神經生長因子對糖皮質激素誘導大鼠海馬神經元凋亡的保護作用

夏穎華 孔曉冬 雷 平 張釋雙 張明義 趙子龍 葛歆瞳

神經生長因子對糖皮質激素誘導大鼠海馬神經元凋亡的保護作用

夏穎華 孔曉冬 雷 平 張釋雙 張明義 趙子龍 葛歆瞳

目的探討神經生長因子對糖皮質激素誘導的大鼠海馬神經元凋亡的保護作用。方法體外分離原代培養(yǎng)18只新生Wister大鼠海馬神經元，噻唑藍法測定地塞米松誘導海馬神經元凋亡的最低敏感劑量，觀察不同質量濃度神經生長因子對地塞米松（0.10×10?6mol/L）誘導海馬神經元凋亡的保護作用。結果與陰性對照組相比，地塞米松Ⅰ組（10×10?6mol/L）、Ⅱ組（1×10?6mol/L）和Ⅲ組（0.10× 10?6mol/L）大鼠海馬神經元活性均降低（P=0.000，0.000，0.000）。予不同質量濃度神經生長因子后，神經生長因子0.18 ng/ml組大鼠海馬神經元活性低于陰性對照組（P=0.000）和陽性對照組（P=0.010），神經生長因子18 ng/ml組大鼠海馬神經元活性高于陽性對照組（P=0.000）和神經生長因子0.18 ng/ml組（P=0.000）。結論糖皮質激素可以誘導體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經元凋亡，地塞米松0.10×10?6mol/L是誘導海馬神經元凋亡的最低敏感劑量，神經生長因子可以拮抗地塞米松誘導的大鼠海馬神經元凋亡。

神經生長因子；糖皮質激素類；海馬；細胞凋亡；細胞，培養(yǎng)的；疾病模型，動物

This study was supported by Tianjin Research Program of Application Foundation and Advanced Technology(No.15JCYBJC50500),Science and Technology Foundation of Tianjin Health Bureau(No. 2015KZ118),and Tianjin Medical University General Hospital Youth Incubation Fund(No. ZYYFY2015034).

為適應外源性和內源性應激（如創(chuàng)傷、疾病、精神因素等），機體調節(jié)生物活動以保持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而激活下丘腦?垂體?腎上腺（HPA）軸，導致血清皮質醇水平異常，嚴重者甚至誘發(fā)危重癥相關性糖皮質激素不足（CIRCI）［1］或慢性血清皮質醇水平升高，破壞免疫穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)內環(huán)境紊亂、內臟型肥胖和胰島素抵抗等代謝性疾病［2?3］。研究顯示，高水平糖皮質激素可以引起海馬神經元突觸缺失和海馬萎縮，加重海馬齒狀回神經元凋亡，從而影響認知功能［4］。因此，如何選擇適宜的糖皮質激素劑量和使用時間，從而在有效發(fā)揮外源性糖皮質激素治療作用的同時，避免應用不合理導致的神經元不良反應，是臨床醫(yī)師一直探索的課題。神經生長因子（NGF）作為臨床應用廣泛的神經營養(yǎng)因子（NTF），業(yè)已證實在神經元存活、生長、分化和再生等方面發(fā)揮重要作用［5］。本研究旨在大鼠海馬神經元體外培養(yǎng)基礎上，采用細胞酶學分析法觀察糖皮質激素對新生大鼠海馬神經元活性的影響，以及神經生長因子對糖皮質激素誘導的海馬神經元凋亡的保護作用。

材料與方法

一、實驗材料

1.實驗動物健康清潔級24 h內新生Wistar大鼠共18只，性別不限，體重為5～7 g，均由解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生環(huán)境醫(yī)學研究所提供，每次實驗取同一窩別乳鼠6只。所有孕鼠均于萬級屏障系統(tǒng)喂以潔凈飼料，于室溫（22±3）℃、相對濕度40%～70%、12 h晝-12 h夜循環(huán)照明環(huán)境中飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

2.試劑與儀器（1）藥品與試劑：鼠神經生長因子（恩經復，規(guī)格：18 μg/支）購自廈門未名生物醫(yī)藥有限公司，地塞米松（規(guī)格：1 mg/ml）購自美國Sigma公司，SFFD培養(yǎng)液［包含DMEM培養(yǎng)基/F?12混合液（1∶1）］和N2無血清添加劑為美國Gibco公司產品，胎牛血清（FBS）由美國Hyclon公司提供，噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。（2）儀器與設備：96孔培養(yǎng)板購自丹麥Nunc公司，倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產品，二氧化碳培養(yǎng)箱由德國Binder公司提供，Zoom 2000型解剖顯微鏡購自德國Leica公司，Allegra X?15R型離心機為美國Beckman公司產品。

二、實驗方法

1.海馬神經元原代培養(yǎng)參照文獻［6?7］方法，于無菌條件下以體積分數(shù)75%乙醇溶液消毒處死新生Wistar大鼠，尖鑷子剝離腦組織置于培養(yǎng)皿中，解剖顯微鏡下分離海馬組織，完整去除血管和腦膜，以不含血清的SFFD培養(yǎng)液沖洗，充分剪碎。將含15%胎牛血清的SFFD培養(yǎng)液與剪碎的海馬組織混合加入離心管中，移液管輕輕吹吸，細胞懸液在200目濾網(wǎng)上過濾，剩余組織在200目濾網(wǎng)上研磨后過濾，收集分散的單細胞懸液，調整細胞密度至1× 106個/ml，接種至預先涂有鼠尾膠原的96孔培養(yǎng)板中，置37℃、含5%二氧化碳的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第2天全量更換含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液，以后每3天半量更換含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液，培養(yǎng)至第9天，可見海馬神經元貼壁生長。共制備3張96孔培養(yǎng)板，其中2張用于糖皮質激素誘導海馬神經元凋亡實驗，1張用于神經生長因子干預糖皮質激素誘導海馬神經元凋亡實驗。

2.糖皮質激素誘導海馬神經元凋亡（1）分組：將原代培養(yǎng)至第9天的2張96孔培養(yǎng)板中的海馬神經元隨機分為8組，每組各24孔細胞。①陰性對照組，棄原培養(yǎng)液，更換為新鮮含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液，共培養(yǎng)48 h。②地塞米松Ⅰ～Ⅶ組，棄原培養(yǎng)液，更換為含有不同濃度地塞米松（10× 10?6、1×10?6、0.10×10?6、0.01×10?6、1×10?9、0.10×10?9和0.01×10?9mol/L）的含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。（2）MTT法檢測海馬神經元活性：每孔細胞加入5 g/L MTT溶液15 μl，培養(yǎng)4 h，于離心半徑7 cm、轉速1000 r/min離心3 min，棄上清液，加入DMSO溶液150 μl振蕩溶解，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）于590 nm波長處測定吸光度值（OD值），代表海馬神經元活性。

3.神經生長因子干預糖皮質激素誘導海馬神經元凋亡（1）分組：將原代培養(yǎng)至第9天的96孔培養(yǎng)板中的海馬神經元隨機分為4組，每組各24孔細胞。①陰性對照組，棄原培養(yǎng)液，更換為新鮮含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。②陽性對照組，棄原培養(yǎng)液，更換為含有0.10×10?6mol/L地塞米松的含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。③神經生長因子0.18 ng/ml組，棄原培養(yǎng)液，更換為含有0.10×10?6mol/L地塞米松的含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液，同時加入0.10 ml神經生長因子0.18 ng/ml，共培養(yǎng)48 h。④神經生長因子18 ng/ml組，棄原培養(yǎng)液，更換為含0.10×10?6mol/L地塞米松的含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液，同時加入0.10 ml神經生長因子18 ng/ml，培養(yǎng)48 h。（2）MTT法檢測海馬神經元活性：每孔培養(yǎng)細胞加入5 g/L MTT溶液15 μl，培養(yǎng)4 h，于離心半徑7 cm、轉速1000 r/min離心3 min，棄上清液，加入DMSO溶液150 μl振蕩溶解，采用ELISA法于590 nm波長處測定OD值，代表海馬神經元活性。

三、統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。采用Levene方差齊性檢驗，計量資料以均數(shù)±采用單因素方差分析，方差齊性者組間兩兩比較行LSD?t檢驗，方差不齊者組間兩兩比較采用Tamhane's T2法。以P≤0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結果

一、糖皮質激素對大鼠海馬神經元活性的影響

不同濃度地塞米松對大鼠海馬神經元活性的影響差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），其中，地塞米松Ⅰ組（10×10?6mol/L）、Ⅱ組（1×10?6mol/L）和Ⅲ組（0.10×10?6mol/L）海馬神經元活性均低于陰性對照組（P=0.000，0.000，0.000）；而地塞米松Ⅳ～Ⅶ組海馬神經元活性與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05；表1，2），提示地塞米松0.10×10?6mol/L是誘導大鼠海馬神經元凋亡的最低敏感劑量。

表1 不同濃度地塞米松組大鼠海馬神經元活性的比較Table1.Comparisonofdifferentconcentrationsof dexamethasone on the activity of rat hippocampal neurons

表1 不同濃度地塞米松組大鼠海馬神經元活性的比較Table1.Comparisonofdifferentconcentrationsof dexamethasone on the activity of rat hippocampal neurons

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表2 不同濃度地塞米松組大鼠海馬神經元活性的兩兩比較Table 2.Paired comparison of different concentrations of dexamethasone on the activity of rat hippocampal neurons

二、神經生長因子對糖皮質激素誘導海馬神經元凋亡的保護作用

不同質量濃度神經生長因子對地塞米松0.10× 10?6mol/L誘導的大鼠海馬神經元凋亡差異有統(tǒng)計學意義（P=0.000），其中，神經生長因子0.18 ng/ml組大鼠海馬神經元活性低于陰性對照組（P=0.000）和陽性對照組（P=0.010）；神經生長因子18 ng/ml組大鼠海馬神經元活性僅高于陽性對照組（P= 0.000），而與陰性對照組差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；神經生長因子18 ng/ml組大鼠海馬神經元活性高于神經生長因子0.18 ng/ml組（P=0.000；表3，4），表明神經生長因子可以拮抗糖皮質激素誘導的海馬神經元凋亡，具有神經保護作用。

討論

糖皮質激素在應激反應、水電解質平衡和機體生長發(fā)育等諸多方面扮演重要角色，但其臨床應用一直飽受爭議。近年相繼有研究顯示，機體處于應激狀態(tài)時或予非生理水平糖皮質激素后，可持續(xù)刺激下丘腦?垂體?腎上腺軸，使靶組織對激素的敏感性改變，同時增強海馬神經元對凋亡的敏感性［4，6］。本研究結果顯示，海馬神經元暴露于濃度＞0.10× 10?6mol/L糖皮質激素后，可發(fā)生凋亡，與文獻報道相一致［4，6］。機體處于慢性應激狀態(tài)，可以刺激下丘腦?垂體?腎上腺軸，促進激素分泌增多、神經生長因子分泌減少，導致前額葉和海馬萎縮，從而出現(xiàn)抑郁癥狀［4，8?10］，最終導致向心性肥胖和代謝綜合征以及空間學習能力和記憶障礙［1?2］。當今社會隨著經濟的快速發(fā)展和生活節(jié)奏的迅速增快，精神疾病發(fā)病率升高，國民普遍處于慢性應激狀態(tài)，血清皮質醇水平升高，因此，積極探尋一種神經保護劑以拮抗糖皮質激素的負性作用、提高其有效性即顯得十分必要。

表3 不同質量濃度神經生長因子組大鼠海馬神經元活性的比較Table 3.Comparison of the activity of rat hippocampal neurons among different groups

表3 不同質量濃度神經生長因子組大鼠海馬神經元活性的比較Table 3.Comparison of the activity of rat hippocampal neurons among different groups

NGF，nerve growth factor，神經生長因子

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表4 不同質量濃度神經生長因子組大鼠海馬神經元活性的兩兩比較Table4.Pairedcomparisonoftheactivityofrat hippocampal neurons among different groups

本研究結果顯示，海馬神經元活性降低與地塞米松呈劑量依賴性，一定濃度（10×10?6、1×10?6和0.10×10?6mol/L）糖皮質激素可以誘導體外培養(yǎng)的海馬神經元凋亡，與文獻報道相一致［11?12］。本研究采用MTT法檢測海馬神經元活性，其原理是：細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶（SDH）脫氫原子后，氫原子接收劑MTT可由黃色可溶性還原為藍色不可溶性沉淀物，與神經元數(shù)目呈正相關，定量反映神經元活性和凋亡情況［13］。有文獻報道，抑郁癥模型動物予神經營養(yǎng)因子（如神經生長因子）后，可有效改善海馬萎縮［8?9］，為進一步尋找可以拮抗糖皮質激素誘導神經元凋亡的保護性措施提供理論依據(jù)。目前，臨床應用較為廣泛的是神經生長因子。神經生長因子是一種神經營養(yǎng)因子，可在腦卒中、神經損傷和阿爾茨海默?。ˋD）等神經變性病的治療中發(fā)揮促神經細胞成熟分化、血管新生以及抗炎癥反應、抗細胞凋亡和神經保護作用［14?15］。本研究采用的神經生長因子是臨床常用的粉末狀鼠神經生長因子，我們的預實驗顯示，神經生長因子1.80 ng/ml可以使神經元數(shù)目減少、脫落死亡，出現(xiàn)細胞毒性作用。研究顯示，神經生長因子50 ng/ml可以拮抗地塞米松1×10?6mol/L誘導的嗜鉻細胞瘤PC12細胞凋亡，究其原因是糖皮質激素受體激活［5］。本研究地塞米松0.10×10?6mol/L是誘導大鼠海馬神經元凋亡的最低敏感劑量，因此推測發(fā)揮有效拮抗作用的神經生長因子＞5 ng/ml，考慮到神經元較腫瘤細胞脆弱敏感，本研究采用含N2無血清添加劑的SFFD培養(yǎng)液稀釋1000倍后以終質量濃度18 ng/ml模擬高水平神經生長因子組，稀釋100 000倍后以終質量濃度0.18 ng/ml模擬低水平神經生長因子組，結果顯示，神經生長因子可以拮抗糖皮質激素誘導的海馬神經元凋亡，然而體內研究的神經生長因子起效劑量和作用方式尚待進一步的基礎與臨床研究。我們推測，在不同疾病模型和機體應激狀態(tài)下，神經生長因子起效劑量不同［6，8］，足劑量神經生長因子才會啟動神經保護機制。

神經生長因子拮抗糖皮質激素誘導的神經元凋亡作用機制，可能與糖皮質激素受體有關。糖皮質激素誘導神經元凋亡可以分為3個階段［16］：首先，是糖皮質激素受體介導的基因調節(jié)；其次，是促進與拮抗細胞凋亡因子平衡，對細胞凋亡的發(fā)生起決定性作用；最后，是內切核酸酶活性和Caspase蛋白是細胞凋亡的執(zhí)行階段［17］?；谏鲜隼碚摶A，如果在神經元凋亡程序啟動前，予以足夠劑量的神經保護劑（如神經生長因子），即可發(fā)揮拮抗糖皮質激素、阻斷神經元凋亡的作用。糖皮質激素與其受體結合，可以抑制蛋白激酶B（PKB）和細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）激活和磷酸化，阻止神經生長因子與其受體——酪氨酸激酶受體1型的結合，從而抑制神經元軸突生長［5，15，18?19］。因此推測，補充足夠劑量的神經生長因子后，神經生長因子與酪氨酸激酶受體1型充分結合，可能通過多種信號轉導通路抑制凋亡相關基因表達，阻斷凋亡級聯(lián)反應，抑制神經元凋亡，發(fā)揮促血管新生、恢復下丘腦?垂體?腎上腺軸功能的作用。

綜上所述，糖皮質激素可以誘導體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經元凋亡，其中地塞米松0.10×10?6mol/L是誘導大鼠海馬神經元凋亡的最低敏感劑量；神經生長因子可以拮抗地塞米松誘導的大鼠海馬神經元凋亡。因此，糖皮質激素聯(lián)合神經生長因子既可以達到較好的神經保護作用，又可以降低藥物劑量相關不良反應，為臨床合理用藥提供理論依據(jù)。鑒于體外研究的局限性，臨床實踐中糖皮質激素的用藥時間和安全劑量、神經生長因子的用藥時間和方式，以及如何達到理想的神經保護作用，尚待進一步深入研究。

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Protective effect of nerve growth factor on glucocorticoid?induced apoptosis of primary cultured rat hippocampal neurons

XIA Ying?hua1,KONG Xiao?dong1,LEI Ping1,ZHANG Shi?shuang1,ZHANG Ming?yi1,ZHAO Zi?long2,GE Xin?tong21Department of Geriatrics,Tianjin Medical University General Hospital;Tianjin Geriatrics Institute,Tianjin 300052,China

2Department of Neurosurgery,Tianjin Medical University General Hospital;Tianjin Neurological Institute; Tianjin Key Laboratory of Injury,Variation and Regeneration of Nervous System;Key Laboratory of Post?trauma Neuro?repair and Regeneration in Central Nervous System,Ministry of Education,Tianjin 300052, China

Corresponding author:KONG Xiao?dong(Email:xiaodongkong@163.com)

ObjectiveTo observe the protective effect of nerve growth factor(NGF)on apoptosis of primary cultured rat hippocampal neurons which were induced by glucocorticoids.MethodsThe neurons isolated from the hippocampus of 18 neonatal Wister rats were cultured in vitro.Methyl thiazolyl tetrazolium(MTT)analysis was used to detect the lowest concentration of dexamethasone?induced hippocampal neuronal apoptosis,so as to explore the protective effect of different concentrations of NGF on 0.10×10?6mol/L dexamethasone?induced hippocampal neuronal apoptosis.ResultsCompared with negative control group,the activity of rat hippocampal neurons was reduced significantly in dexamethasoneⅠ(10×10?6mol/L),Ⅱ(1×10?6mol/L)andⅢ(0.10×10?6mol/L)groups(P=0.000,0.000,0.000).After different concentrations of NGF were given,the activity of hippocampal neurons in NGF 0.18 ng/ml group was significantly lower than negative control group(P=0.000)and positive control group(P=0.010),while the activity of hippocampal neurons in NGF 18 ng/ml group was significantly higher than positive controlgroup(P=0.000)and NGF 0.18 ng/ml group(P=0.000).Conclusions Glucocorticoids can induce the apoptosis of in vitro cultured rat hippocampal neurons,and 0.10×10?6mol/L dexamethasone is the lowest sensitive dose.NGF plays a role of blocking dexamethasone?induced apoptosis.

Nerve growth factor;Glucocorticoids;Hippocampus;Apoptosis;Cells,cultured; Disease models,animal

2017?02?22）

10.3969/j.issn.1672?6731.2017.03.009

天津市應用基礎與前沿技術研究計劃項目（項目編號：15JCYBJC50500）；天津市衛(wèi)生局科技基金資助項目（項目編號：2015KZ118）；天津醫(yī)科大學總醫(yī)院青年孵育基金資助項目（項目編號：ZYYFY2015034）

300052天津醫(yī)科大學總醫(yī)院保健醫(yī)療部天津市老年病學研究所（夏穎華，孔曉冬，雷平，張釋雙，張明義）；300052天津醫(yī)科大學總醫(yī)院神經外科天津市神經病學研究所天津市神經損傷變異與再生重點實驗室教育部中樞神經系統(tǒng)創(chuàng)傷修復與再生重點實驗室（趙子龍，葛歆瞳）

孔曉冬（Email：xiaodongkong@163.com）