高效液相色譜法測(cè)定魔芋精粉中葡甘聚糖的含量

陳彥杰+褚銀玲+韓超軼+張潔

[摘要]目的 建立HPLC方法測(cè)定魔芋精粉中葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）含量，并對(duì)高效液相色譜（HPLC）法與比色法測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較。方法 魔芋葡甘聚糖用2.5 mol/L的H2SO4溶液110℃水解2 h，生成D-甘露糖、D-葡萄糖，經(jīng)與1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）反應(yīng)得到衍生物。HPLC法中采用的色譜柱為TOSOH TSK-GEL ODS，流動(dòng)相A（乙腈）∶流動(dòng)相B（0.45 g磷酸二氫鉀、0.5 ml TEA、100 ml乙腈、900 ml純水混合，pH=7.5）進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm，柱溫30℃；比色法參照GB/T 18104-2000進(jìn)行測(cè)試。結(jié)果 HPLC法測(cè)定中D-甘露糖和D-葡萄糖分別在21.2～159.3 μg（r=0.9998）和21.5～154.2 μg（r=0.9999）范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；KGM平均回收率為98.9%，RSD為2.2%。與比色法比含量少5%～7%。結(jié)論 HPLC法與比色法相比測(cè)定KGM含量更準(zhǔn)確，可更好地用于魔芋精粉質(zhì)量控制和分級(jí)。

[關(guān)鍵詞]魔芋；葡甘聚糖；比色法；高效液相色譜法；含量測(cè)定

[中圖分類號(hào)] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2016）12（c）-0125-04

Determinination of konjac glucomannan in konjac refined powder by HPLC

CHEN Yan-jie CHU Yin-ling HAN Chao-yi ZHANG Jie

ENNOVA Health Science and Technology Co.，Ltd. of ENN Group，Langfang 065001，China

[Abstract]Objective To establish an HPLC method for content determination of konjac glucomannan （KGM） in konjac refined powder，and compare with results of colorimetric assay.Methods KGM was hydrolyzed with H2SO4 （2.5 mol/L） at 110℃ for 2 hours，which reacted with 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone （PMP） before HPLC separation and formed two monosaccharides，D-mannose and D-glucose.HPLC was performed on the column of TOSOH TSK-GEL ODS with gradient elution of mobile phase A （acetonitrile） and mobile phase B （0.45 g potassium dihydrogen phosphate，0.5 ml TEA，100 ml acetonitrile，900 ml water，pH=7.5）.The flow rate was 1.0 ml/min，detection wavelength was 250 nm，and column temperature was 30℃.Colorimetric method was tested with reference to GB/T18104-2000.Results Linearity of D-mannose was good in range of 21.2-159.3 μg （r=0.9998）；while D-glucose in range of 21.5-154.2 μg （r=0.9999）.The average recovery of KGM was 98.9% （RSD 2.2%）.The contents were less 5%-7% than that by colorimetry.Conclusion HPLC method is more accurate than colorimetry to determine content of KGM in konjac refined powder，and would be better for quality control and grading of konjac refined powder.

[Key words]Konjac；Glucomannan；Colorimetry；HPLC；Content determination

魔芋精粉是從多年生草本植物魔芋（Amorphophallus rerieri）塊根中經(jīng)干燥、粉碎、風(fēng)選等步驟后獲得。從營(yíng)養(yǎng)學(xué)角度看，魔芋精粉是一種低熱、低脂、低糖和高膳食纖維的食品。隨著研究的深入，人們對(duì)膳食纖維的認(rèn)識(shí)逐漸從“無(wú)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)”到今天具有重要的生理作用[1-2]，并被營(yíng)養(yǎng)學(xué)界認(rèn)定為第7類營(yíng)養(yǎng)素。研究表明富含膳食纖維的魔芋精粉具有降血脂、降血糖、通便和保護(hù)肝臟等作用[3-6]。

魔芋葡甘聚糖（konjac glucomannan，KGM）是魔芋精粉主要功效成分，也是評(píng)價(jià)魔芋精粉和相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量的關(guān)鍵指標(biāo)[7-8]，其中GB/T 18104-2000中就是依據(jù)KGM的含量對(duì)魔芋精粉進(jìn)行分級(jí)。KGM屬于可溶性半纖維素，結(jié)構(gòu)包含由D-葡萄糖和D-甘露糖通過(guò)β-1，4糖苷鍵聚合而成的主鏈，以及在主鏈甘露糖上由β-1，3糖苷鍵聚合的支鏈[9]。KGM具有親水性、增稠性、穩(wěn)定性好和口感平滑細(xì)膩等多種特征，同時(shí)又具有多種保健功能，廣泛應(yīng)用于普通食品、保健食品甚至藥品中[10-12]。KGM含量測(cè)定方法包括比色法[7]、氣相色譜法[8]和高效液相色譜（HPLC）法[13-15]等。HPLC法中有采用糖分析柱或者氨基柱結(jié)合示差檢測(cè)器測(cè)定含量，不需要衍生的步驟，但是對(duì)色譜柱和檢測(cè)器要求較高；也有采用PMP衍生化后用C18色譜柱結(jié)合紫外檢測(cè)器測(cè)定含量。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)優(yōu)化PMP衍生條件建立反相高效液相色譜測(cè)定魔芋精粉中KGM的含量；同時(shí)參照GB/T18104-2000用比色法測(cè)定魔芋精粉中KGM含量，分析比較兩種測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 儀器與材料

1.1儀器和設(shè)備

Agilent 1100高效液相色譜儀配備二級(jí)管陣列（DAD）檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫公司；UV-2102紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；十萬(wàn)分之一分析天平，瑞士Mettler-Toledo公司；L420離心機(jī)，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2藥品與試劑

魔芋精粉從陜西秦東魔芋食品有限公司（樣本1）、宣城市百草植物工貿(mào)有限公司（樣本2）、陜西龍飛魔芋食品有限公司（樣本3）和武漢市清江魔芋制品有限公司（樣本4～9）。D-甘露糖和D-葡萄糖均購(gòu)自于中國(guó)食品藥品檢定研究院（批號(hào)分別為140651-201403；110833-201205）；L-鼠李糖，北京化學(xué)試劑公司；乙腈為色譜純，水為超純水。除非另有說(shuō)明，在分析中所用試劑均為分析純?cè)噭?/p>

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：TOSOH TSK-GEL ODS色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相A（乙腈）∶流動(dòng)相B（0.45 g磷酸二氫鉀、0.5 ml TEA、100 ml乙腈、900 ml純水混合，pH=7.5）進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)?.0～4.0 min 94% B，4.0～5.0 min 94%～88% B，5.0～30.0 min 88% B，流速1.0 ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)250 nm；進(jìn)樣量5 μl，按上述色譜條件，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖1～3。

2.2溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取D-甘露糖和D-葡萄糖對(duì)照品適量，置于2 ml量瓶中，用高純水溶解，制成濃度分別為0.56 mg/ml和0.60 mg/ml混合對(duì)照品溶液。精密吸取混合對(duì)照品溶液20、50、100、120、150 μl于5支5 ml具塞玻璃試管中，加入內(nèi)標(biāo)50 μl L-鼠李糖（1.08 mg/ml）儲(chǔ)備液，按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備④進(jìn)行衍生化，即得。

2.2.2供試品溶液的制備 ①魔芋精粉中游離還原糖的分離：精密稱取魔芋精粉0.12～0.15 g至150 ml燒杯中。加入85%乙醇50 ml，在50 ℃恒溫水浴中保溫30 min并不斷攪拌，取出、靜置、吸出上清液。再用85%乙醇提取兩次，分離出溶于乙醇中的游離還原糖，小心收集全部去除了游離還原糖的魔芋精粉，蒸去乙醇，備用。②魔芋葡甘聚糖提取液的制備：將已處理的魔芋精粉，加高純水60 ml，室溫下攪拌1～2 h溶脹過(guò)夜。然后用高速勻漿機(jī)勻漿40 s，注入100 ml容量瓶中，用高純水多次洗盡勻漿機(jī)轉(zhuǎn)頭和燒杯，洗液移入100 ml容量瓶中，用高純水定容。以4000 r/min轉(zhuǎn)速離心20 min，取上清液即得。③水解：吸取上述溶液100 μl，加入70 μl （2.5 mol/L H2SO4），110℃烘箱中水解2 h，取出冷卻后，用70 μl（5 mol/L NaOH），渦旋混勻中和，加入內(nèi)標(biāo)50 μl L-鼠李糖（1.08 mg/ml），室溫減壓干燥。④衍生化：上述水解液再加200 μl PMP甲醇溶液（0.5 mol/L）與100 μl NaOH溶液（0.3 mol/L），渦旋混勻；在70℃恒溫水浴中反應(yīng)60 min，取出放置10 min冷卻至室溫；加入100 μl HCl （0.3 mol/L）中和，加入純水1 ml；再加氯仿2 ml，重復(fù)萃取三次，水相經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得供試液。

2.3 檢測(cè)限和定量限

以信噪比為3∶1時(shí)的色譜峰為檢出限，以信噪比為10∶1的色譜峰為定量限。結(jié)果D-甘露糖的檢測(cè)限和定量限分別為1.032、1.543 nmol；D-葡萄糖的檢測(cè)限和定量限分別為2.537、3.319 nmol。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下所得不同濃度對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件分析，以對(duì)照品的峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)（y），以對(duì)照品的量（nmol）為橫坐標(biāo)（x），進(jìn)行線性回歸，得D-甘露糖的回歸方程為y=1.1470x+0.0088（0.9998），D-葡萄糖的回歸方程為y=0.9726x+0.0036（0.9999）。結(jié)果表明，D-甘露糖和D-葡萄糖的檢測(cè)線性范圍分別為1.179～8.842 nmol、1.141～8.559 nmol。

2.5 精密度試驗(yàn)

取同一份魔芋精粉按“2.2.2”項(xiàng)下的步驟操作，所得供試液按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算出含量。結(jié)果，D-甘露糖和D-葡萄糖含量的RSD分別為0.77%、0.18%，表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份魔芋精粉按“2.2.2”項(xiàng)下的步驟操作，所得供試液分別于放置0、2、4、6、8、12、24 h按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)試，根據(jù)測(cè)得D-甘露糖、D-葡萄糖質(zhì)量，計(jì)算KGM含量，其平均值為79.41%，RSD為0.22%，表明供試品液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

取同一份魔芋精粉按“2.2.2”項(xiàng)下的步驟操作，平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，根據(jù)測(cè)得D-甘露糖、D-葡萄糖質(zhì)量，計(jì)算KGM含量RSD為1.48%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

供試品溶液制備中①和②步完全按照GB/T18104-2000操作，因此，本實(shí)驗(yàn)中筆者只考察酸水解和衍生過(guò)程中的加樣回收率。精密吸取供試品溶液制備中②步獲得的KGM提取液50 μl共6份，分別加入50 μl已知濃度的KGM對(duì)照品溶液。按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備的③和④步驟操作，所得供試液按照“2.1”項(xiàng)下中色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算KGM加樣回收率，測(cè)得的結(jié)果見(jiàn)表1。

2.9樣品含量測(cè)定

根據(jù)建立的方法用HPLC-UV的方法對(duì)購(gòu)買于不同廠家9份魔芋精粉中KGM含量進(jìn)行測(cè)定。同時(shí)，嚴(yán)格按照GB/T18104-2000的要求應(yīng)用比色法測(cè)定魔芋精粉中KGM含量。兩種方法的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

3討論

供試品制備過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)衍生過(guò)程中加入PMP[16-17]和NaOH的量很關(guān)鍵，通過(guò)摸索確定本實(shí)驗(yàn)中的量為最佳。酸水解時(shí)間和溫度參照文獻(xiàn)方法都能水解完全[7，18-19]。

與比色法相比，HPLC方法的供試品制備過(guò)程稍復(fù)雜，時(shí)間稍長(zhǎng)。但是從實(shí)驗(yàn)結(jié)果上看，HPLC法測(cè)定值均比比色法小5%～7%。KGM分子中只含有葡萄糖和甘露糖， HPLC法是針對(duì)水解產(chǎn)物中葡萄糖和甘露糖進(jìn)行含量測(cè)定；而比色法則針對(duì)水解產(chǎn)物中所有還原糖進(jìn)行測(cè)定。由此推測(cè)本實(shí)驗(yàn)確定的HPLC法測(cè)定魔芋原料中葡甘聚糖的含量與GB/T18104-2000采用比色法測(cè)定的含量相比可能更加準(zhǔn)確，能夠更有效地控制魔芋精粉的質(zhì)量和進(jìn)行魔芋精粉的分級(jí)。

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