生長(zhǎng)抑制因子1在肝細(xì)胞肝癌中的表達(dá)及臨床意義

張磊++陳云志++陳永平

[摘要] 目的 探討生長(zhǎng)抑制因子ING1（inhibitor of growth1）在肝細(xì)胞肝癌（human hepatocellular carcinoma，HCC）中的表達(dá)情況及臨床意義。 方法 采用定量RT-PCR方法，檢測(cè)86例HCC組織及相應(yīng)癌旁組織中ING1 mRNA的表達(dá)量，分別計(jì)算腫瘤組織和癌旁組織的△CT值，來(lái)計(jì)算△CT癌旁/△CT腫瘤的比值，以2為閾值，分成高表達(dá)組和低表達(dá)組，分析兩組患者的臨床資料及生存時(shí)間。 結(jié)果 ING1 mRNA在HCC組織中的表達(dá)水平明顯低于癌旁肝組織（P<0.05）。高表達(dá)組48例，低表達(dá)組38例。兩組患者的組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期以及門脈浸潤(rùn)等臨床病理因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；年齡、性別、HBV感染、AFP、腫瘤大小及肝硬化等因素，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間分別為34.5個(gè)月和19.5個(gè)月，高表達(dá)組明顯長(zhǎng)于低表達(dá)組（P<0.05）。 結(jié)論 ING1作為抑癌基因可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可作為判斷HCC預(yù)后的重要分子標(biāo)志。

[關(guān)鍵詞] 抑癌基因；肝細(xì)胞肝癌；生長(zhǎng)抑制因子1；實(shí)時(shí)熒光定量PCR

[中圖分類號(hào)] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2016）35-0001-04

Expression of inhibitor of growth 1 in human hepatocellular carcinoma and its clinical significance

ZHANG Lei1 CHEN Yunzhi2 CHEN Yongping1

1.Department of Infectious Diseases， the First Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000，China；2.Department of Hepatobiliary Surgery， the First Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University， Wenzhou 325000， China

[Abstract] Objective To discuss the expression and clinical significance of inhibitor of growth 1 （ING1） gene in human hepatocellular carcinoma（HCC）. Methods There were 86 pairs of samples comprised of HCCs and their paracancerous tissues. The mRNA levels of ING1 in these samples were detected by quantitative RT-PCR. The △CT values and the ratio of △CT values within each pair were calculated respectively. The different pairs were grouped based on 2 as the cut-off value of the ratio. Correlations between clinicopathologic variables， over all survival and ING1 mRNA expression were analyzed. Results ING1 mRNA was significantly lower in HCC than that in the paired paracancerous tissues（P<0.05）. 48 patients were classified as high expression group and the other 38 patients were categorized as low expression group. There were significant differences between the two groups in term of histological grade， lymphnode metastasis， TNM stage and portal vein invasion（P<0.05）. The current study failed to find significant differences between the two groups in the following clinical characteristics： age， gender， hepatitis B virus（HBV） infection， α-fetoprotein （AFP） level，tumor size and liver cirrhosis （P>0.05）. Survival time of high expression group was significantly longer than that of low expression group（median survival， 34.5 months vs 19.5 months，P<0.05）. Conclusion ING1 as a tumor suppressor may contribute to the occurrence and development of HCC. Its expression level can be used to predict prognosis of HCC.

[Key words] Tumor suppressor gene； Human hepatocellular carcinoma； Inhibitor of growth 1； Quantitative RT-PCR

近年來(lái)發(fā)現(xiàn)生長(zhǎng)抑制因子（inhibitor of growth，ING）家族能誘導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)周期停滯、促進(jìn)細(xì)胞衰老和凋亡、調(diào)控DNA復(fù)制及損傷應(yīng)答、抑制腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[1]。已有研究證實(shí)，此類基因在腫瘤組織中的表達(dá)大多呈下調(diào)狀態(tài)[2]。生長(zhǎng)抑制基因1（inhibitor of growth 1 gene，ING1）作為ING家族的第1個(gè)成員于1996年被 Garkavtsev I等[3]在乳腺上皮細(xì)胞中用改良的cDNA消減雜交方法成功克隆出來(lái)，之后被相關(guān)領(lǐng)域的學(xué)者廣泛研究。

肝細(xì)胞肝癌（human hepatocellular carcinoma）是全世界范圍內(nèi)常見且預(yù)后差的惡性腫瘤之一。肝部分切除、肝移植是目前治愈肝癌的有效方法，但多數(shù)患者確診時(shí)已處于進(jìn)展期，失去手術(shù)機(jī)會(huì)。根據(jù)最新發(fā)布的全球癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2012年全球肝癌新發(fā)病例數(shù)超過(guò)78萬(wàn)人，而死亡病例數(shù)則接近75萬(wàn)人[4]。導(dǎo)致正常肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制至今尚未完全闡明。在與肝癌相關(guān)的抑癌基因研究中，除了被人們廣泛關(guān)注的p53、Rb和APC等抑癌基因之外，候選抑癌基因生長(zhǎng)抑制因子（ING）家族成員在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。在ING家族與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系的研究中，ING1是被研究最為廣泛的成員。但是關(guān)于ING1基因與肝癌的相關(guān)研究報(bào)道并不多見，其中涉及到其表達(dá)與肝癌預(yù)后關(guān)系的研究更是少見。本研究采用qRT-PCR的方法，檢測(cè)肝癌原發(fā)灶及其癌旁組織標(biāo)本中抑癌基因ING1 mRNA的表達(dá)，探討其與臨床病理資料的相關(guān)性及對(duì)肝癌患者預(yù)后的影響，以期為臨床肝癌的診斷與治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料

本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。入組標(biāo)準(zhǔn)：首次就診診斷為原發(fā)性肝癌并未接受任何治療；無(wú)腹腔積液及肝性腦??；肝功能分級(jí)為Child-Pugh A或B級(jí)；術(shù)后病理證實(shí)為肝細(xì)胞肝癌。臨床分期采用第七版TNM分期系統(tǒng)，病理分級(jí)則采用Edmondson-Steiner分級(jí)法。排除標(biāo)準(zhǔn)：轉(zhuǎn)移性肝癌患者；術(shù)前肝功能Child-Pugh C級(jí)或術(shù)前接受TACE、射頻等治療；術(shù)后病理提示膽管細(xì)胞癌、混合細(xì)胞癌等非肝細(xì)胞肝癌。收集2006～2011年在溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院接受手術(shù)治療的資料完整的肝癌病例86例，其中男60例，女26例，年齡32～76歲，平均（54.4±10.6）歲，50歲及以上63例，50歲以下23例。留取術(shù)中切除的肝癌組織及癌旁肝組織標(biāo)本。采用定量RT-PCR方法，檢測(cè)HCC組織及相應(yīng)癌旁組織中ING1 mRNA的表達(dá)量，分別計(jì)算腫瘤組織和癌旁組織的△CT值，計(jì)算△CT癌旁/△CT腫瘤的比值，以2為閾值，△CT癌旁/△CT腫瘤的比值≤2為高表達(dá)組，△CT癌旁/△CT腫瘤的比值>2為低表達(dá)組。入組患者的詳細(xì)資料見表1。

1.2 qRT-PCR的主要試劑和方法

1.2.1 提取RNA 取肝癌組織和癌旁組織各100 mg，方法參照TRIzol reagent（Invitrogen，Carlsbad，CA）提供的操作說(shuō)明提取樣本總RNA，用核酸蛋白檢測(cè)儀在260 nm和280 nm檢測(cè)吸光度（A260/280）值，計(jì)算總RNA的含量及純度。

1.2.2 逆轉(zhuǎn)錄 從總的RNA中提取2 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以合成第一鏈cDNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒采用ReverTra AceR qPCR RT Kit（TOYOBO， Japan）。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 操作流程按照ABI 7300實(shí)時(shí)定量PCR系統(tǒng)以及熒光定量試劑盒THUNDERBIRDRSYBRRqPCR Master Mix Kit（TOYOBO，Japan）所提供的說(shuō)明進(jìn)行。

1.2.4 目標(biāo)基因ING1及內(nèi)參基因GAPDH的引物序列 見表2。

1.2.5 擴(kuò)增條件 擴(kuò)增條件為95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，68℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果分析軟件采用ABI 7300 System SDS Versions 1.4，通過(guò)△Ct法分析real-time PCR結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所獲數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)來(lái)判斷其是否符合正態(tài)分布，如果符合正態(tài)分布，則組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)類型分別采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，則以中位數(shù)表示，采用非參數(shù)Mann-Whitney檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)及率表示，組間比較根據(jù)數(shù)據(jù)類型采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率檢驗(yàn)。非參數(shù)秩和檢驗(yàn)分析肝癌與癌旁肝組織ING1 mRNA表達(dá)差異?？偵鏁r(shí)間（OS）應(yīng)用生存曲線以圖表的形式展現(xiàn)，并且應(yīng)用Log-rank檢驗(yàn)檢測(cè)組間生存差異。顯著性檢驗(yàn)水平為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 ING1 mRNA在肝癌組織及癌旁組織的表達(dá)情況

qRT-PCR的結(jié)果顯示，所有腫瘤組織和相應(yīng)癌旁組織均有ING1 mRNA的表達(dá)，且癌組織中的表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)的癌旁組織。癌組織為2.1115（0.6637～5.7722），癌旁組織為10.6089（3.1409～39.6602），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=-6.238，P<0.001），見封三圖1。

2.2 ING1 mRNA表達(dá)與肝癌臨床病理資料的關(guān)聯(lián)分析

高表達(dá)組和低表達(dá)組在組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期以及門脈浸潤(rùn)等臨床病理因素，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而在年齡、性別、HBV感染、AFP、腫瘤大小及肝硬化等因素方面，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（表1）。

2.3 ING1基因表達(dá)與HCC預(yù)后的關(guān)系

高表達(dá)組和低表達(dá)組患者的中位生存時(shí)間分別為34.5個(gè)月和19.5個(gè)月。兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.016，OR=2.199，95%置信區(qū)間：1.158～4.175，封三圖2）。

3 討論

ING1是新近發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤抑制基因，定位于13號(hào)染色體的q33至q34區(qū)域，在人類中一共存在5種ING基因（ING1、ING2、ING3、ING4、ING5），ING1是ING家族最先發(fā)現(xiàn)的基因，它具有4種不同的剪接體形式，其中研究較多的為p33[5，6]。在對(duì)包括HCC在內(nèi)的各種人類惡性腫瘤的多個(gè)研究中發(fā)現(xiàn)，ING1在惡性腫瘤組織及細(xì)胞系中的表達(dá)降低[7-9]。本研究結(jié)果提示，所有腫瘤組織和相應(yīng)的癌旁組織都有ING1的表達(dá)，且腫瘤組織中ING1表達(dá)水平明顯低于相應(yīng)癌旁組織，這表明ING1基因低表達(dá)可能與原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。這一結(jié)果與Ohgi T等[10]關(guān)于ING1在HCC中表達(dá)缺失的結(jié)果相一致。

肝癌發(fā)生發(fā)展是一個(gè)涉及基因表達(dá)、表觀遺傳學(xué)變異的復(fù)雜過(guò)程，P53基因表達(dá)異常是肝癌發(fā)生中最常見的分子事件[11]。Garkavtsev I等[12]研究發(fā)現(xiàn)，ING1基因所編碼的p33蛋白為p53結(jié)合蛋白，p53抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用需要有ING1參與。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)表明，p53的轉(zhuǎn)錄激活作用依賴于ING1，沒有ING1的參與，p53的作用明顯減弱。ING1被認(rèn)為是一種與p53共同參與細(xì)胞信號(hào)通路，它的功能發(fā)揮部分依賴于p53的繳活，從而對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用，故也稱ING1為p53的分子伴侶。ING1與p300乙?；傅南嗷プ饔?，可增加p53的乙酰化水平，從而促進(jìn)與細(xì)胞周期停滯、凋亡和衰老等有關(guān)的基因如p21、bax等的翻譯增加。而且，ING1可通過(guò)與去乙酰化酶SIRT1的作用阻止p53的去乙?；?，從而保持p53的乙酰化水平[12-14]。然而，Cheung KJ等[15]通過(guò)基因敲除小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，p33 ING1抑癌作用的發(fā)揮并不依賴于p53，提示有其他機(jī)制參與其腫瘤抑制作用。

抑癌基因ING1在各種惡性腫瘤中的表達(dá)水平與相關(guān)臨床病理資料之間的關(guān)系已被廣泛研究。ING蛋白在細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)、細(xì)胞衰老及癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、血管再生等方面發(fā)揮重要作用[16]。當(dāng)其作為二型腫瘤抑制基因時(shí)，控制了細(xì)胞增殖、凋亡和衰老，同時(shí)也可作為一型腫瘤抑制基因參與DNA的復(fù)制與修復(fù)[17]。目前認(rèn)為，ING在癌細(xì)胞中的表達(dá)缺失或失調(diào)主要發(fā)生在RNA水平，但其具體機(jī)制尚不明確[18]。microRNA的作用可能是其機(jī)制之一，在一項(xiàng)胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-622可以作用于ING1基因的 3‘UTR（即非翻譯區(qū)）而使ING1的表達(dá)減少[19]，而前者被證明在胰腺癌、食道癌中存在過(guò)分表達(dá)[20，21]。我國(guó)多位學(xué)者在胃癌、大腸癌方面，均指出淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者ING1 mRNA的表達(dá)水平顯著下降[22，23]。但關(guān)于肝癌的此方面研究目前并不多見。本研究顯示，ING1 mRNA低表達(dá)與肝癌組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤TNM分期以及門脈浸潤(rùn)相關(guān)，從而提示ING1 mRNA的低表達(dá)可能參與了肝癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。而性別、HBsAg、腫瘤大小、AFP、肝硬化情況等變量的差異與ING1的mRNA表達(dá)無(wú)關(guān)。同時(shí)，本研究亦顯示ING1 mRNA高表達(dá)肝癌患者較低表達(dá)患者遠(yuǎn)期生存時(shí)間長(zhǎng)，提示ING1 mRNA可能可作為預(yù)測(cè)肝癌預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。ING1蛋白的功能失調(diào)會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，但是ING1蛋白表達(dá)下調(diào)與癌癥發(fā)生之間的因果聯(lián)系及其深層次的機(jī)制還不很清楚。在今后的研究中我們將進(jìn)一步研究ING1低表達(dá)與肝癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Jafarnejad SM，Li G. Regulation of p53 by ING family members in suppression of tumor initiation and progression[J]. Cancer Metastasis Rev，2012，31（1-2）：55-73.

[2] Lu M，Chen F，Wang Q，et al. Downregulation of inhibitor of growth 3 is correlated with tumorigenesis and progression of hepatocellular carcinoma[J]. Oncol Lett，2012，4（1）：47-52.

[3] Garkavtsev I，Kazarow A，Gudkov A，et al. Suppression of the novel growth inhibitor p33ING1 promotes neoplastic transformation[J]. Nat Genet，1996，14（4）：415-420.

[4] Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al. Global cancer statistics，2012[J]. CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[5] Gong W，Suzuki K，Russell M，et al. Function of the ING family of PHD proteins in cancer[J]. Int J Biochem Cell Biol，2005，37（5）：1054-1065.

[6] Satpathy S，Nabbi A，Riabowol K. RegulatING chromatin regulators：Post-translational modification of the ING family of epigenetic regulators[J]. Biochem J，2013，450（3）：433-442.

[7] Luo ZG，Tang H，Li B，et al. Genetic alterations of tumor suppressor ING1 in human non-small cell lung cancer[J]. Oncol Rep，2011.，25（4）：1073-1081.

[8] Borkosky SS，Gunduz M，Beder L，et al. Allelic loss of the ING gene family loci is a frequent event in ameloblastoma[J].Oncol Res，2010，18（10）：509-518.

[9] Tallen G，F(xiàn)arhanqi S，Tamannai M，et al. The inhibitor of growth 1（ING1）proteins suppress angiogenesis and differentially regulate angiopoietin expression in glioblastoma cells[J]. Oncol Res， 2009，18（2-3）：95-105.

[10] Ohgi T，Masaki T，Nakai S，et al. Expression of p33（ING1）in hepatocellular carcinoma：Relationships to tumour differentiation and cyclin E kinase activity[J]. Scand J Gastroenterol，2002，37（12）：1440-1448.

[11] Aravalli RN，Steer CJ，Cressman EN. Molecular mechanisms of hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology，2008， 48（6）： 2047-2063.

[12] Garkavtsev I，Griqorian IA，Ossovskaya VS，et al. The candidate tumour suppressor p33ING1 cooperates with p53 in cell growth control[J]. Nature，1998，391（6664）：295-298.

[13] Binda O，Nassif C，Branton PE. SIRT1 negatively regulates HDAC1-dependent transcriptional repression by the RBP1 family of proteins[J]. Oncogene，2008，27（24）：3384-3392.

[14] Kataoka H，Bonnefin P，Vieyra D，et al. ING1 represses transcription by direct DNA binding and through effects on p53[J]. Cancer Res，2003，63（18）：5785-5792.

[15] Cheung KJ， Bush JA，Jia W，et al. Expression of the novel tumour suppressor p33（ING1） is independent of p53[J]. Br J Cancer， 2000，83（11）：1468-1472.

[16] Satpathy S，Guerillon C，Kim TS，et al. SUMOylation of the ING1b tumor suppressor regulates gene transcription[J].Carcinogenesis，2014，35（10）：2214-2223.

[17] Guerillon C，Bigot N，Pedeux R. The ING tumor suppressor genes：status in human tumors[J]. Cancer Lett，2014， 345（1）：1-16.

[18] Ythier D，Larrieu D，Brambilla，et al. The new tumor suppressor genes ING：genomic structure and status in cancer[J]. Int J Cancer，2008，123（7）：1483-1490.

[19] Guo XB，Jing CQ，Li LP，et al. Down-regulation of miR-622 in gastric cancer promotes cellular invasion and tumor metastasis by targeting ING1 gene[J]. World J Gastroenterol，2011，17（14）： 1895-1902.

[20] Schultz NA，Werner J，Willenbrock H，et al. MicroRNA expression profiles associated with pancreatic adenocarcinoma and ampullary adenocarcinoma[J]. Mod Pathol，2012，25（12）：1609-1622.

[21] Odenthal M，Bollschweiler E，Grimminger PP，et al. MicroRNA profiling in locally advanced esophageal cancer indicates a high potential of miR-192 in prediction of multimodality therapy response[J]. Int J Cancer，2013， 133（10）：2454-2463.

[22] 何向民，婁毅，宋清斌，等. 胃癌組織ING1抑癌基因表達(dá)及其生物學(xué)意義探討[J]. 中華腫瘤防治雜志，2012， 19（15）： 1153-1155.

[23] 薛偉男，張干，楊艷梅，等. 抑癌基因ING1在大腸癌中的表達(dá)及預(yù)后意義[J]. 實(shí)用腫瘤學(xué)雜志，2014，28（5）：385-390.

（收稿日期：2016-09-04）