬病毒；變異株；發(fā)病模型；病理學(xué)；豬

豬偽狂犬?。≒seudorabies，PR），也叫奧耶茲氏病（Aujeszky's disease，AD），是由豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的多種家畜和野生動(dòng)物共患的一種急性傳染病[1]。2011年以來(lái)，PR在我國(guó)部分地區(qū)暴發(fā)流行，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[2-3]。很多研究表明，目前在我國(guó)流行的PRV毒株為變異株[4]。高通量測(cè)序表明這些變異株處于一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的分支，為Ⅱ型PRV，有別于傳統(tǒng)的Ⅰ型PRV[5]，這是引起此次PR暴發(fā)的主要原因。研究顯示，新型PRV在致病性方面與傳統(tǒng)的PRV相比，其致病力明顯增強(qiáng)，感染豬發(fā)病更快，臨床癥狀和病理變化更強(qiáng)[6]。然而目前所有關(guān)于新型PRV的致病性研究都是基于臨床發(fā)病豬或普通豬的人工發(fā)病模型，無(wú)法避免其他病原導(dǎo)致的影響。本研究以主要豬疫病病原全陰性豬為基礎(chǔ)，建立了新型PR發(fā)病模型，并研究其病理組織學(xué)變化，為新型PRV的致病性研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

1.1.1 主要試劑。PRV gB抗體ELISA檢測(cè)試劑盒、PRV gE抗體ELISA檢測(cè)試劑盒、豬瘟（CSF）抗體ELISA檢測(cè)試劑盒、豬高致病性藍(lán)耳?。≒RRS）抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和豬肺炎支原體（MHP）抗體ELISA檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自美國(guó)IDEXX生物科技有限公司；豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）抗體ELISA檢測(cè)試劑盒、豬O型口蹄疫（FMD-O）抗體檢測(cè)試劑盒，均購(gòu)自韓國(guó)金諾（JBT）公司；PCR試劑，購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司。其他所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.2 主要儀器。PCR儀（美國(guó)PE公司）；Kodak凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Kodak公司）；組織切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；DENLEY DRAGON Wellscan MK 3酶標(biāo)儀（芬蘭 Thermo公司）；PYX-DHS數(shù)顯隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；TGL-168離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2 病毒

PRV變異株AH02LA，病毒含量為 107.1TCID/mL，由國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心分離鑒定，制備批號(hào)為20141009，-70 ℃保存。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物及處理

未吃乳的6周齡健康仔豬10頭，品種為外三元，根據(jù)Huang等[7]的方式培育所得，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所提供，未進(jìn)行任何疫苗免疫。所有仔豬經(jīng)商品化試劑盒檢測(cè)，其PRV gB、PRV gE、PRRSV、CSFV、PCV2、MHP和FMD血清抗體均為陰性。將10頭仔豬隨機(jī)分為2組，每組5頭。試驗(yàn)組通過(guò)鼻腔攻毒和肌肉注射PRV變異毒株AH02LA（攻毒劑量為107.1TCID/mL，鼻腔和肌肉注射各1 mL/頭）。攻毒后，每天檢查豬只體溫和臨床癥狀。

1.4 剖檢及病理學(xué)分析

試驗(yàn)組仔豬死亡后，立即對(duì)其剖檢，對(duì)照組仔豬在攻毒后第8天，對(duì)其實(shí)施統(tǒng)一剖檢；記錄所有臟器的肉眼變化，并采集肺臟、肝臟、脾臟、扁桃體、淋巴結(jié)、大腦等組織樣品，用中性福爾馬林固定，進(jìn)行常規(guī)石蠟切片制作，HE染色，鏡檢。

1.5 病原檢測(cè)

取試驗(yàn)組仔豬的扁桃體和腦組織，用常規(guī)方法提取病毒DNA，按彭金美等[8]的PCR方法鑒定PR病原。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn)

試驗(yàn)組所有仔豬在接種PRV變異毒株AH02LA后第3天體溫開始升高，達(dá)到或超過(guò)40.5 ℃，其中有1頭豬出現(xiàn)PR臨床癥狀，表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、咳嗽、打噴嚏；到第5天，所有試驗(yàn)仔豬出現(xiàn)典型PR臨床癥狀，體溫普遍超過(guò)41 ℃，最高的達(dá)到42.1 ℃。除上述臨床癥狀外，還出現(xiàn)呼吸困難、共濟(jì)失調(diào)和驚厥現(xiàn)象，并首次出現(xiàn)死亡；到第7天，所有試驗(yàn)豬全部死亡。在整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)照組仔豬體溫沒(méi)有明顯變化，也沒(méi)有明顯臨床癥狀。

2.2 肉眼病理變化

試驗(yàn)組仔豬的肉眼明顯變化主要有：腦組織水腫、充血（圖1A）；腎臟有紅色針尖狀出血點(diǎn)（圖1B），有的腫大，出現(xiàn)黃疸；扁桃體出血（圖1C），兩頭有潰瘍；肝臟出現(xiàn)白色針尖狀壞死點(diǎn)（圖1D）；肺臟出血、水腫（圖1E）；淋巴結(jié)腫大出血（圖1F）。

2.3 病理組織學(xué)變化

取病變組織，常規(guī)石蠟切片，HE染色，鏡檢。結(jié)果顯示：對(duì)照組豬肺臟、肝臟、腎臟、淋巴結(jié)和腦等組織基本正常，無(wú)異常病理變化。試驗(yàn)組仔豬主要病變?yōu)椋焊闻K門靜脈、匯管區(qū)以及竇狀隙淤血，并伴有肝小葉大量出血，干細(xì)胞變性壞死（圖2A）；肺臟的肺泡內(nèi)大量出血，肺間質(zhì)增寬（圖2B）；腦組織呈現(xiàn)噬神經(jīng)元現(xiàn)象等非化膿性腦炎典型病變（圖2C）；脾臟的淋巴細(xì)胞缺失，有壞死灶（圖2D）。

圖1 PRV變異株AH02LA感染豬的肉眼變化

圖2 PRV變異株AH02LA感染豬的顯微病變（HE，×10）

2.4 病原檢測(cè)

取豬鼻拭子、腦組織以及扁桃體樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，結(jié)果在5頭試驗(yàn)豬的腦組織和扁桃體中均能檢測(cè)到PR病原，而對(duì)照組全為陰性。

3 討論

新PRV變異株感染主要表現(xiàn)為仔豬出生后有腹瀉和神經(jīng)癥狀，病死率較高。Gu等[9]采用PRV新變異株ZJ01的對(duì)不同日齡實(shí)驗(yàn)豬的致病性進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該毒株不僅能引起24日齡斷奶仔豬100%死亡，還能引起80～85日齡豬100%死亡，證明PRV ZJ01分離株毒力增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)采用主要豬病病原均為陰性的斷奶仔豬進(jìn)行PRV變異毒株AH02LA攻毒試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該變異株感染仔豬3天后就可觀察到典型PR臨床癥狀，且5天內(nèi)可致部分豬死亡，7天后可致所有感染豬死亡。這一結(jié)果與王繼春等[10]采用同樣的PRV毒株感染臨床健康豬所觀察到的臨床癥狀及死亡情況一致，也與Gu等[9]的研究結(jié)果一致，說(shuō)明PRV變異毒株AH02LA毒力超強(qiáng)。

Wu等[11]在我國(guó)東北等地區(qū)開展PRV調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PRV感染的主要病變?yōu)榉闻K壞死、腎臟和淋巴結(jié)出血、扁桃體壞死和脾臟淋巴細(xì)胞缺失等。這些變化在臨床上容易誤診為高致病性豬藍(lán)耳病和豬瘟，因此增加了PR的臨床快速診斷難度。本研究采用主要豬病病原均為陰性的斷奶仔豬進(jìn)行PR病理學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)PRV變異毒株AH02LA所造成的病理學(xué)變化主要為：腦組織水腫、充血；腎臟有紅色針尖狀出血點(diǎn)，扁桃體出血；肝臟出現(xiàn)白色針尖狀壞死點(diǎn)；肺臟出血，淋巴結(jié)腫大、出血；脾臟出現(xiàn)紅色壞死灶。該結(jié)果與高致病性藍(lán)耳病及豬瘟的大部分臨床表現(xiàn)相似，依然難以區(qū)分。但PRV會(huì)引起非化膿性腦炎，主要表現(xiàn)為中樞神經(jīng)癥狀，病變特征為灰質(zhì)和白質(zhì)的非化膿性腦膜腦炎和神經(jīng)節(jié)炎：血管套以單核細(xì)胞為主，有少量粒細(xì)胞；單核細(xì)胞通常發(fā)生明顯的核固縮和核碎裂；神經(jīng)元灶性壞死，周圍聚集有單核細(xì)胞或病變神經(jīng)元的散在分布[12-14]。這一病理變化有助于PR的臨床快速準(zhǔn)確診斷。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Establishment of Pseudorabies Model Induced by Single Factor of PRV Variant（AH02LA Strain）

Mao Aimin1，F(xiàn)an Feng1，Wang Jichun2，F(xiàn)eng Zhixin2，Hua Lizhong2，Liu Jianfeng3

（1. Wuxi Animal Disease Prevention and Control Center，Wuxi，Jiangsu 214016；2. Institute of Veterinary Medicine of Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology，National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products of MoA，Nanjing，Jiangsu 210014，3. Nanjing Agricultural University，Nanjing，Jiangsu 210014）

Since 2011，variants of Pseudorabies virus（PRV）have been widely prevalent in many areas of China，causing severe economic loss. In this study，a single factor infection model of PRV was established by using the variant PRV strain AH02LA and negative piglets（piglets without most pathogens of swine diseases），and its pathological changes were studied. Results showed PRV infection could cause non-suppurative encephalitis of piglets，the study would provide reference for rapid and accurate diagnosis of PR.

Pseudorabies virus；variant strain；infection model；pathology；pigs

S851.3

B

1005-944X（2017）04-0086-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.04.025

江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目“生豬偽狂犬病綜合防控技術(shù)的推廣應(yīng)用”（SXGC[2015]024）