Rcan2在結(jié)直腸癌診斷中的應(yīng)用

陳苗生　邱曉明

[摘要] 目的 探討Rcan2在結(jié)直腸癌組織中的表達及與臨床病理的相互關(guān)系。 方法 方便收集該院2012年 1 月— 2017 年 1月期間診治的炎癥性腸病20 例、增生性息肉20例、腺瘤40 例、結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織80 例，獲取標本總RNA，q PCR測定 Rcan2 mRNA 表達水平，對Rcan2 mRNA的差異表達與結(jié)直腸癌患者臨床病理信息進行相關(guān)性分析。體外轉(zhuǎn)染Rcan2基因于結(jié)直腸癌colo320DM細胞，MTT實驗觀察Rcan2過表達對腫瘤細胞增殖的影響。體外轉(zhuǎn)染kras突變基因（G12V）于人結(jié)直腸癌細胞中，觀察Rcan2基因的表達情況。 結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中Rcan2 mRNA表達量（2.98±0.21）明顯高于其他各組。Rcan2 mRNA的表達量與腫瘤大小密切相關(guān) （P <0.01） 。Rcan2-pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細胞增長速度慢，OD值從10上升到14，而pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細胞增長速度快，OD值從12上升到18 ，過表達kras（G12V）抑制Rcan2基因表達。Rcan2相對表達量從2.8下降到1.1。 結(jié)論 這些發(fā)現(xiàn)提示Rcan2是一個潛在的結(jié)直腸癌診斷指標。

[關(guān)鍵詞] Rcan2；實時熒光定量PCR；結(jié)直腸癌； mRNA

[中圖分類號] R446.1；R730.23 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-0742（2017）08（a）-0005-03

[Abstracts] Objective This paper tries to investigate the expression of Rcan2 in colorectal cancer and its relationship with clinicopathological features. Methods Convenient selection 20 patients with inflammatory bowel disease， 20 cases of hyperplastic polyps， 40 cases of adenoma， 80 cases of colorectal cancer and adjacent normal tissues from January 2012 to January 2017 in this hospital were collected. The total RNA， the expression of Rcan2 mRNA was measured by qPCR， and the difference of Rcan2 mRNA expression was correlated with the clinicopathological information of patients with colorectal cancer. The effect of Rcan2 overexpression on tumor cell proliferation was observed by MTT assay in colorectal cancer colorectal cancer cells transfected with Rcan2 gene in vitro. In vitro transfection of kras mutant gene（G12V） in human colorectal cancer cells， the expression of Rcan2 gene was observed. Results The expression of Rcan2 mRNA in colorectal cancer tissues was （2.98±0.21）， significantly higher than that in other groups. The expression of Rcan2 mRNA was closely related to tumor size （P<0.01）. Rcan2-pcdna3.1 transfected cell growth rate was relatively slow， from 10 to 14， pcdna3.1 transfected cells grew faster， from 12 to 18， overexpression kras （G12V） inhibit expression of Rcan2 gene expression， the relative expression of Rcan2 decreased from 2.8 to 1.1. Conclusion These findings suggest that Rcan2 is a potential diagnostic indicator for colorectal cancer.

[Key words] Rcan2； q PCR； Colorectal cancer； mRNA

結(jié)直腸癌是我國常見惡性腫瘤之一，嚴重影響到人們生活健康[1]，由于發(fā)病機制復(fù)雜，涉及多個基因，因此了解結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展機制，找到結(jié)直腸癌診斷指標，對有效治療結(jié)直腸癌具有重要意義。Rcan2做為甲狀腺激素反應(yīng)基因率先被報道[2]，之后RCAN家族其它成員的基因功能也相繼被報道，其中包括血管生成，抑制內(nèi)皮細胞的增值和遷移等[3-5]，但是RCAN2在腫瘤中的表達和應(yīng)用，先前并沒有相關(guān)報道。該實驗運用熒光定量PCR檢測Rcan2在腺瘤組織，癌旁正常組織，結(jié)直腸癌組織、增生性息肉組織、炎癥性腸病組織中的表達水平，并結(jié)合結(jié)直腸癌的臨床病理信息和體外細胞轉(zhuǎn)染等分子層面上的研究，研究該院2012年 1 月— 2017 年 1月期間收治得到80例結(jié)直腸癌發(fā)展過程中Rcan2作用以及診斷價值，現(xiàn)報道如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集該院胃腸外科手術(shù)標本，包括腺瘤40 例、炎癥性腸病20 例、增生性息肉20例、結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織80例。以上組織，一份用于RNA的提取，一份做病理檢查。病理分期參照第 7 版UICC/AJCC 結(jié)直腸癌 TNM 分期標準。結(jié)直腸癌患者：年齡30～ 90 歲，中位年齡 60 歲，男46例，女 34 例，腫瘤大小 <5 cm 39例、≥5 cm 41例； 20 例高分化、31例中分化、29例低分化； 49例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31 例。

1.2 試劑與方法

1.2.1 試劑 人結(jié)直腸癌細胞株Colo320DM購買于中國科學(xué)院、核酸提取試劑盒（生工），熒光定量PCR試劑盒（大連）。RCAN2 mRNA和 GAPDH mRNAqPCR 特異性擴增引物。MTT 細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒，Rcan2-Pcdan3.1，krasG12V-pcdna3.1

1.2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 Colo320DM細胞接種于培養(yǎng)瓶中， 10%胎牛血清，RPMI-1640培養(yǎng)基，37℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當細胞密度達到70%～80%時。將細胞接種于6孔板中，分為2組：轉(zhuǎn)染空載組；轉(zhuǎn)染krasG12V-pcdna3.1組。待細胞密度達到70%～80%時，按照試劑說明，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)進細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，取出提取mRNA。

1.2.3 MTT實驗 將兩組coloDM320細胞株，轉(zhuǎn)入空載Pcdna3.1的對照組和轉(zhuǎn)入 Rcan2-Pcdna3.1的陽性克隆組分別培養(yǎng)，按試劑說明收集細胞，將細胞接種于 96 孔板，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 8～24 h。去上清，加入新鮮培養(yǎng)基，MTT 溶液，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 4 h。之后去除 MTT，并向每孔加入結(jié)晶溶解液，將 96 孔培養(yǎng)板放入酶標儀中，在 490 nm 處檢測各孔細胞的吸光值。以時間為橫軸，吸光值為縱軸繪制細胞生長曲線。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 模板為組織cDNA，GAPDH 進行標準化。引物Rcan2基因，上游： 5'- CTGAGTCCACCCCAAGTGTC-3'，下游：5'- GGACGCCGAGTTTG GATGAT -3'； 內(nèi)參 GAPDH，上游： 5'-GTCAACGGATTT GGTCTGTATT -3'，下游： 5'-AGTCTTCTGGGTGGCAG TGAT -3'。反應(yīng)條件為： 95 ℃ 預(yù)變性 30 s，95 ℃ 變性 5 s，56℃ 退火加延伸 30 s，共 40 個循環(huán)。記錄反應(yīng)的 Ct 值。

1.3 統(tǒng)計方法

此次研究中所涉及的數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析，計數(shù)資料采用百分率（%）表示，并采用χ2檢驗，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，并采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rcan2在結(jié)直腸癌組織中高表達

為了研究Rcan2在個組織中的表達情況，該研究收集了炎癥性腸病20 例、增生性息肉20例、腺瘤40 例、結(jié)直腸癌及其癌旁正常組織80例，獲取樣本總RNA，實時熒光定量 PCR測定 Rcan2 mRNA的表達水平，根據(jù)各組均值做統(tǒng)計分析。如圖1所示，與癌旁正常組織相比，直腸癌組織中Rcan2成高表達（P<0.01）。而在炎癥性腸病、腺瘤、增生性息肉、癌旁正常組織中，Rcan2表達較低，且表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），結(jié)直腸癌組織中Rcan2mRN4表達量（2.98±0.21）明顯高于其他各組（圖1）。

2.2 RCNA2 mRNA表達量與結(jié)直腸癌標本臨床病理特征的關(guān)系

如表1 顯示，腫瘤大小與結(jié)直腸癌組織中Rcan2 mRNA表達量顯著相關(guān)（ P<0.01）。Rcan2 mRNA的表達量與年齡、性別、分化程度、淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)（P>0.05）。

2.3 Rcan2過表達抑制腫瘤細胞的增值

為了確定Rcan2對腫瘤細胞增值的影響，該研究將Rcan2-pcdna3.1，空載轉(zhuǎn)入colo320DM細胞，培養(yǎng)72 h觀察。MTT 法檢測細胞的增殖能力，如圖2所示，與空載轉(zhuǎn)染的細胞相比，Rcan2-pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細胞增長速度相對較慢，這意味著過表達Rcan2對對細胞的增殖能力起到抑制作用。Rcan2-pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細胞增長速度慢，OD值從10上升到14，而pcdna3.1轉(zhuǎn)染的細胞增長速度快，OD值從12上升到18 ，過表達kras（G12V）抑制Rcan2基因表達。Rcan2相對表達量從2.8下降到1.1。

2.4 kras突變抑制Rcan2基因表達

大約40%的結(jié)直腸癌存在kras基因的突變，為了解kras突變對Rcan2表達量的影響，該研究將krasG12V-pcdna3.1與空載pcdna3.1分別轉(zhuǎn)染colo320DM細胞。培養(yǎng)48 h，提取總RNA。熒光定量pcr檢測Rcan2 mRNA表達量。如圖4所示，與轉(zhuǎn)染krasG12V-pcdna3.1組相比，空載組Rcan2表達量更高（P<0.01），這表明突變kras抑制Rcan2基因表達。

3 討論

在中國結(jié)直腸癌作為高危癌種，大約有4%～5%的發(fā)病風(fēng)險，而大約又有1/3的結(jié)直腸癌患者死于該疾病[6]。結(jié)直腸癌發(fā)病機制復(fù)雜，目前已有相關(guān)的基因途徑被報道。譬如Wnt-APC通入， Ras-MAPK通路等[7]，mTORC1作為一個重要的蛋白激酶，也與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近期又有相關(guān)研究[8-9]報道了Rcan家族與細胞的增值相關(guān)，之后研究又報告了Rcan1在腎癌和卵巢癌中血管表達，該研究近期發(fā)現(xiàn)家族的另一個成員Rcan2在結(jié)直腸癌的腫瘤細胞中表達顯著，通過熒光定量 PCR 檢測 Rcan2mRNA在結(jié)直腸癌，增生性息肉、腺瘤、炎癥性腸病及癌旁正常組織中的表達，該研究發(fā)現(xiàn)Rcan2的表達水平在結(jié)直腸癌組織中高表達且明顯高于其他各組。這暗示Rcan2的高表達是結(jié)直腸癌的特征之一。此外，該研究又結(jié)合臨床病理分析，發(fā)現(xiàn)高表達的 Rcan2 mRNA 意味著更小體積的腫瘤，隨后的MTT的結(jié)果進一步說明了上訴的推論。這些結(jié)果表明Rcan2 抑制腫瘤的增值。endprint

西妥昔單抗和帕尼單抗作為表皮生長因子受體抗體藥物，用于治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌，EGFR作為跨膜酪氨酸激酶受體家族成員，激活RAS-Raf-MAP激酶通路，從而控制細胞的生長、分化和增殖在RAS-Raf-MAP激酶通路中KRAS突變已被報道在是抗EGFR抗體治療的一個重要的預(yù)測指標，因此了解kras的狀態(tài)與下游分子的相互關(guān)系對靶向藥物的治療尤為重要，該次研究發(fā)現(xiàn)將kras轉(zhuǎn)染結(jié)直腸癌細胞colo320DM，Rcan2的表達量下調(diào)，這是否意味著Rcan2參與了耐藥機制，或者說Rcan2可能作為潛在的治療靶點這值得進一步研究[10-11]。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，Rcan2在結(jié)直腸癌組織中呈高表達，Rcan2的高表達抑制腫瘤細胞增值，并與腫瘤大小密切相關(guān)，此外，進一步研究證實KRAS突變與Rcan2相互關(guān)系，揭示了Rcan2可能是一個潛在的治療靶點。

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（收稿日期：2017-05-08）endprint