巴西橡膠樹HbCYP450基因克隆與表達(dá)分析

李曉娜 肖厚貞 萬三連 張冬 張宇

摘 要 細(xì)胞色素P450氧化酶催化植物初生代謝和次生代謝等多種類型的氧化還原反應(yīng)。本研究在橡膠樹葉片中克隆得到一個(gè)CYP450基因，編碼516個(gè)氨基酸，在3～511位氨基酸序列間存在一個(gè)P450超級(jí)保守結(jié)構(gòu)域，且存在特征性的血紅素結(jié)合位點(diǎn)保守序列，與蓖麻、胡楊、毛楊果和大豆CYP450的序列一致性分別為74%、68%、68%和65%。HbCYP450基因在橡膠樹的葉片、花和膠乳中均表達(dá)，但在樹皮中不表達(dá)。該基因的表達(dá)量受干旱、機(jī)械傷害和白粉病的誘導(dǎo)，在植物激素吲哚乙酸（IAA）、茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）和過氧化氫（H2O2）作用下，HbCYP450基因表達(dá)量呈現(xiàn)先顯著上升后顯著下降的規(guī)律。說明HbCYP450是植物P450家族成員，其表達(dá)量受白粉菌和逆境誘導(dǎo)。

關(guān)鍵詞 巴西橡膠樹；基因克隆；表達(dá)分析；CYP450

中圖分類號(hào) S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Cytochrome P450 monooxygenases catalyze a wide varieties of monooxygenation reactions in primary and secondary metabolism in plants. In this study， a CYP450 gene was cloned from rubber tree leaves. It encodes 516 amino acids which has one conserved domain at position 3-511 and a special conserved sequence of heme binding sites. HbCYP450 has identity of 74%， 68%， 68%， and 65% with Ricinus communis L.， Populus euphratica， Populus trichocarpa and Glycine max， respectively. HbCYP450 expressed in leaf， flower and latex， but no expressed in bark， which expression of gene induced by drought， wounding and powdery mildew disease.Under the treatment of IAA， ABA， SA， JA， ET and H2O2， the expression patterns of HbCYP450 were significantly upregulated， then downregulated dramatically. These results suggest that HbCYP450 is one of the members of P450 family， and the expression are induced by powdery mildew and stress induction.

Key words Hevea brasiliensis； gene cloning； expression analysis； CYP450

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.11.017

細(xì)胞色素P450作為植物中最大的酶蛋白家族，參與生物合成途徑和生物解毒途徑[1-2]。具有生物合成功能的CYP450在木質(zhì)素中間物、植物激素（脫落酸、赤霉素、生長(zhǎng)激素等）、淄醇、萜類、黃酮類等生物物質(zhì)的合成中起重要作用[3-7]，具有生物解毒功能的CYP450能夠使污染物、農(nóng)藥等有毒物質(zhì)變成非毒性物質(zhì)[8]。CYP450廣泛存在于動(dòng)植物、細(xì)菌以及真菌等細(xì)胞體內(nèi)，目前從植物中獲得的CYP450普遍存在于擬南芥[9]、番茄、小麥[10]、水稻、蓖麻[11]、玉米、大豆等植物中。目前，擬南芥中有40個(gè)CYP450基因功能已經(jīng)確定，水稻中有39個(gè)CYP450基因功能已經(jīng)確定[12]。根據(jù)CYP450蛋白序列的相似性和親緣關(guān)系將CYP450歸類為多個(gè)家族和亞家族，其中，同一家族成員的相似性大于40%，同一亞族成員的相似性大于55%[13]，同一亞家族的基因具有類似的功能[14]。

橡膠樹是我國(guó)重要的產(chǎn)膠植物，其生長(zhǎng)發(fā)育經(jīng)常受到各種生物脅迫和非生物脅迫，其中白粉病對(duì)橡膠樹的嫩葉、嫩芽和花絮均能造成危害，使植株葉片掉落，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致植株死亡。干旱和機(jī)械損傷等逆境因素會(huì)導(dǎo)致巴西橡膠樹病蟲害發(fā)生率和死皮率增加，引起巨大的經(jīng)濟(jì)損失[15-16]。研究發(fā)現(xiàn)，木質(zhì)素含量會(huì)影響植株抵抗脅迫和水分運(yùn)輸能力[17-19]，并且高含量木質(zhì)素有利于植物抗病蟲害。楊家書等[20]研究發(fā)現(xiàn)小麥的抗白粉病能力與木質(zhì)素含量成正相關(guān)。橡膠樹膠乳的合成途徑中涉及諸多氧化還原反應(yīng)[21]，每一個(gè)氧化酶反應(yīng)都需要一個(gè)專一的CYP450酶[22]，CYP450對(duì)膠乳的生產(chǎn)可能具有一定的影響，但目前對(duì)橡膠樹中CYP450的研究甚少。筆者通過克隆橡膠樹中CYP450基因，分析其在不同處理下的表達(dá)情況，為探究其在橡膠樹生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆脅迫中的作用打下良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院種植的橡膠樹品種CATAS 7-33-97正常割膠的成齡樹為材料，進(jìn)行基因的克隆與不同組織的表達(dá)分析。選取穩(wěn)定期生長(zhǎng)均勻一致的橡膠樹CATAS 7-33-97芽接苗進(jìn)行機(jī)械損傷、白粉菌生理小種 HO-73接種、脫落酸（ABA）、乙烯利（ETH）、茉莉酸（JA）和過氧化氫（H2O2）等處理[23]。

1.2 方法

1.2.1 樣品的采集和cDNA的合成 機(jī)械傷害處理：在芽接苗的嫩葉上用解剖刀割出橫切面，再將葉片置于水中，模擬機(jī)械損傷[24]；白粉菌處理采用Wang等[25]的方法；植物激素及過氧化氫處理方法參考Qin等[26]的方法：用乙醇溶解各種激素，噴于橡膠樹芽接苗上。在處理后0、0.5、2、6、10、24、48和72 h采集樣品。將不同處理下不同時(shí)間段采集到的葉片和不同組織放置在-80 ℃冰箱中冷凍保存。

提取橡膠樹樹皮、膠乳、葉片和花的總RNA，具體操作方法參考何鑫等[27]的方法。采用超微量核酸蛋白分析儀進(jìn)行總RNA濃度和純度的檢測(cè)，并利用1%甲醛變性膠電泳進(jìn)行RNA完整性的檢測(cè)[28]。cDNA的合成采用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，中國(guó)大連）完成。

1.2.2 橡膠樹HbCYP450基因克隆 根據(jù)Genbank上公布人類和一些模式植物的過氧化物酶蛋白序列，在EST數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行tblastn搜索，并通過軟件DNAman拼接同源片段，得到橡膠樹HbCYP450基因的cDNA序列[29]。利用軟件primer 6.0設(shè)計(jì)了基因特異引物HbCYP450-F（5′-TCGGTTGCTCATTG

TCTT-3′）和HbCYP450-R （5′-CAGTGGGCTACTAATACTATAC-3′），將反轉(zhuǎn)錄的cDNA第Ⅰ鏈作為模板，對(duì)橡膠樹細(xì)胞色素CYP450基因的cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3 橡膠樹HbCYP450基因結(jié)構(gòu)分析 使用NCBI ORF Finder預(yù)測(cè)基因的編碼區(qū)序列以及分析巴西橡膠樹HbCYP450的理化性質(zhì)，通過數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI Conserved Domains、在線分析軟件SMART和TMHMM Server v. 2.0分析其結(jié)構(gòu)域， 用SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)氨基酸序列，再通過ExPASy ProtParam分析信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，亞細(xì)胞定位使用PSORT Prediction進(jìn)行分析。最后在NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中利用blastp搜索其他植物的CYP450同源蛋白并獲取其序列，利用軟件DNAMAN 6.0進(jìn)行序列比對(duì)，利用MAGE6.0分析細(xì)胞色素P450家族系統(tǒng)的進(jìn)化關(guān)系。

1.2.4 橡膠樹HbCYP450基因表達(dá)分析 采用軟件primer 6.0設(shè)計(jì)HbCYP450基因熒光定量表達(dá)分析的引物HbCYP450F（5′-ATTCTATGGCTCCGCTA

TAC-3′）和HbCYP450R（5′-TGATTGCTGCTGCTGATT-3′）。以橡膠樹HbACTIN（F： GATGTGGATATCAGGAAGGA和R： CATACTGCTTGGAGCAAGA）為內(nèi)參，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)[30]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析和作圖

采用單因素方差分析和Duncan檢驗(yàn)分析，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 21.0，使用Origin 2015科技繪圖軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 橡膠樹HbCYP450基因克隆與生物信息學(xué)分析

利用模式植物擬南芥、水稻和小麥的CYP450蛋白序列在橡膠樹EST數(shù)據(jù)庫(kù)中做tblastn搜索后，克隆得到全長(zhǎng)為1 610 bp的cDNA序列，編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 548 bp，編碼516個(gè)氨基酸，分子量為59.08 ku，等電點(diǎn)PI為8.59，分子式為C2 687H4 233N717O735S23，總原子數(shù)為8395，其編碼形成的是一種親水且不穩(wěn)定的蛋白。在3～511位氨基酸處存在一個(gè)P450超級(jí)保守結(jié)構(gòu)域（圖1劃線部分），在5～27位氨基酸處存在一個(gè)跨膜螺旋，通過細(xì)胞定位在線分析軟件可知，HbCYP450在線粒體、質(zhì)膜、細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中定位的可能性分別是0.328 0、0.460、0.126、0.1和0.1。將同源序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，橡膠樹HbCYP450與蓖麻RcCYP450（XP_002524040.1）、胡楊PeCYP450（XP_011005628.1）、毛楊果PtCYP450（XP_006380437.1）、大豆GmCYP450（XP_003556213.1）的序列一致性分別為74%、68%、68%、65%。在HbCYP450蛋白上存在一些CYP450特有的保守結(jié)構(gòu)，如C-螺旋序列WXXXR，在HbCYP450中位于132～136位氨基酸，氧結(jié)合結(jié)構(gòu)域AGXXT，在HbCYP450中位于314～318位氨基酸，K-螺旋序列EXXR和PXRF，在HbCYP450分別位于372～375位和426～429位氨基酸，血紅素結(jié)合位點(diǎn)保守結(jié)構(gòu)序列：FXXGXRXCXG，在HbCYP450中位于450～459位氨基酸，序列為：FGAGRRMCPG。將橡膠樹HbCYP450與擬南芥CYP450進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥CYP89A2與HbCYP450親緣關(guān)系最近（圖2）。

2.2 橡膠樹HbCYP450基因的表達(dá)分析

HbCYP450基因在橡膠樹的花、葉和膠乳中均有表達(dá)，且在膠乳中的表達(dá)量是葉片中的65倍，但其在樹皮中不表達(dá)。白粉菌侵染橡膠樹葉片時(shí)，HbCYP450基因表達(dá)量在侵染初期便顯著上調(diào)，隨著病害程度的加重，表達(dá)量顯著增加，說明白粉菌能夠誘導(dǎo)HbCYP450基因正向表達(dá)。在機(jī)械傷害橡膠樹初期，HbCYP450基因的表達(dá)量顯著上調(diào)，處理后24 h表達(dá)量達(dá)到最高值（圖3）。說明HbCYP450基因參與橡膠樹生物和非生物脅迫響應(yīng)過程。

在植物激素誘導(dǎo)下，HbCYP450基因的表達(dá)情況如圖4所示。在吲哚乙酸（IAA）的誘導(dǎo)下，HbCYP450基因的表達(dá)量在處理后6 h顯著上調(diào)，到24 h表達(dá)量又顯著下調(diào)。在茉莉酸（JA）、乙烯利（ET）、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）和過氧化氫（H2O2）分別處理下，橡膠樹葉片中HbCYP450基因表達(dá)量的變化趨勢(shì)與IAA誘導(dǎo)下的變化相同，其中IAA與ET、ABA、JA三者都是在處理后6 h表達(dá)量達(dá)到最高值，分別是處理前的6、25、11和20倍。H2O2和SA分別是在24 h和10 h達(dá)到表達(dá)最高值，分別是處理前的18和8倍。說明植物激素能夠有規(guī)律的誘導(dǎo)HbCYP450基因表達(dá)，同時(shí)也說明該基因參與橡膠樹植物激素處理響應(yīng)。

3 討論

P450s是多組分氧化還原酶系統(tǒng)[31]，在真核生物的生長(zhǎng)發(fā)育和新陳代謝中有至關(guān)重要的作用[32]。一般來說，每一個(gè)氧化酶反應(yīng)都需要一個(gè)專一的P450酶，所以在真核生物中存在大量的P450s。生物體中有很多CYPs已經(jīng)鑒定出來，并且功能得到了驗(yàn)證。本研究在橡膠樹中克隆出一個(gè)P450基因，其編碼的蛋白在3～511位具有P450保守的超級(jí)家族結(jié)構(gòu)域，在450～459位氨基酸存在一段血紅素結(jié)合位點(diǎn)，序列為FGAGRRMCPG，與P450家族保守的血紅素結(jié)合域FxxGxRxCxG序列相符。氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，橡膠樹HbCYP450的氨基酸序列與蓖麻、胡楊、毛楊果、大豆的一致性分別達(dá)到74%、68%、68%、65%，依據(jù)P450基因家族分類原則[13]，初步判斷橡膠樹HbCYP450屬于P450家族中CYP89A2亞家族，系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析也發(fā)現(xiàn)，橡膠樹HbCYP450與擬南芥CYP89A2的親緣關(guān)系最近，兩個(gè)結(jié)果相一致。

橡膠樹HbCYP450基因在花、葉和膠乳中均有表達(dá)，但在樹皮中不表達(dá)，在膠乳中表達(dá)量最高，推測(cè)HbCYP450基因在橡膠樹合成膠乳的過程中起著至關(guān)重要的作用，而在木質(zhì)素形成中不起作用，或作用很小。通過NCBI發(fā)現(xiàn)，擬南芥中CYP45089A2具有運(yùn)輸電子的活性、單加氧酶活性、鐵離子結(jié)合、氧結(jié)合、亞鐵血紅素結(jié)合的功能，參與氧化還原反應(yīng)。在同一亞族的P450基因具有相似的功能，因此HbCYP450在橡膠樹中可能也具有以上的作用。P450催化代謝途徑可以產(chǎn)生重要的次生代謝產(chǎn)物，該次生代謝物質(zhì)可增強(qiáng)植物抵抗病蟲害和非生物脅迫的能力[33]。通過表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)白粉菌侵染、機(jī)械傷害和干旱這些生物和非生物脅迫均能使HbCYP450基因表達(dá)量顯著上調(diào)。肉桂酸-4-羥化酶（CHC）作為CYP450的一種（CYP73），其活性和基因的表達(dá)受創(chuàng)傷、金屬離子、病原菌侵染等因素的調(diào)控[34-35]。HbCYP450與CYP73在進(jìn)化上屬于同一分支，因此可以推測(cè)HbCYP450參與病害和逆境脅迫響應(yīng)。P450參與許多萜類化合物的生物合成，包括赤霉素、脫落酸和一些植物防御物質(zhì)[12]，還參與生長(zhǎng)素的合成[36]。赤霉素、脫落酸和生長(zhǎng)素都是常見且重要的植物激素，在本研究中HbCYP450基因在5類植物激素和H2O2作用下，表達(dá)量均顯著性變化。說明HbCYP450基因參與植物激素的響應(yīng)。本研究為探究橡膠樹CYP450家族成員和各成員在橡膠樹抗病、抗逆機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

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