3個(gè)群體小家鼠Sry基因序列分析

王金鵬 楊曉瑩 于立強(qiáng) 靖美東

摘要[目的]研究小家鼠3個(gè)群體間Sry基因序列。[方法]對(duì)來(lái)自臨沂、漠河、云夢(mèng)的33只雄性小家鼠個(gè)體進(jìn)行基因組DNA提取，設(shè)計(jì)引物，對(duì)其Sry基因進(jìn)行擴(kuò)增和序列測(cè)定，并使用分子處理軟件定義單倍型，分析堿基組成，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。[結(jié)果]33個(gè)樣品全部測(cè)序成功，經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析后得到以下結(jié)果：33個(gè)樣品的Sry基因片段大小均在856 bp左右。對(duì)33個(gè)序列對(duì)比分析，共定義了7個(gè)單倍型，Sry基因堿基的平均含量分別為A 27.5%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，不同個(gè)體之間堿基無(wú)明顯差異，遺傳距離小。以大家鼠（KC215142）為外群，小家鼠（AF068054）為參照序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，7個(gè)單倍型與小家鼠共處同一分支。[結(jié)論]南北群體的小家鼠Sry基因無(wú)明顯差異，基因突變率極低，具有極強(qiáng)的保守性。

關(guān)鍵詞小家鼠；Sry基因；序列分析

中圖分類號(hào)Q953文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）11-0114-03

Abstract[Objective]To study the sequence of Sry gene of Mus musculus from three groups. [Method]We extracted the whole DNA genome of 33 mice came from Linyi， Mohe， Yunmeng Region，then used the primer to amplify the Sry genes and determined DNA sequence of the 33 mice individually. To define haplotype， analyze base composition， construct phylogenetic tree by using a series of molecular processing software. [Result]The sequence of the 33 mices DNA genome was conducted successfully， the lengths of DNA genome of 33 mice were all about 856 bp. 7 haplotypes were defined by the comparative analysis of 33 sequences. The average content of the four bases（ATGC） was measured respectively： A 27.5%，T 30.7%， G 22.5%， C 19.3%. There was no significant difference between the individual mouse， and the genetic distance was small. Using Rattus norvegicus（KC215142） as outgroup and M.m. musculus （AF068054） as reference sequence to construct phylogenetic tree，7 haplotypes and Mus musculus were in the same branch.[Conclusion] There is no significant difference between the north and south of the Mus musculus Sry gene， Sry gene mutation rate is very low， with a strong conservation.

Key wordsMus musculus；Sry gene；Sequence analysis

小家鼠（Mus musculus）屬嚙齒目（Rodentia）鼠科（Muridae）小家鼠屬（Mus）[1]，是一類體型較小、夜出活動(dòng)、世界性分布的家棲哺乳鼠類。小家鼠為鼠科中的小型鼠，一般體長(zhǎng)為60～90 cm，身體較輕，尾與身體長(zhǎng)度相當(dāng)或略短于體長(zhǎng)，頭較小且吻短，耳圓形，毛色因季節(jié)和所處環(huán)境不同而有所差異，體被呈棕灰色或暗黑色或黑褐色[2-3]。隨著分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等學(xué)科和技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)線粒體DNA研究表明，小家鼠包括3個(gè)亞種，它們分別是：M.m.domesticus，分布在西歐、中東和北非地區(qū)；M.m.musculus，分布在東歐和東北亞地區(qū)；M.m.castaneus，分布在東南亞和印度次大陸[4]。小家鼠為現(xiàn)實(shí)驗(yàn)室品系小鼠的祖先，作為重要的模式物種[3]，被廣泛利用在遺傳、醫(yī)學(xué)、分子研究等方面，其主要有以下優(yōu)勢(shì)：①它是當(dāng)前重要的模式物種，現(xiàn)在實(shí)驗(yàn)用小鼠的全基因組序列已經(jīng)完成，可以被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的研究；②其與人類密切的聯(lián)系，使其廣泛存在于各大洲，具有世界性、伴生性等特點(diǎn)，人類疾病往往可在它身上發(fā)現(xiàn)，同時(shí)它的遺傳分化模式能夠反映人類活動(dòng)對(duì)其擴(kuò)散的影響，因此能夠通過(guò)小家鼠的起源與擴(kuò)散去探討人類的起源與擴(kuò)散；③小家鼠遍布于世界各地，可以利用分子系統(tǒng)地理學(xué)的理論與方法研究其起源與擴(kuò)散，從而重現(xiàn)歷史上發(fā)生過(guò)的地理事件和氣候的變遷[5-7]。

Y染色體（Y chromosome）是決定生物個(gè)體性別的一種性染色體。在雄性是異質(zhì)型的性決定生物中，雄性所具有的而雌性所沒(méi)有的那條性染色體叫Y染色體[8]。Y染色體多態(tài)性作為雄性小鼠的特有遺傳標(biāo)記，在探討人類的遷徙方面具有重要價(jià)值。目前利用Y染色體研究我國(guó)人群的遷徙已經(jīng)取得了許多重要的成果，并且已有研究證明Y染色體是研究小家鼠種群遺傳學(xué)的有效分子標(biāo)記[9-10]。

Y染色體上Sry基因（Sexdetermining region of the Y chromosome）對(duì)哺乳動(dòng)物性別的決定起關(guān)鍵作用。眾多研究表明，Sry基因突變引起人或其他哺乳動(dòng)物性腺發(fā)育受阻。將小鼠Sry基因?qū)隭X 雌性小鼠受精卵，可使其向雄性化轉(zhuǎn)變，包括支持細(xì)胞的分化、遷移，并發(fā)育形成睪丸，這說(shuō)明Sry基因是性別決定的核心基因，直接誘導(dǎo)精巢發(fā)育，對(duì)睪丸發(fā)育起著關(guān)鍵性的作用，Sry能夠觸發(fā)睪丸的發(fā)生，決定雄性性狀[11-12]。筆者采集了臨沂、漠河、云夢(mèng)的33只雄性小家鼠個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)，測(cè)得33個(gè)樣品的Sry基因，并對(duì)樣品個(gè)體定義單倍型，將其與GenBank中下載的褐家鼠（Rattus norvegicus，KC215142），M.m.musculus（AF068054）的片段進(jìn)行對(duì)比分析，通過(guò)單倍型構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)來(lái)探究Sry基因的遺傳意義，從而進(jìn)一步探究我國(guó)小家鼠亞種的分類情況，為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料33個(gè)小家鼠個(gè)體來(lái)自臨沂（LY3、LY6、LY7、LY8、LY9、LY10、LY11、LY12、LY23、LY33、LY41、LY43、LY45、LY48），漠河（MH37、MH43、MH44、MH46、MH47、MH48、MH49、MH50、MH51、MH56、MH62），云夢(mèng)（YM6、YM39、YM53、YM56、YM59、YM69、YM72、YM78）3個(gè)群體，取其尾巴肌肉組織，用100%乙醇浸泡，保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2方法用Promega試劑盒方法提取低溫保存的小鼠尾部肌肉組織的基因組DNA，并進(jìn)行電泳測(cè)純。設(shè)計(jì)引物，對(duì)樣品Sry基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增長(zhǎng)度約為1 kb，使用擴(kuò)增酶（Premix酶）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)束后用凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)是否擴(kuò)增出基因序列，并送至上海生工生物工程服務(wù)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序。

將生工測(cè)序的DNA序列使用DNAstar軟件中的Editseq和Seqman軟件進(jìn)行剪切處理，使用DAMBE軟件定義了7個(gè)單倍型，與從GenBank中下載的M.m.musculus（AF068054）、Rattus norvegicus（KC215142）的片段進(jìn)行對(duì)比分析，使用軟件Mega 6.0進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1小家鼠基因組DNA提取結(jié)果提取33個(gè)樣品基因組DNA，各取1 μL，進(jìn)行電泳和凝膠成像系統(tǒng)觀察可知，33個(gè)樣品基因組大小在20 000 bp以上，凝膠電泳結(jié)果顯示，條帶整齊明亮，樣品有少許降解，在試驗(yàn)允許范圍之內(nèi)。

2.2小家鼠基因組DNA擴(kuò)增 將樣品基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，取5 μL的擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，圖1為部分電泳結(jié)果圖。從圖1可以看出，9個(gè)樣品電泳結(jié)果較好，條帶明亮且清晰，提純結(jié)果較好，擴(kuò)增比較成功。

2.3單倍型組成使用軟件DAMBE定義3個(gè)群體33個(gè)樣品的單倍型，共定義了7個(gè)單倍型，Y1：LY7；Y2：LY10、MH37、MH43、MH44、MH46、MH47、MH48、MH49、MH50、MH51、MH56；Y3：MH62；Y4：YM53；Y5：LY11、LY12、LY23、LY3、LY33、LY41、LY43、LY45、LY48、LY6、LY8、LY9、YM39、YM56、YM59、YM6、YM69；Y6：YM72；Y7：YM78。

2.4單倍型的堿基含量組成使用Mega 6.0對(duì)單倍型中的序列進(jìn)行堿基含量分析，結(jié)果表明Sry基因中A、T、G、C的平均含量分別為A 27.5%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，樣品間堿基組成幾乎無(wú)差別（表1）。

2.5遺傳距離將7個(gè)單倍型Sry基因序列與小家鼠和大家鼠的Sry序列進(jìn)行比較，用Mega 6.0制作7個(gè)單倍型的遺傳距離（表2）。由表2可知，7個(gè)單倍型的遺傳距離十分小，

說(shuō)明7個(gè)樣本的序列非常近，該基因突變幾率很低。根據(jù)以往研究可知，小家鼠的線粒體基因遺傳分為南北兩大分支，此次試驗(yàn)中所用到的樣品為漠河、臨沂、云夢(mèng)3個(gè)群體，在遺傳距離上未體現(xiàn)出南北差異，說(shuō)明南北群體小家鼠的Sry基因無(wú)明顯差異，小家鼠與大家鼠之間存在較小的遺傳距離。

2.6系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)由圖2可知，以大家鼠（KC215142）為外群，小家鼠（AF068054）為參照序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，7個(gè)單倍型樣本構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分為2個(gè)大的分支，其中7個(gè)單倍型與M.m.musculus（AF068054）共處同一分支，與Rattus norvegicus（KC215142）不在同一分支上，存在較小差異，這也與遺傳距離所得信息一致。

3結(jié)論與討論

小家鼠是一種與人類伴生的共棲物種，作為模式物種，被廣泛利用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)等領(lǐng)域。該試驗(yàn)采用新鮮冷凍肌肉組織為材料提取DNA，用特異性引物對(duì)Sry基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)過(guò)電泳、測(cè)序等操作后，得到33個(gè)樣品小家鼠Sry基因序列信息。經(jīng)過(guò)數(shù)據(jù)分析后得到以下結(jié)果：樣本Sry序列大小均在856 bp左右。對(duì)33個(gè)序列對(duì)比分析，共定義了7個(gè)單倍型，Sry基因堿基的平均含量分別為A 275%、T 30.7%、G 22.5%、C 19.3%，這些樣品之間的堿基差別極小，序列無(wú)明顯差異。以大家鼠（KC215142）為外群，以小家鼠（AF068054）為參照序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，7個(gè)單倍型與小家鼠共處同一分支，說(shuō)明南北群體的小家鼠Sry基因無(wú)明顯差異，基因突變率極低，具有極強(qiáng)的保守性。以上結(jié)果顯示，Sry基因遺傳較為保守，但由于所用樣品數(shù)量有限，為獲得更詳盡的試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)據(jù)，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大采樣的數(shù)量和范圍，以更深入地研究其遺傳特點(diǎn)。

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