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    蛛網(wǎng)膜腔出血后腦組織氧自由基代謝的實驗研究

    2017-02-28 19:36:54董廣宇禹婷婷吳春波王新軍廖一凡
    中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新 2016年34期
    關(guān)鍵詞:超氧化物歧化酶蛛網(wǎng)膜下腔出血丙二醛

    董廣宇+禹婷婷+吳春波+王新軍+廖一凡

    【摘要】 目的:探討兔蛛網(wǎng)膜下腔出血(SAH)后腦組織氧自由基代謝的動態(tài)變化及意義。方法:24只新西蘭大白兔隨機分為假手術(shù)組(6只)和SAH組(18只),采用血管內(nèi)穿刺法建立SAH模型,按觀察時間點分為SAH第3天組(D3組)、第5天組(D5組)和第7天組(D7組),每組各6只,檢測各組腦組織含水量、丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性。結(jié)果:與假手術(shù)組比較,SAH組各觀察時間點腦組織含水量、MDA含量均有明顯升高(P<0.05),T-SOD活性均有明顯下降(P<0.05),D5組變化最為顯著(P<0.01)。結(jié)論:兔SAH后腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增強,氧自由基清除能力下降,自由基損傷可能是SAH后腦水腫形成的重要病理機制。

    【關(guān)鍵詞】 兔; 蛛網(wǎng)膜下腔出血; 丙二醛; 超氧化物歧化酶; 腦水腫

    【Abstract】 Objective:To investigate the dynamical changes and significance of oxygen free radical metabolism in brain tissues after the experimental subarachnoid hemorrhage(SAH) in rabbits.Method:24 white rabbits of New Zealand were randomly divided into sham operation group of 6 rabbits and SAH group of 18 rabbits.Rabbits model of SAH were made by endovascular puncturing,according to the observation time points they were divided into SAH third days group (group D3), fifth days group (group D5) and seventh days group (group D7),each group of 6 rabbits.The water content, malondialdehyde (MDA) content, and activity of total superoxide dismutase (T-SOD) of the brain tissues were measured in all groups.Result:Compared with the sham operated group,the SAH groups water content and MDA content increased significantly,T-SOD activity decreased significantly(P<0.05).Furthermore,all the changes were most significantly in fifth days group after SAH(P<0.01).Conclusion:There is an enhancement of lipid peroxidation and lower oxygen free radical scavenging ability after SAH.Free radical injury maybe the main pathomechanism of brain edema after SAH.

    【Key words】 Rabbits; Subarachnoid hemorrhage; Malondialdehyde; Superoxide dismutase; Brain edema

    First-authors address:Peoples Hospital of Longgang District,Shenzhen 518172,China

    doi:10.3969/j.issn.1674-4985.2016.34.006

    自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)多為顱內(nèi)動脈瘤破裂所致,再出血因素控制后,如何防治腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS)、遲發(fā)性缺血性神經(jīng)功能障礙(delayed ischemic neurological deficit,DIND)等相關(guān)并發(fā)癥已成為目前研究的熱點[1-3]。以往國內(nèi)外研究認為,遲發(fā)性CVS或大血管結(jié)構(gòu)的改變是DIND的主要原因,但隨機雙盲對照的臨床研究顯示,遲發(fā)性CVS的逆轉(zhuǎn)并沒有改變患者的總體預(yù)后,提示對SAH后復(fù)雜病理機制的研究不能僅限于防治遲發(fā)性CVS方面[4-5]。本研究采用模擬動脈瘤性SAH動物模型,通過觀察腦組織含水量、丙二醛(MDA)含量、總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性的動態(tài)變化,進一步探討氧自由基代謝在SAH后繼發(fā)腦損傷中的作用及意義,現(xiàn)報道如下。

    1 材料與方法

    1.1 主要試劑和器材 MDA測試盒、SOD測試盒、總蛋白定量測試盒(南京建成生物工程研究所),分析天平(德國sartorius公司),干燥箱(廣州東方電熱干燥設(shè)備廠),組織研磨器(河北涿州玻璃儀器廠),離心機(美國Beckman公司),分光光度計(福建新大陸生物技術(shù)有限公司),EXCEL-14微導(dǎo)管(Boston公司),0.010in Transend微導(dǎo)絲(Cordis公司)。

    1.2 實驗動物及分組 24只新西蘭大白兔(第一軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供,雌雄不限,體重2.5~3.5 kg),隨機分為假手術(shù)組(6只,導(dǎo)絲進入但未刺破頸內(nèi)動脈)及SAH組(18只),后者按觀察時間點又隨機分為SAH第3天組(D3組)、第5天組(D5組)和第7天組(D7組),每組各6只。

    1.3 動物模型制作 采用經(jīng)股動脈血管內(nèi)穿刺法制作兔SAH模型[6],30%烏拉坦溶液2.0~3.0 mL/kg經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉成功后,仰臥位固定于自制手術(shù)臺,腹股溝區(qū)常規(guī)消毒、鋪無菌巾單,分離、暴露股動脈,Seldinger法股動脈穿刺置4F導(dǎo)管鞘,經(jīng)導(dǎo)管鞘引入4F獵人頭Ⅰ型導(dǎo)管,在0.035in超滑導(dǎo)絲輔助路圖指引下置于右(左)頸總動脈中上段,隨后引入預(yù)塑形的EXCEL-14微導(dǎo)管和Transend微導(dǎo)絲,路圖指引下微導(dǎo)管置于頸內(nèi)動脈,然后換用剪除柔軟頭端的Transend微導(dǎo)絲,DSA監(jiān)視下經(jīng)微導(dǎo)管送入頸內(nèi)動脈后,快速將導(dǎo)絲推出導(dǎo)管約1 cm,重復(fù)2次后退出導(dǎo)絲,拔出導(dǎo)管及動脈鞘,結(jié)扎股動脈并縫合皮膚切口。

    1.4 SAH判斷 頸內(nèi)動脈穿刺后即刻出現(xiàn)的CVS及不同程度的行為學(xué)異常,如心率迅速加快、呼吸急促或呼吸驟停、四肢強直樣改變或大小便失禁等。術(shù)后因SAH或CVS而表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)功能障礙[7],如精神差、嗜睡、拒食、活動減少等輕度神經(jīng)功能障礙,肢體無力、跛行、單癱等中度神經(jīng)功能障礙,劃圈運動、行走困難、四肢癱瘓等重度神經(jīng)功能障礙。術(shù)后經(jīng)枕大池穿刺抽取腦脊液,大體觀察并經(jīng)實驗室檢查證實為血性腦脊液。

    1.5 標本采集與處理 各組實驗動物按不同觀察時間點,在靜脈全麻成功后,以0~4 ℃冰鹽水經(jīng)頸動脈灌注并放血處死動物,立即開顱取腦,迅速置于冰鹽水中漂洗并剝除腦膜及血管,濾紙拭干后放入液氮中保存,用于腦組織含水量、MDA含量及SOD活性測定。

    1.6 觀察指標與檢測方法

    1.6.1 腦組織含水量測定 按干濕重法,取腦組織塊用分析天平稱取濕重后置于110 ℃恒溫干燥箱中烘干24 h至恒重,按公式計算腦組織水含量百分比:腦組織含水量=(組織濕重-組織干重)/組織濕重×100%。

    1.6.2 腦組織MDA含量、T-SOD活性測定 取腦組織塊用預(yù)冷(0~4 ℃)勻漿介質(zhì)(0.01 mol/L Tris-HCl,0.0001 mol/L EDTA-2Na,0.01 mol/L蔗糖,0.8%NaCl,pH 7.4)按1∶9質(zhì)量比在組織研磨器中充分研磨至顯微鏡下觀察細胞完全破碎,3000 r/min低溫(0~4 ℃)離心15 min,留上清待測。蛋白定量采用雙縮脲法,MDA含量測定采用硫代巴比妥酸(TBA)法,T-SOD活性測定采用羥胺法,單位分別為毫克蛋白每毫升(mg pro/mL)、納摩爾每毫克蛋白(nmol/mg pro)、亞硝酸鹽單位每毫克蛋白(NU/mg pro)。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料采用(x±s)表示,比較采用t檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 SAH模型制作成功率 假手術(shù)組6只兔完成各實驗步驟,未出現(xiàn)增補;SAH組兔共增補6只,總數(shù)為24只,制作SAH模型并獲取標本18只,成功率為75%(18/24)。模型失敗原因:頸內(nèi)動脈穿刺后實驗動物即刻呼吸、心跳驟停經(jīng)搶救無效死亡2只,術(shù)后經(jīng)枕大池穿刺檢查未發(fā)現(xiàn)血性腦脊液3只,觀察期間死亡1只。

    2.2 動物行為學(xué)觀察 假手術(shù)組動物手術(shù)前后飲食、精神狀態(tài)、活動情況及神經(jīng)功能無明顯變化。SAH組動物在穿刺出血后即刻有心率迅速加快、呼吸急促、肢體強直樣改變等表現(xiàn),手術(shù)24 h以后5只動物出現(xiàn)輕度神經(jīng)功能障礙,10只動物出現(xiàn)中度神經(jīng)功能障礙,3只動物出現(xiàn)重度神經(jīng)功能障礙。神經(jīng)功能障礙以術(shù)后6~12 h較差,24 h后有所恢復(fù),5 d時癥狀又有加重表現(xiàn)。

    2.3 兩組腦組織含水量、MDA含量、T-SOD活性比較 與假手術(shù)組比較,SAH后各時間點腦組織含水量、MDA含量均有明顯升高,T-SOD活性均有明顯下降(P<0.05)。動態(tài)觀察顯示,腦組織含水量、MDA含量在SAH后第3~5天呈升高趨勢,第5~7天呈下降趨勢,但總體水平仍高于正常;T-SOD活性則呈反向變化趨勢,即SAH后第3~5天呈下降趨勢,第5~7天呈上升趨勢,但總體水平仍低于正常,見表1。

    3 討論

    自發(fā)性蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage,SAH)是臨床常見的腦血管意外之一,具有發(fā)病急、致死率高、預(yù)后差等臨床特點,目前對SAH的臨床和實驗研究多集中在腦血管痙攣(cerebral vasospasm,CVS),尤其遲發(fā)性CVS和遲發(fā)性缺血性神經(jīng)功能障礙(delayed ischemic neurological deficit,DIND)的防治方面[8-11]。但是隨著對遲發(fā)性CVS不能解釋的神經(jīng)功能障礙的重視和疾病早期預(yù)警及干預(yù)的臨床需要,SAH后腦損傷尤其早期腦損傷的研究越來越受到醫(yī)學(xué)界的重視。SAH后腦損傷是多種病理過程共同導(dǎo)致的神經(jīng)元功能障礙或凋亡,其中包括了早期顱內(nèi)壓升高、短暫腦缺血缺氧、血液分解產(chǎn)物的生化刺激、機體后續(xù)的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)、血管病理性收縮等。氧化應(yīng)激由SAH急性期腦缺血再灌注啟動,由釋放入蛛網(wǎng)膜下腔的血紅蛋白裂解產(chǎn)物加重,通過促進脂質(zhì)過氧化、蛋白氧化、導(dǎo)致DNA損傷并激活凋亡通路及炎癥級聯(lián)反應(yīng)加重腦損傷,參與血管平滑肌及內(nèi)皮損傷、血腦屏障破壞、血管痙攣、細胞凋亡等多個病理機制[12-13]。蘭新強等[14]在自由基清除劑對減少大鼠SAH后CVS的研究中發(fā)現(xiàn),SAH后第1天基底動脈白介素6(IL-6)、細胞間粘附分子1(ICAM-1)在mRNA水平上即有表達上調(diào),分別在第3、5天達到高峰,經(jīng)依達拉奉治療后上述表達明顯減弱,認為自由基在CVS之初即被激活并通過調(diào)控多種基因的表達參與CVS的形成,抑制自由基活化能有效緩解CVS。王蔚等[15]研究中顯示,大鼠SAH后海馬CA1區(qū)細胞凋亡數(shù)目逐漸增加,至72 h達峰值,依達拉奉干預(yù)可有效升高Bcl-2、降低Bax的表達水平,證實自由基清除劑能有效抑制SAH后引起的大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞凋亡。

    氧化應(yīng)激本質(zhì)是細胞內(nèi)自由基產(chǎn)生和清除失衡、活性氧自由基過量堆積的結(jié)果。自由基如超氧陰離子、一氧化氮、過氧化氫、過氧化亞硝基和高活性羥自由基等含有未配成對電子,具有強烈生物氧化活性。生理狀態(tài)下自由基生成與清除處于動態(tài)平衡,維持在相對低水平,在調(diào)節(jié)細胞間信號傳遞、誘導(dǎo)細胞增殖和凋亡、抑制病毒和細菌等方面起重要作用。病理狀態(tài)下自由基過量生成及抗氧化物質(zhì)如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、還原型谷胱甘肽、過氧化氫酶等活性下降或過量消耗,可通過一系列損傷性級聯(lián)反應(yīng)引起細胞膜系脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、核酸等生物分子結(jié)構(gòu)和功能的改變,導(dǎo)致細胞和組織損傷。腦組織具有較高的氧化代謝率、高密度的膜不飽和脂肪酸以及依賴胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整的突觸傳導(dǎo),與其他組織相比更易受到自由基介導(dǎo)的損傷[16-17]。

    由于自由基半衰期短,很難被直接測定,目前相關(guān)研究多基于自由基的化學(xué)反應(yīng)及氧化劑-抗氧化劑平衡的理論,采用間接的方法來檢測或反映自由基的產(chǎn)生[18]。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物之一,其濃度可反映腦組織中氧自由基濃度和脂質(zhì)過氧化程度,進而間接反映機體清除氧自由基的能力。超氧化物歧化酶(SOD)按所含金屬輔基不同分為銅鋅超氧化物歧化酶(Cu/Zn-SOD)和錳超氧化物歧化酶(Mn-SOD),前者主要存在于胞漿,后者主要存在于線粒體,是體內(nèi)重要的抗氧化酶和氧自由基清除劑,二者活性相加即為總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性,可直接反映機體清除氧自由基的能力。本實驗采用血管內(nèi)穿刺法模擬動脈瘤性SAH,通過觀察腦組織含水量、MDA含量、T-SOD活性的動態(tài)變化,研究自由基代謝在SAH后繼發(fā)腦損傷中的作用。結(jié)果顯示,MDA含量在兔SAH后腦組織中明顯增加,第3~5天呈升高趨勢,第5~7天呈下降趨勢,但總體水平仍高于正常;腦組織T-SOD活性則呈反向變化趨勢,即在第3~5天呈下降趨勢,第5~7天呈上升趨勢,但總體水平仍低于正常;腦組織含水量變化與MDA含量變化相似。研究結(jié)果與文獻[19]一致,說明SAH后腦組織脂質(zhì)過氧化反應(yīng)活躍,主要的氧自由基清除劑SOD因消耗增加而減少,提示自由基代謝紊亂可能是SAH后腦水腫的重要病理機制之一。

    SAH后顱內(nèi)壓升高、CVS引起的腦缺血缺氧性損害及蛛網(wǎng)膜下腔血液分解產(chǎn)物氧合血紅蛋白的聚集利于自由基的大量生成,自由基過量形成又加劇CVS及腦缺血缺氧性損害[20]。因此,在目前單獨應(yīng)用CVS不能合理解釋SAH不良預(yù)后的情況下,積極探索自由基損傷的病理機制及有效干預(yù)措施,將在SAH多靶點治療中具有重要的實際意義。

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