高效液相色譜法測(cè)定海洋生物中牛磺酸的含量

柳小英 毛麗沙 鮑敏潔 周瑾 金火喜

摘要[目的]建立?；撬岬母咝б合嗌V分析方法，并通過(guò)該方法測(cè)定不同海洋生物中?；撬岬暮俊方法]應(yīng)用鄰苯二甲醛（OPA）柱前衍生法，研究流動(dòng)相比例、流速、衍生劑比例、衍生時(shí)間等因素對(duì)?；撬釞z測(cè)的影響。[結(jié)果]當(dāng)?；撬帷肙PA=1∶2，衍生時(shí)間2 min，流動(dòng)相乙腈∶水=15∶85，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm時(shí)，?；撬釢舛葹?0～400 μg/mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系（R2>099），平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～7.4%。利用該方法檢測(cè)不同海產(chǎn)品中牛磺酸的含量，所選擇的海洋貝類(lèi)、甲殼類(lèi)、魚(yú)類(lèi)中均含有牛磺酸，其中海瓜子中含量最高，達(dá)11.2 mg/g。不同組織比較，魚(yú)肉中?；撬岷枯^高，而鰓中較低。[結(jié)論]該研究結(jié)果豐富了海洋生物中?；撬岷康臄?shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究?；撬嵩诓煌M織中的合成機(jī)制提供了參考。

關(guān)鍵詞海產(chǎn)品；高效液相色譜；?；撬?/p>

中圖分類(lèi)號(hào)S-3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2017）31-0001-03

Abstract[Objective]The aim was to establish the analytical method of taurine by high performance liquid chromatograph and detect the taurine content in different seafood tissues. [Method]The precolumn derivatization of ophthalaldehyde （OPA） was used to detect the taurine by studying the effects of flow phase ratio， flow rate， ratio of derivatization agent and derivatization time. [Result]The linear range （R2> 0.99） was in the range of 10-400 μg/mL at the taurine∶OPA=1∶2， derivatization time 2 min， acetonitrile∶water=15∶85， flow rate 0.5 mL/min， wavelength 360 nm. The relative standard deviation of the parallel samples was 2.9%-7.4%. The content of taurine in different seafood was tested by using this method. The results showed that taurine was determined in all selected marine shellfish， crustaceans and fish. The highest content of taurine was observed in the baby clam， which was up to 11.2 mg/g. Compared with different tissues of fish， the content of taurine in muscle was the higher， while the lower in gill. [Conclusion]The results of this study enrich the data of taurine content in marine life， and provide reference for the further study of the synthesis mechanism of taurine in different tissues.

Key wordsSeafood；High performance liquid chromatography；Taurine

?；撬幔肿邮紺2H7NO2S，是一種含硫的特殊氨基酸，在體內(nèi)不參與蛋白質(zhì)合成，以游離狀態(tài)存在。牛磺酸具有廣泛的生理功能，它的缺乏能造成視網(wǎng)膜退化，最終導(dǎo)致失明[1]；具有保護(hù)肝細(xì)胞的作用，能降低細(xì)菌毒素、次級(jí)膽酸及四氯化碳等對(duì)肝的損傷[2-3]；具有良好的抗氧化功效，能有效降低腦組織的氧化損傷[4-5]；能促進(jìn)免疫器官的發(fā)育，增強(qiáng)動(dòng)物的免疫機(jī)能[6-7]；能促進(jìn)動(dòng)物對(duì)某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，從而促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育[8-9]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)?；撬釋?duì)動(dòng)物的大腦發(fā)育有著至關(guān)重要的作用，?；撬岬娜狈?huì)導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受阻，智力低下[10-11]。因此，在嬰幼兒時(shí)期，飲食中需適當(dāng)補(bǔ)充一定量的?；撬幔貏e是用牛乳代替母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒。隨著對(duì)?；撬嵫芯康牟粩嗌钊耄湓絹?lái)越多的生理作用被挖掘。牛磺酸不僅在臨床上被用于心血管、糖尿病、眼部等疾病的治療[12-14]，還被用作食品添加劑添加到一些功能飲料及營(yíng)養(yǎng)保健品中。

?；撬釓V泛分布于哺乳動(dòng)物和海洋生物中。哺乳動(dòng)物的主要臟器，如心臟、腦、肝臟等中均含有一定量的牛磺酸；海洋生物是牛磺酸的天然寶庫(kù)，尤其是螺類(lèi)、貝類(lèi)等軟體動(dòng)物，其?；撬岷渴重S富[15-17]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，牡蠣、翡翠貽貝、馬氏珠母貝和蠑螺，其體內(nèi)?；撬岬暮烤^(guò)8 000 mg/kg[18]。隨著對(duì)?；撬嵫芯康娜諠u深入，其檢測(cè)方法也日趨完善。從早期靈敏度較低的滴定法和比色法等逐漸發(fā)展到現(xiàn)在的氨基酸自動(dòng)分析法和高效液相色譜法（HPLC）等。氨基酸自動(dòng)分析法由于設(shè)備價(jià)格昂貴且使用范圍較窄（一般僅用于檢測(cè)分析氨基酸），限制了其廣泛使用。高效液相色譜法是目前檢測(cè)?；撬嶙钪饕姆椒?，根據(jù)衍生試劑的不同又分為異硫氰酸苯酯（PITC）衍生法、丹磺酰氯（Dansyl-Cl）衍生法[19]和鄰苯二甲醛（OPA）衍生法[15-17]等，其中鄰苯二甲醛衍生法由于安全無(wú)毒、操作簡(jiǎn)便而備受青睞。

目前，有關(guān)海洋生物體內(nèi)牛磺酸的檢測(cè)已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，但基本都針對(duì)單一物種。

為此，筆者采用鄰苯二甲醛為衍生劑，巰基乙醇為保護(hù)劑，建立了峰形良好、快速準(zhǔn)確的?；撬釞z測(cè)方法，并用該方法檢測(cè)了不同海洋生物體內(nèi)牛磺酸的含量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。

美國(guó)紅魚(yú)、貽貝、白蛤等海洋生物購(gòu)于舟山市樂(lè)購(gòu)超市。

1.1.2試劑與藥劑。

?；撬?、鄰苯二甲醛、乙腈（色譜純）、硼酸、氫氧化鈉、巰基乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等試劑均購(gòu)于阿拉丁公司。

衍生試劑：稱(chēng)取0.01 g鄰苯二甲醛，用1.00 mL甲醇溶解，再加入0.01 mL巰基乙醇，用硼酸鈉緩沖液（0.4 mol/L，pH 9.5）定容至10.00 mL，在冰箱中密封避光保存。?；撬針?biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL）：稱(chēng)取0.05 g牛磺酸，用磷酸緩沖液（pH 7.4）定容至50.00 mL。

1.1.3儀器。

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），Agilent XDB-C18色譜柱（4.6 mm × 150.0 mm，5 μm），F(xiàn)S-1高速勻漿機(jī)（江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠）。

1.2方法

1.2.1?；撬岱治龇椒ǖ慕?。

在1.5 mL離心管中加入250 μL?；撬針?biāo)樣，于37 ℃恒溫水浴鍋預(yù)熱3 min，加入一定量衍生劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)2 min。反應(yīng)液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，立刻進(jìn)樣20 μL于高效液相色譜儀中，記錄其峰面積及其保留時(shí)間。根據(jù)峰型、保留時(shí)間等指標(biāo)對(duì)流動(dòng)相比例、流速等條件進(jìn)行優(yōu)化。初始條件：色譜柱XDB-C18，乙腈∶水=20∶80，?；撬帷醚苌鷦?1∶2，流速0.5 mL/min，衍生3 min，波長(zhǎng)360 nm。

1.2.2牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

將?；撬針?biāo)準(zhǔn)液（1 mg/mL）用磷酸緩沖液（pH 7.4）依次稀釋成0.40、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/mL 6個(gè)濃度梯度。按照“1.2.1”所述步驟對(duì)?；撬釢舛冗M(jìn)行測(cè)定。以?；撬釢舛葹闄M坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3精密度測(cè)試。

分別取0.01、0.10、0.40 mg/mL的牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“1.2.1”所述步驟對(duì)?；撬釢舛冗M(jìn)行測(cè)定。每種濃度平行測(cè)定3次，記錄峰面積，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4樣品中牛磺酸含量檢測(cè)。

取20 g洗凈的海洋生物組織（肉、內(nèi)臟、鰓等），加入2.5倍體積磷酸鹽緩沖液（0.02 mol/L，pH 7.4），在冷水循環(huán)控溫下勻漿30 min后離心20 min（4 ℃，8 000 r/min）去沉淀。上清液中加入2倍體積的無(wú)水乙醇脫蛋白，10 000 r/min離心15 min，按照上述方法檢測(cè)上清液中牛磺酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1流動(dòng)相比例選擇

選用乙腈與水作為流動(dòng)相，分別選擇體積比15∶85、20∶80、30∶70、40∶60進(jìn)行試驗(yàn)。由表1可知，隨著乙腈比例的增加，?；撬崤c相鄰峰的分離度變差，保留時(shí)間不斷縮短，但吸收峰面積也逐漸減小。在?；撬釢舛葹?.10 mg/mL下，當(dāng)乙腈∶水=20∶80時(shí)，?；撬徇_(dá)到基線分離，保留時(shí)間為2.98 min，峰面積為172.8；當(dāng)乙腈∶水=15∶85時(shí)，?；撬岜Ａ魰r(shí)間延長(zhǎng)到3.92 min，但峰面積增加到345.3；繼續(xù)減小乙腈的比例，保留時(shí)間會(huì)進(jìn)一步延長(zhǎng)。綜合考慮吸收峰面積及保留時(shí)間，選擇流動(dòng)相乙腈和水的比例為15∶85。

2.2流動(dòng)相流速選擇

流動(dòng)相流速是影響高效液相色譜檢測(cè)的重要因素，流速太慢，目標(biāo)物質(zhì)保留時(shí)間延長(zhǎng)，峰型變寬；流速增快可以縮短保留時(shí)間，但過(guò)快則容易導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)尚未完全檢測(cè)，峰面積變小。該試驗(yàn)選擇波長(zhǎng)360 nm，乙腈和水（15∶85）為流動(dòng)相，考察不同流速（0.3、0.5、0.7、1.0 mL/min）對(duì)?；撬幔?.0 mg/mL）檢測(cè)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同流速下?；撬峋辛己玫姆蛛x效果，但保留時(shí)間和峰面積均隨流速的增大而減?。ū?）。綜合考慮峰面積和保留時(shí)間，選擇0.5 mL/min為最終流動(dòng)相的流速。

2.3衍生劑用量的選擇

衍生劑用量也是影響牛磺酸檢測(cè)的重要因素，衍生劑過(guò)少，反應(yīng)不完全，結(jié)果準(zhǔn)確性差；衍生劑過(guò)多則容易影響峰型。該試驗(yàn)選擇不同量的衍生劑（牛磺酸標(biāo)樣和衍生劑鄰苯二甲醛的摩爾比為2∶1、1∶1、1∶2、1∶5），通過(guò)觀察峰面積和峰型，最終確定衍生劑的最適用量。由表3可知，隨著衍生劑用量的增加，?；撬岱迕娣e也逐漸增加，保留時(shí)間則變化不大。但當(dāng)衍生劑與底物摩爾比達(dá)5∶1時(shí)，牛磺酸標(biāo)樣出現(xiàn)2個(gè)分裂峰，保留時(shí)間分別為3.68和3.74 min，分離度差，未達(dá)到基線分離，說(shuō)明衍生劑過(guò)量確實(shí)會(huì)影響峰型。綜上考慮，最終選擇底物?；撬崤c衍生劑鄰苯二甲醛摩爾比為1∶2。

2.4衍生時(shí)間的選擇

牛磺酸與衍生試劑鄰苯二甲醛反應(yīng)迅速，靈敏度高，但衍生產(chǎn)物并不穩(wěn)定，衍生時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)物分解，峰面積減小。該試驗(yàn)考察了不同衍生時(shí)間（1、2、4、6 min）對(duì)?；撬釞z測(cè)的影響。由表4可知，衍生時(shí)間為2 min時(shí)，?；撬岱迕娣e達(dá)到最大；繼續(xù)延長(zhǎng)衍生時(shí)間，峰面積逐漸減小，衍生時(shí)間為6 min時(shí)，峰面積下降至1 597.7，說(shuō)明衍生物已經(jīng)部分分解。因此，確定衍生時(shí)間為2 min。

2.5?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線

在上述最優(yōu)條件下，?；撬針?biāo)樣的色譜如圖1所示。以牛磺酸標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制得?；撬針?biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。當(dāng)?；撬釢舛仍?0～400 μg/mL時(shí)，?；撬岬臐舛扰c峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為y=6.516 3x+30.192，R2=0.997 3。

2.6方法的精密度

選擇3個(gè)不同濃度的牛磺酸標(biāo)樣，分別為低濃度（10 μg/mL）、中濃度（100 μg/mL）和高濃度（400 μg/mL），同一樣品重復(fù)測(cè)定3次，峰面積見(jiàn)表5。該3種濃度的?；撬針?biāo)樣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.9%、7.4%和3.4%，說(shuō)明該方法的精密度較高，具有良好的重現(xiàn)性。

2.7海洋生物樣品中?；撬岷康臋z測(cè)

選擇了十幾種常見(jiàn)的海洋生物，對(duì)其不同組織中?；撬岷窟M(jìn)行了檢測(cè)。由表6可知，所選擇的海洋生物，包括貝類(lèi)、魚(yú)類(lèi)和甲殼類(lèi)，均檢測(cè)到相當(dāng)濃度的牛磺酸。特別是貝類(lèi)和螺類(lèi)，其?；撬岷渴重S富，如芝麻螺中含量達(dá)10.3 mg/g，而海瓜子中更是高達(dá)11.2 mg/g，蟶子、蛤蜊和血蛤中含量也較高。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[18]，牡蠣、蠑螺和翡翠貽貝中?；撬岷吭? 000 mg/kg以上，馬氏珠母貝中含量更是高達(dá)13 830 mg/kg。該試驗(yàn)中，蟶子、芝麻螺和海瓜子中牛磺酸含量也在9 000 mg/kg以上。由文獻(xiàn)報(bào)道和該試驗(yàn)結(jié)果可知，?；撬嵩谪愵?lèi)和螺類(lèi)中最豐富。相比于貝類(lèi)和螺類(lèi)，海洋魚(yú)類(lèi)中?；撬岷肯鄬?duì)偏低，但不同組織內(nèi)?；撬岷坑兴煌?。一般來(lái)說(shuō)，魚(yú)肉中?；撬岷枯^高，而鰓中則較少，如大黃魚(yú)，魚(yú)肉中牛磺酸含量為4.8 mg/g，而鰓中只有0.8 mg/g。此外，?；撬岷吭趦?nèi)臟中的分布也因魚(yú)種的不同而不同。在海鱸魚(yú)的肝臟、腸和鰓3種內(nèi)臟中，肝臟中牛磺酸含量最高，為4.6 mg/g，而鰓中含量最低，為1.8 mg/g。然而，在美國(guó)紅魚(yú)的3種內(nèi)臟中，牛磺酸含量的差異并不大。

迄今為止，有關(guān)海洋生物中?；撬岷康臋z測(cè)已有不少文獻(xiàn)報(bào)道，該研究是對(duì)前人工作的進(jìn)一步補(bǔ)充和豐富。當(dāng)然，生物體內(nèi)?；撬岬暮渴艿狡渖L(zhǎng)環(huán)境的影響，同一種生物在不同的生長(zhǎng)水域和季節(jié)以及不同的個(gè)體大小，其?；撬岷烤赡艽嬖诓町?。因此，不同的學(xué)者對(duì)同一種生物進(jìn)行測(cè)量，可能會(huì)得到不同的結(jié)果。

3結(jié)論

該研究成功建立了快速準(zhǔn)確的?；撬岣咝б合嗌V分析方法。應(yīng)用鄰苯二甲醛（OPA）為柱前衍生試劑，衍生時(shí)間2 min，?；撬帷肙PA=1∶2，流動(dòng)相乙腈∶水=15∶85、流速為05 mL/min，色譜柱Agilent Eclipse XDB-C18，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm。該方法?；撬岷吭?0～400 μg/mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系（R2>0.99），平行樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.9%～

74%。不同海產(chǎn)品中?；撬岷繖z測(cè)結(jié)果表明，所選擇的海洋生物中均含有一定量?；撬?，尤其是貝類(lèi)和螺類(lèi)中含量最豐富，最高達(dá)11.2 mg/g。不同組織比較，魚(yú)肉中?；撬岷枯^高，而內(nèi)臟中鰓中含量較低。該試驗(yàn)結(jié)果豐富了海洋生物中?；撬岷繖z測(cè)的相關(guān)研究，為進(jìn)一步研究和分析?；撬嵩诓煌M織中的合成機(jī)制提供了參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 張劍利，蘇小玫.?；撬崤c視網(wǎng)膜功能的關(guān)系[J].眼科，2003，12（5）：311-313.

[2] 李靜員，楊雅娟，馮艷，等.?；撬釋?duì)實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠保護(hù)作用的研究[J].天津中醫(yī)藥，2017，34（5）：336-340.

[3] ABDRABOU A A，ZOHEIR K M，AHMED H H.Potential impact of curcumin and taurine on human hepatoma cells using Huh7 cell line[J].Clin Biochem，2012，45（16/17）：1519-1521.

[4] WINIARSKA K，SZYMANSKI K，GORNIAK P，et al.Hypoglycaemic，antioxidative and nephroprotective effects of taurine in alloxan diabetic rabbits[J].Biochimie，2009，91（2）：261-270.

[5] 李樂(lè)慧，徐兆發(fā)，劉巍，等.?；撬釋?duì)甲基汞致大鼠腦氧化損傷的保護(hù)作用[J].環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2014，31（6）：469-471.

[6] 曾德壽，高振華，趙京輝，等.牛磺酸對(duì)肉仔雞生產(chǎn)性能、免疫器官發(fā)育及抗氧化能力的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2009，29（6）：774-778.

[7] SCHULLERLEVIS G B，PARK E.Taurine and its chloramine：Modulators of immunity[J].Neurochemical research，2004，29（1）：117-126.

[8] MATSUNARI H，F(xiàn)URUITA H，YAMAMOTO T，et al.Effect of dietary taurine and cystine on growth performance of juvenile red sea bream Pagrus major [J].Aquaculture，2008，274（1）：142-147.

[9] KIM S K，TAKEUCHI T，YOKOYAMA M，et al.Effect of dietary taurine levels on growth and feeding behavior of juvenile Japanese flounder Paralichthys olivaceus[J].Aquaculture，2005，250（3/4）：765-774.

[10] RAK K，VLKER J，JRGENS L，et al.Neurotrophic effects of taurine on spiral ganglion neurons in vitro[J].Neuroreport，2014，25（16）：1250-1254.

[11] KHIMSUKSRI S，WYSS J M，THAEOMOR A，et al.Perinatal taurine exposure programs patterns of autonomic nerve activity responses to tooth pulp stimulation in adult male rats[J].Adv Exp Med Biol，2013，775（4）：121-134.

[12] BESSHO M，MURASEMISHIBA Y，IMAGAWA A，et a1.Possible contribution of taurine to distorted glucagon secretion in intraislet insulin deficiency：A metabolome analysis using a novel αcell model of insulindeficient diabetes[J].PLoS One，2014，9（11）：113254.

[13] SCHAFFER S W，SHIMADA K，JONG C J，et al.Effect of taurine and potential interactions with caffeine on cardiovascular function[J].Amino Acids，2014，46（5）：1147-1157.

[14] 孫建，許振，徐雷.?；撬岬窝垡郝?lián)合淚道探通治療新生兒淚囊炎的療效觀察[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，35（4）：539-540.

[15] 葉思平，陳悅嬌，陳海光，等.高效液相色譜測(cè)定益智仁中的牛磺酸含量[J].食品科學(xué)，2013，34（10）：204-206.

[16] 陳申如，胡陽(yáng)，倪輝，等.高效液相色譜法測(cè)定牡蠣中?；撬岷縖J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2013，13（2）：193-198.

[17] 高加龍，章超樺，劉書(shū)成，等.鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定馬氏珠母貝中牛磺酸含量[J].廣東海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，27（1）：55-58.

[18] 譚樂(lè)義，章超樺，薛長(zhǎng)湖，等.?；撬岬纳锘钚约捌湓诤Ｑ笊镏械姆植糩J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，20（3）：75-79.

[19] UBUKA T，OKADA A，NAKAMURA H.Production of hypotaurine from Lcysteinesulfinate by rat liver mitochondria[J].Amino Acids，2008，35（1）：53-58.