姜黃素對兔頸動脈斑塊穩(wěn)定性及EPCs活力的影響

付冰 焦曉民

摘要 目的：觀察姜黃素對頸動脈斑塊穩(wěn)定性及內(nèi)祖皮細胞（EPCs）的影響。方法：將30只新西蘭兔隨機分為空白對照組、模型組及姜黃素組，各10只，其中空白對照組予普通飼料喂養(yǎng)，模型組予喂養(yǎng)高脂飼料，姜黃素組予喂養(yǎng)高脂飼料+100 mg/d姜黃素。連續(xù)喂養(yǎng)12周后HE染色法觀察3組西蘭兔主動脈內(nèi)膜斑塊厚度、外周血總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白（LDL-C）、高密度脂蛋白（HDL-C）水平以及利用MTT法測定人纖維EPCs細胞遷徙及增殖活性。結果：1）血脂水平：與空白組比較，模型組及姜黃素組TC、TG及LDL-C均升高（P<0.05），HDL-C降低（P<0.05），其中姜黃素干預后上述指標有明顯改善（P<0.05）。2）形態(tài)學變化：空白對照組頸動脈壁厚薄均勻，結構均勻，模型組及姜黃素均出現(xiàn)動脈管腔狹窄，動脈內(nèi)膜增厚，其中姜黃素組較模型組改善。3）EPCs增殖情況：與空白組比較，模型組及姜黃素OD值均降低（P<0.05），與模型組比較，姜黃素OD有所上調（P<0.05）。4）EPCs遷徙能力：空白對照組各時間點劃痕愈合率均顯著高于其余2組（P<0.05），其中姜黃素組各時間點劃痕愈合率均高于模型組（P<0.05）。結論：姜黃素由明顯抗動脈粥樣硬化作用，其作用機制可能與促進EPCs增殖及遷徙有關。

關鍵詞 頸動脈斑塊；穩(wěn)定性；EPCs；姜黃素；PI3K/AKT；信號通路

Abstract Objective：To observe the influence of curcumin on stability of rabbit carotid plaques and endothelia progenitor cells （EPCs）.Methods： Thirty New Zealand rabbits were randomly divided into a blank control group， a model group and a curcumin group， 10 cases in each. The blank control group had ordinary diet， the model group high fat diet， the curcumin group high fat diet plus 100 mg/d of curcumin. After continuous feeding for 12 weeks， thickness of aortic intima plaque， peripheral blood total cholesterol （TC）， triglyceride （TG）， low density lipoprotein （LDL-C）， high density lipoprotein （HDL-C） levels of all rabbits were observed by HE staining and measured migration and proliferation activity of EPCs cell by MTT method. Results： 1） Lipid levels： compared with the blank group， TC， TG， and LDL-C were higher in the model group and the curcumin group （P<0.05）， HDL-C lower （P<0.05）， and after the intervention of curcumin， the above indicators improved significantly （P<0.05）. 2） Morphological changes： the thickness of carotid artery wall in the blank control group were uniform， and with uniform structure， and the model group and the curcumin group were with artery luminal stenosis， thickening of the arterial intima， and the curcumin group improved compared with the model group. 3） The EPCs proliferation： compared with the blank group， OD values of the model group and the curcumin group were lower （P<0.05）； compared with the model group， OD of the curcumin group increased （P<0.05）.4） Capacity of EPCs migration： scratches healing rate of the blank control group at each time point were significantly higher than that of the other two groups （P<0.05）； the scratch healing rate of the curcumin group was higher than that of the model group at each time point （P<0.05）. Conclusion： Curcumin had obvious resistance effect on atherosclerosis， and the mechanism may be associated with the promoting of proliferation and migration on the EPCs.

Key Words Carotid plaques， Stability， EPCs， Curcumin

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2017.06.046

逐年增長的心腦血管事件發(fā)病率給人類生命健康帶來沉重打擊，其中動脈粥樣硬化（Atherosclerosis，AS）是冠心病及缺血性腦梗死的主要獨立危險因子，因此抗AS被視為治療心腦血管事件的核心任務[1-2]。近年來，中草藥以療效顯著、毒性低等生物效應被諸多生物、醫(yī)學界工作者納入研究，姜黃素屬于姜黃中提取的酸性酚類物質，據(jù)目前已知資料證實姜黃素有明顯抗AS效應，但其作用機制尚無統(tǒng)一定論。內(nèi)皮祖細胞（EPCs）是血管形成前體細胞，具有較強增殖能力并最終分化成血管內(nèi)皮細胞，廣泛參與血管新生及血管內(nèi)膜修復等環(huán)節(jié)[3]，因此我們設想：姜黃素抗AS效應是否通過ERCs細胞增殖進行介導？為了證實這一觀點我們進行一系列研究?，F(xiàn)將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 取30只新西蘭兔，平均體重（2.1±0.19）kg，所有動物均由遼寧長生生物有限公司動物實驗中心提供，飼養(yǎng)環(huán)境設置：室溫（23±2）℃，相對濕度（56±6）%。

1.1.2 試劑與儀器 膽固醇粉購自上海國光生物有限公司，DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，MTT即四甲基偶氮唑藍購自Sigma公司，胰酶購自Biosharp公司，DMSO購自Sigma公司，96孔板，超凈工作臺購自蘇州安泰公司，細胞恒溫培養(yǎng)箱購自日本SANYO公司，酶標定量測定儀購自Thermo Multiskan AsCant公司，可調控溫度離心機購自Eppendorf公司，流式細胞儀購自BD公司，姜黃素購自神威藥業(yè)有限公司，豬油自行市場購買，蛋黃粉購自河南上宇公司。PI3K、AKT、β-acting抗體均購自CST公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 30只新西蘭兔隨機分為空白對照組、模型組及姜黃素組，各10只。高脂飼料配方：10%蛋黃粉+5%豬油+1%膽固醇粉+84%常規(guī)兔飼料。即每100 g飼料中含有10 g蛋黃粉，5 g豬油，1 g膽固醇粉及84 g常規(guī)飼料。除空白對照組予喂養(yǎng)純常規(guī)飼料，模型組及姜黃素均予連續(xù)12周喂養(yǎng)高脂飼料，所有動物自由飲水，并設置12/12晝夜交替燈光周期。

1.2.2 干預方法 空白對照組及模型組予0.9%NaCl溶液（廣西裕源藥業(yè)有限公司，國藥準字H45020977）以10 mL/kg灌胃，姜黃素組亦以以10 mL/kg灌胃，3組均1次/d，連續(xù)給藥4周。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 血脂檢測 給藥4周后動物均禁食12 h，次日清晨以0.3 mL/kg水合氯醛麻醉動物后抽取空腹兔耳動脈血5 mL，在4 ℃條件以5 000 r/min離心5 min，抽取上清液待查，并用酶法檢測動物TG、TC、HDL-C、LDL-C。

1.2.3.2 EPCs細胞的分離及培養(yǎng) 完成1.2.1步驟后于3組新西蘭兔雙側脛骨平臺抽取骨髓血，利用密度梯度離心法提取單核細胞，加4 mL DMEM高糖培養(yǎng)基，離心1 000 r/min×3 min，棄去上清，加入5 mL完全培養(yǎng)基（10%胎牛血清），用巴士吸管輕輕吹大，使細胞懸浮，接種于培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中孵育，24 h換液，棄去沒貼壁的細胞，繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞鋪滿瓶底80%以上時，以0.25%的胰酶消化傳代。

1.2.3.3 頸動脈取材 完成1.2.3.2抽取骨髓后于耳緣靜脈注入空氣處死3組新西蘭兔，隨后逐層剪開頸部皮膚暴露左頸總動脈，利用手術剪剪取長約2 cm的動脈，置于提前配制好的0.1 MPBS中反復清洗，隨后將標本置于多聚甲醛后固定24 h，在進行常規(guī)石蠟包埋、切片、染色，并在顯微鏡下觀察形態(tài)學改變。

1.2.3.4 MTT法測細胞增殖情況 將處于對數(shù)生長期的EPCs細胞密度調整為2×104個/ mL，接種于24孔板，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，將實驗分為空白組、模型組、姜黃素組、各組6個復孔。每孔加入CCK28 10 μL，培育4 h后每孔加入20 μL 5 g/L MTT，繼續(xù)孵育4 h后，吸棄上清，每孔加入DMSO150 μL，振蕩10 min，酶標儀在490 nm波長處讀取OD值。

1.2.3.5 細胞遷移劃痕實驗 將處于對數(shù)生長期的EPCs細胞密度調整為2×104個/ mL，接種于24孔板，37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，利用移液槍對細胞進行劃“一”操作，每孔劃分痕1次，隨后用0.1MPBS沖洗3次，將懸浮非貼壁細胞盡量沖洗脫離，再加入培養(yǎng)液，再次置于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h、24 h及48 h，隨后顯微鏡下觀察劃痕愈合情況，劃痕愈合率=（拍攝時劃痕面積-初始面積）/初始面積×100%[8]

1.2.3.6 Western-blot檢測PI3K、AKT的表達 將收集的EPCs細胞收集加入100 μL裂解液進行細胞分裂，放入4 ℃振蕩器中持續(xù)震蕩30 min，并將液體用移液槍轉移至事先預冷離心管，再次置于4 ℃離心機中以5 000 r/min轉速進行離心15 min，用移液槍將上清液抽取至新的離心管中備用。利用BCA試劑盒測定蛋白濃度，并在100 ℃水浴中進行蛋白變性7 min，并計算上樣量。事先配制好SDS-PAGE膠體，用移液槍將蛋白加之膠體中進行電泳，隨后將蛋白轉移至硝酸纖維膜上，隨后用脫脂奶粉進行封閉2 h，用PBS清洗2次，10 min/次，加1∶500稀釋的一抗（PI3K、AKT）及內(nèi)參抗體（β-acting，1∶3 000）室溫孵育2 h，用PBS清洗2次，10 min/次，隨后加入辣根過氧化酶HRP-二抗，室溫下輕搖2h取出繼續(xù)PBS清洗2次，10 min/次，最后利用ECL顯影，拍照，統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0單因素方差分析（One-Way ANOVA），各組數(shù)據(jù)均用（±s）表示，各組所得數(shù)據(jù)與空白組比較，計量資料符合正態(tài)分布，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組血脂情況 與空白組比較，模型組及姜黃素組TC、TG及LDL-C均升高（P<0.05），HDL-C降低（P<0.05），其中姜黃素干預后上述指標有明顯改善（P<0.05）。見表1。

2.2 3組左頸動脈形態(tài)學的變化 空白對照組頸動脈壁厚薄均勻，結構均勻，模型組及姜黃素均出現(xiàn)動脈內(nèi)膜增厚及不均，其中姜黃素組較模型組改善。見圖1。

2.3 EPCs細胞增殖情況 與空白組比較，模型組及姜黃素OD值均降低（P<0.05），與模型組比較，姜黃素OD有所上調（P<0.05）。見表2。

2.4 EPCs細胞遷徙能力變化 空白對照組各時間點劃痕愈合率均顯著高于其余2組（P<0.05），其中姜黃素組各時間點劃痕愈合率均高于模型組（P<0.05）。見表3。

2.5 PI3K、AKT蛋白表達的變化 造模后模型組及姜黃素組新西蘭兔外周單核細胞中PI3K蛋白及AKT蛋白均較空白對照組下降，其中模型組下降的趨勢更明顯（P<0.05）。見表4。

3 討論

動脈管壁在長期不同病理因素激下逐漸發(fā)生病變，主要導致脂質聚集及其表面纖維帽的形成，最終導致動脈粥樣硬化，并有病理學資料證實粥樣硬化性斑塊的穩(wěn)定性取決于纖維帽的厚度及血管內(nèi)皮細胞的活性，傳統(tǒng)觀點認為血流剪應力導致血管內(nèi)皮細胞受損所致，最終形成動脈粥樣硬化斑塊。但近年來某些新發(fā)現(xiàn)提出了異議[4-6]，部分學者通過病理學實驗證實動脈有樣硬化是血管內(nèi)皮細胞動態(tài)平衡受損導致。EPCs細胞是一類具有高度增殖的前體細胞，其通過不斷的增殖反應最終分化為成熟血管內(nèi)皮細胞，并廣泛參與血管新生及內(nèi)皮細胞修復的過程，當機體中EPCs數(shù)量不足，無法及時修復受損的內(nèi)皮細胞，因此動脈粥樣硬化隨之而來，有學者利用多因素Logic多因素回歸分析顯示，內(nèi)皮細胞數(shù)量減少是腦動脈粥樣硬化的獨立危險因子。故越來越多學者認為EPCs有望成為調節(jié)內(nèi)皮細胞功能最終實現(xiàn)抗動脈粥樣硬化的靶方向之一。在本研究中我們利用對新西蘭兔進行動脈粥樣硬化模型制作，并進行血脂、頸動脈形態(tài)學研究，同時檢測了動物的EPCs細胞增殖情況及其遷徙能力，結果顯示高脂飼料喂養(yǎng)下新西蘭兔血脂明顯高于正常組，并且在其左頸總動脈發(fā)現(xiàn)明顯的動脈粥樣硬化斑塊，同時出現(xiàn)血管內(nèi)皮明顯不均，與此同時我們還發(fā)現(xiàn)模型組EPCs細胞增殖能力及遷徙能力明顯減弱，這一結果與國內(nèi)外諸多文獻研究一致[7-12]，這說明動脈粥樣硬化者確存在EPCs細胞數(shù)量及功能減弱，影響了其修復血管內(nèi)皮的效應，EPCs細胞確在抗AS中扮演重要角色。

姜黃素是一種多酚類植物單體，提取自中草藥姜黃、莪術等塊莖中，具有破血行氣、通經(jīng)止痛功效，中醫(yī)學無動脈粥樣硬化的病名，其屬于“血瘀”范疇，活血化瘀是其主要治則。現(xiàn)代藥理學證實姜黃素擁有酚和β-二酮結構并存在化學結構，其中酚性羥基具有較強的捕捉清楚自由基的能力，有學者[13]發(fā)現(xiàn)姜黃素可利用過氧化反應將自由基轉化為諸多二聚體的產(chǎn)物，使其具有穩(wěn)定的二氫呋喃結構，而二氫呋喃結構產(chǎn)物易溶解于酸性環(huán)境，具有一定的抗腫瘤效應。此外，有研究顯示姜黃素對超氧陰離子等多種自由基有明顯清除能力，減少了自由基對組織及細胞的損害，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過造模的新西蘭兔血脂明顯異常，頸動脈內(nèi)膜明顯受損，EPCs細胞增殖及遷徙能力明顯減弱，在經(jīng)過為期4周姜黃素干預后新西蘭兔血脂水平有所恢復，勁動脈內(nèi)膜得到一定修復，同時促進了EPCs細胞的增殖及遷徙能力，這說明姜黃素可刺激EPCs細胞增殖及遷移而達到抗AS的目的。然后姜黃素是通過何種途徑促進EPCs細胞的增殖目前尚處于研究階段，我們亦進行一系列研究，結果顯示姜黃素促進EPCs細胞的增殖機制可能與PI3K/Akt信號通路關系密切。PI3K/Akt信號通路與細胞的增殖、凋亡過程關系密切，當此信號通路在不同刺激因素作用下被激活，可不斷磷酸化下游的增殖凋亡相關的蛋白，PI3K屬于激酶物質，具有明顯的催化磷脂酰肌醇效應，可通過調節(jié)活化AKT抑制線粒體釋放凋亡因子，從而促進細胞增殖，在本研究中我們發(fā)現(xiàn)造模的新西蘭兔PI3K及AKT表達水平均是下降的，但是經(jīng)過姜黃素干預后PI3K蛋白及AKT蛋白的表達有所上調，這說明姜黃素促進EPCs細胞的增殖，抑制其凋亡可能與激活PI3K/AKT信號通路有關。

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（2017-03-06收稿 責任編輯：徐穎）