LAS對草金魚毒性效應(yīng)研究

張?jiān)骑w　王茗　劉華倩　劉亞琦　王莉

摘 要：本試驗(yàn)的試驗(yàn)魚為草金魚，通過采用靜水式試驗(yàn)，研究了十二烷基苯磺酸鈉（LAS）對草金魚的急性毒性影響；并在急性毒性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，研究了亞急性條件下LAS對草金魚肝臟組織超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響，初步探討了LAS對草金魚的毒性效應(yīng)。LAS對草金魚的急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，在水溫（15.0±1.0）℃條件下，LAS對草金魚的毒性較強(qiáng)，24h，48h，72h，96h的半致死濃度（LC50）分別是12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L。在LAS濃度為2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L的亞急性條件下暴露96h，試驗(yàn)結(jié)果表明，LAS質(zhì)量濃度低于3.6mg/L時(shí)，LAS對肝臟中SOD酶活性表現(xiàn)出激活作用；LAS濃度高于3.6mg/L時(shí)，LAS對肝臟中的SOD酶活性表現(xiàn)出抑制作用。

關(guān)鍵詞：草金魚；十二烷基苯磺酸鈉；半致死濃度；超氧化物歧化酶（SOD）

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，人們生活水平的提高，各種洗滌劑被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域，每年消耗量巨大。洗滌劑的重要組成成分是表面活性劑，十二烷基苯磺酸鈉（LAS）是目前使用最普遍的陰離子表面活性劑。陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉（LAS）隨著生活污水和工業(yè)廢料等大量排入自然水體，造成水生生物不能正常生長，破壞了水體環(huán)境的生態(tài)平衡。十二烷基苯磺酸鈉（LAS）作為水體中的常見污染物，已被列為《城鎮(zhèn)污水處理廠污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB18918-2002）的基本控制項(xiàng)目。盡管十二烷基苯磺酸鈉（LAS）在水體中易生物降解，但是LAS在環(huán)境中的吸附、沉淀和生物降解等遷移行為十分復(fù)雜。已有研究表明，LAS在環(huán)境和生物體內(nèi)有累積，在低濃度條件下對魚類產(chǎn)生慢性毒性。河流和湖泊中的表面活性劑污染十分嚴(yán)重，對漁業(yè)和人們的生活健康具有潛在危害。因此研究陰離子表面活性劑（LAS）對魚類的毒性效應(yīng)十分必要。

水生生物毒性試驗(yàn)在研究水體中化學(xué)污染物的環(huán)境效應(yīng)方面有著重要作用。魚類作為對水中發(fā)生的各種物理、化學(xué)和生物性的變化反應(yīng)十分靈敏的一種水生生物，是水生生物毒性試驗(yàn)經(jīng)常選取的受試對象之一。表面活性劑對魚的急性毒性研究和對魚的各項(xiàng)生理指標(biāo)的影響不斷被報(bào)道，研究結(jié)果表明表面活性劑對魚類有較大毒性，會(huì)對魚的生理指標(biāo)產(chǎn)生影響[1-2]。目前，從分子水平研究水中污染物對魚體內(nèi)酶、蛋白質(zhì)等生化反應(yīng)的影響，用于判斷污染物對魚的毒性作用和探究污染物對魚的致毒機(jī)理成為毒性試驗(yàn)研究的新方向[2-5]。超氧化物歧化酶（SOD）是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，其主要作用是清除生物體內(nèi)的自由基。它通過催化反應(yīng)2O2-+2H+→H2O2+O2可以把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫，隨后過氧化氫被體內(nèi)的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）立即分解為無害的水。超氧歧化酶（SOD）其活性隨污染物的脅迫作用而發(fā)生改變，可以間接反映環(huán)境中有毒有害物質(zhì)對魚的毒性效應(yīng)[5]。目前，陰離子表面活性劑（LAS）對魚的毒性研究選取的魚有草魚、彭澤鯽等，但是陰離子表面活性劑（LAS）對具有一定觀賞價(jià)值，經(jīng)濟(jì)效益高的草金魚的毒性研究還鮮見報(bào)道。

因此，本研究以草金魚為試驗(yàn)對象，通過急性毒性試驗(yàn)研究LAS對魚類產(chǎn)生毒害作用的表現(xiàn)，找出產(chǎn)生不良影響的閾濃度。為進(jìn)一步研究陰離子表面活性劑對草金魚的毒性機(jī)制，本試驗(yàn)以SOD活性變化為評價(jià)指標(biāo)，通過采用暴露實(shí)驗(yàn)法，研究在亞急性條件下陰離子表面活性劑對草金魚肝臟組織中SOD活性的影響，目的是為了利用魚體內(nèi)的酶活性變化來評價(jià)陰離子表面活性劑對水生生物的毒性效應(yīng)，為水環(huán)境中該類化合物污染的早期預(yù)報(bào)和防治提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)受試魚為草金魚，從鄭州市滎陽市王村鎮(zhèn)北黃河灘養(yǎng)殖場購買，平均體長為3.4cm，平均體重為1.2g。試驗(yàn)用的草金魚是從養(yǎng)殖場運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室的魚苗，首先用自來水將魚苗馴養(yǎng)7天，自來水需經(jīng)曝氣脫氯24h才能使用。馴養(yǎng)水溫為（15±1.0）℃（預(yù)試驗(yàn)與正式試驗(yàn)水溫與馴養(yǎng)時(shí)相同），pH為7.0～8.0，溶解氧為9.0mg/L，馴養(yǎng)水水質(zhì)符合魚的生活水質(zhì)要求。馴養(yǎng)期間需喂食和換水。喂食頻率為兩天一次，定時(shí)喂取，換水頻率為一天一次。期間及時(shí)清理魚屎并撈出死魚。試驗(yàn)前1d和試驗(yàn)期間不再喂食和換水。

試驗(yàn)所用表面活性劑為十二烷基苯磺酸鈉，純度為分析純，分子式C18H29NaO3，相對分子質(zhì)量348.48，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。SOD試劑盒購自南京建成生物工程研究所，LAS測定方法采用混合指示劑程序加入法（MIST法）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 急性毒性試驗(yàn)

正式試驗(yàn)前應(yīng)首先進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)[6]，根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)方法確定魚的全存活和全致死LAS濃度，從而確定試驗(yàn)濃度的大致范圍。由預(yù)試驗(yàn)確定的濃度范圍，設(shè)置6個(gè)質(zhì)量濃度5.2，5.9，7.0，8.4，9.8，13.2mg/L及1個(gè)空白對照（CK）0.0mg/L，設(shè)置7個(gè)魚缸，每個(gè)魚缸隨機(jī)放置10條草金魚，時(shí)間為96h，魚缸為玻璃缸。

試驗(yàn)期間，每天兩次定時(shí)測定試驗(yàn)數(shù)據(jù)，詳細(xì)觀察草金魚中毒時(shí)的癥狀和活動(dòng)情況并記錄。在試驗(yàn)開始的24，48，72，96h分別記錄試驗(yàn)草金魚的死亡數(shù)（是用撈魚的網(wǎng)觸碰魚，無反應(yīng)即可判定為死亡），根據(jù)草金魚的死亡率，用直線內(nèi)插法求出半致死濃度。

1.2.2 LAS對SOD活性影響試驗(yàn)

采用靜水式試驗(yàn)，根據(jù)96h半致死濃度（LC50），將LAS質(zhì)量濃度設(shè)置為0.0，2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L共6個(gè)梯度，每個(gè)濃度梯度設(shè)3組平行樣，共18個(gè)魚缸，每個(gè)魚缸放魚數(shù)量和方式與急性毒性試驗(yàn)相同，試驗(yàn)時(shí)間為96h。

1.2.3 SOD活性的測定

在試驗(yàn)開始96h后，撈出魚缸內(nèi)活魚殺死，迅速將魚的肝臟組織取出，放入冰冷的生理鹽水中洗凈血液，再用濾紙吸干水分。準(zhǔn)確稱取組織重量，按照重量（g）：體積（ml）=1：9的比例加入9倍體積的生理鹽水，剪碎組織，在研缽中充分研磨制備勻漿。以3000r/min的轉(zhuǎn)速用離心機(jī)離心10min，取上清液即10%勻漿上清液測定SOD。SOD活性的測定采用SOD試劑盒及酶標(biāo)儀介紹的方法。在本反應(yīng)體系中，SOD以每毫克組織中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位（U），即U/mg組織。

2 結(jié)果分析

2.1 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

對草金魚的急性毒性試驗(yàn)表明，水中的LAS質(zhì)量濃度越高，草金魚的中毒現(xiàn)象越明顯，死亡的速度越快數(shù)量越多。試驗(yàn)開始時(shí)，魚缸內(nèi)的魚表現(xiàn)出不同的活動(dòng)情況，一部分魚活動(dòng)遲緩，另一部分魚易受驚嚇在魚缸內(nèi)亂竄。隨著中毒時(shí)間的延長，一部分魚游動(dòng)出現(xiàn)傾斜的情況，逐步喪失活動(dòng)能力，活動(dòng)進(jìn)一步遲緩，即使用網(wǎng)去觸碰也不躲避；另一部分魚則出現(xiàn)發(fā)顫的情況，游動(dòng)過程中身體搖動(dòng)不止。高濃度區(qū)的草金魚慢慢停止活動(dòng)，直至死亡。

表1記錄了LAS對草金魚急性毒性試驗(yàn)的致死數(shù)據(jù)和LAS對草金魚的半致死濃度。以LAS的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，草金魚的死亡率為縱坐標(biāo)繪制死亡百分率對試驗(yàn)物質(zhì)濃度的曲線，該曲線為一條S形的關(guān)系曲線，從引起50%死亡率的內(nèi)插濃度值得到值。由表1可知，LAS對草金魚24h，48h，72h，96h的半致死質(zhì)量濃度分別為12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L，LAS對魚表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性。表面活性劑是一種可溶特殊的脂類化合物。其分子結(jié)構(gòu)一端為親水基團(tuán)，一端為疏水基團(tuán)，因此具有親水性和親脂性。程呂柏[7]等認(rèn)為，LAS分子引起動(dòng)物細(xì)胞死亡的原因主要是破壞了細(xì)胞膜。細(xì)胞膜的破壞作用包括以下兩個(gè)方面，一是LAS分子中的疏水基團(tuán)長碳?xì)滏湶糠秩菀撞迦爰?xì)胞膜的磷脂雙分子層引起膜結(jié)構(gòu)的損傷，二是十二烷基苯磺酸鈉（LAS）中的苯磺酸根離子易與細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)結(jié)合，改變膜蛋白質(zhì)的構(gòu)象或?qū)е碌鞍踪|(zhì)變性，使膜的通透性改變。

2.2 LAS對草金魚肝臟中SOD酶活性的影響

由表2可知，肝臟組織中SOD酶活性在LAS質(zhì)量濃度為3.6mg/L時(shí)影響顯著。LAS質(zhì)量濃度低于3.6mg/L時(shí)，肝臟組織中SOD酶活性高于空白組的SOD酶活性。LAS質(zhì)量濃度高于3.6mg/L時(shí)，肝臟組織中的SOD酶活性迅速降低且低于空白組的SOD酶活性。雷鳴[2]等研究結(jié)果表明，LAS用量低于4.0mg/L時(shí)，LAS對彭澤鯽鰓、肝臟組織中SOD具有激活作用；LAS用量不低于4.0mg/L時(shí)，LAS對彭澤鯽鰓、肝臟組織中SOD活性的影響卻表現(xiàn)出抑制作用，這與本試驗(yàn)結(jié)果相近。

LAS質(zhì)量濃度低于3.6mg/L時(shí)，由試驗(yàn)組和空白組的酶活力值對比結(jié)果可知，LAS肝臟中SOD酶活性得到提高。這是因?yàn)槭榛交撬徕c（LAS）對草金魚的細(xì)胞造成傷害，產(chǎn)生高于正常值的超氧自由基，為了維持細(xì)胞的正常生理功能SOD酶提高活性以清除多余的超氧自由基。但是SOD酶消除能力是有限的，且其正常發(fā)揮功能必須滿足酶蛋白結(jié)構(gòu)不被破壞。LAS質(zhì)量高于3.6mg/L時(shí)，草金魚肝臟中產(chǎn)生的超氧自由基過多，超出了SOD酶的消除能力，同時(shí)酶蛋白結(jié)構(gòu)被破壞，SOD酶功能受損，SOD活力降低甚至為零。隨著LAS濃度的增加，SOD酶活性這種抑制作用也加強(qiáng)。LAS對草金魚肝臟有較大傷害作用，且能夠在肝臟中累積。

李偉民、丁詩華[8]等研究結(jié)果表明，生物受到輕度逆境脅迫時(shí)，抗氧化酶活性往往升高，但受到重度逆境脅迫時(shí)，抗氧化酶活性通常降低，這與本試驗(yàn)中草金魚受到LAS單一污染時(shí)SOD變化規(guī)律基本一致。已有研究表明，采用陰離子表面活性劑（LAS）作為單一污染物對水生動(dòng)物進(jìn)行毒性試驗(yàn)時(shí)，可使有機(jī)體產(chǎn)生活性氧，進(jìn)而導(dǎo)致水生動(dòng)物體內(nèi)的抗氧化酶活性或含量發(fā)生改變，因此污染物作用下水生動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧造成氧化損傷可能是污染物致毒的重要途徑。超氧化物歧化酶（SOD）參與生物體內(nèi)活性氧的清除，對生物機(jī)體起著重要的保護(hù)作用。超氧化物歧化酶（SOD）活性的變化與污染物濃度呈現(xiàn)相關(guān)性，并且其活性變化在一定程度上能夠反映污染物對生物體的毒性效應(yīng)[9]。

3 結(jié)論

通過急性毒性試驗(yàn)，得出陰離子表面活性劑LAS對草金魚的24h，48h，72h，96h的半致死濃度（LC50）分別是12.2mg/L，9.8mg/L，8.8mg/L，8.6mg/L。陰離子表面活性劑LAS對草金魚表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性。在LAS濃度為2.2，2.9，3.6，5.7，7.9mg/L的亞急性條件下暴露96h，試驗(yàn)結(jié)果表明，LAS質(zhì)量濃度低于3.6mg/L時(shí)，LAS對肝臟中SOD酶活性表現(xiàn)出激活作用；LAS濃度高于3.6mg/L時(shí)，LAS對肝臟中的SOD酶活性表現(xiàn)出抑制作用。從LAS對草金魚肝臟SOD活性影響來看，SOD的活性先增高后降低說明陰離子表面活性劑（LAS）污染會(huì)使草金魚體內(nèi)的多種生化過程受到影響。將超氧歧化酶（SOD）作為水生生物在受到表面活性劑污染脅迫的毒理學(xué)指標(biāo)具有一定的可行性。

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作者簡介：張?jiān)骑w（1995-），男，鄭州大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院學(xué)士，從事水環(huán)境治理方向研究。

*通訊作者：王莉（1973-），女，河南開封人，高級工程師，鄭州大學(xué)水利與環(huán)境學(xué)院，主要從事水環(huán)境治理與水生態(tài)修復(fù)研究。