大豆7S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性相關(guān)性研究

李 丹，魏冬旭，賈 燁，劉春雷，江連洲

(1.寧德師范學(xué)院，福建 寧德 352100； 2.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，哈爾濱 150001；3.杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，杭州310018； 4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

大豆7S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性相關(guān)性研究

李 丹1，魏冬旭2，賈 燁3，劉春雷1，江連洲4

(1.寧德師范學(xué)院，福建 寧德 352100； 2.黑龍江出入境檢驗(yàn)檢疫局，哈爾濱 150001；3.杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，杭州310018； 4.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，哈爾濱 150030)

以具有代表性的6個(gè)大豆品種制備的大豆7S球蛋白為研究對(duì)象，采用ANS熒光探針?lè)y(cè)定表面疏水性，Ellman試劑分析法測(cè)定巰基和二硫鍵含量，激光拉曼光譜和熒光光譜分析空間構(gòu)象，探討大豆7S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性的相關(guān)性。結(jié)果表明：大豆7S球蛋白的表面疏水性與二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋含量和β-折疊含量呈負(fù)相關(guān)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)的β-轉(zhuǎn)角含量和無(wú)規(guī)則卷曲含量呈正相關(guān)；與色氨酸殘基熒光峰λmax呈正相關(guān)，與拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1 360/I1 340值呈負(fù)相關(guān)，與拉曼光譜酪氨酸費(fèi)米共振I850/I830值呈正相關(guān)，與暴露的酪氨酸殘基克分子數(shù)呈正相關(guān)，與N暴露和N包埋的比值呈正相關(guān)；與暴露巰基含量、巰基暴露程度呈正相關(guān)，與游離巰基含量、二硫鍵含量、二硫鍵構(gòu)象的相關(guān)性均不顯著。

大豆7S球蛋白；拉曼光譜；熒光光譜；巰基；二硫鍵；表面疏水性

蛋白質(zhì)的表面疏水性是由于部分疏水基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)表面引起的，是衡量分子間相互作用強(qiáng)弱的重要參數(shù)。與整體疏水性相比，表面疏水性對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響更大。研究表明，蛋白質(zhì)的表面疏水性與其結(jié)構(gòu)特性密切相關(guān)，大豆蛋白的結(jié)構(gòu)特性又隨大豆品種和產(chǎn)地的不同而有所差異[1-3]。本研究為避免大豆蛋白7S組分與11S組分的協(xié)同作用對(duì)表面疏水性的影響，故選擇6個(gè)我國(guó)具有區(qū)域代表性的大豆品種，以其制備的7S球蛋白純品為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)表面疏水性、巰基基團(tuán)組成及蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的分析，研究大豆7S球蛋白結(jié)構(gòu)特性與表面疏水性的關(guān)系。明確大豆7S球蛋白表面疏水性與蛋白質(zhì)組成及空間構(gòu)象的構(gòu)效關(guān)系，有助于更好地理解和預(yù)測(cè)大豆蛋白的功能性質(zhì)，為今后開(kāi)發(fā)大豆分離蛋白特定功能性產(chǎn)品而進(jìn)行的分子設(shè)計(jì)和重組提供重要的理論參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆7S球蛋白，實(shí)驗(yàn)室自制，分別來(lái)自于東農(nóng)42、黑農(nóng)46、合豐55、冀豆12、皖豆28、福豆234大豆品種，純度均在90%以上[4]。

1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)、Na2EDTA、5,5′-二硫雙-2-硝基苯甲酸(DTNB)、甘氨酸、三羥甲基氨基甲烷(Tris)均為Sigma公司，β-巰基乙醇為國(guó)產(chǎn)優(yōu)級(jí)純，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Allegra64R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；F-4500熒光分光光度計(jì)，日本HITACHI公司；PerkinElmer Raman Station 400拉曼光譜儀，美國(guó)PE公司；722型可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 表面疏水性測(cè)定

采用ANS熒光探針?lè)╗5-6]。

1.2.2 巰基和二硫鍵含量測(cè)定

采用Ellman試劑分析方法，即DTNB比色法[7]。

1.2.3 拉曼光譜(Raman)分析

參考張萍等[8]的方法。將樣品粉末均勻平鋪于潔凈干燥的載玻片上，采用785 nm的激發(fā)光波長(zhǎng)、300 mW的激光功率，對(duì)400～2 000 cm-1范圍進(jìn)行掃描，每次掃描60 s，積分10次，4次掃描進(jìn)行累加。拉曼光譜譜圖的基線校正及譜峰歸屬的查找采用ACD Labs V12軟件進(jìn)行。同時(shí)，以苯丙氨酸譜峰(1 003 cm-1±1 cm-1)強(qiáng)度作為歸一化因子，采用Origin8.0軟件繪制不同品種大豆7S球蛋白拉曼光譜。

1.2.4 熒光光譜分析

參考王中江等[9]的方法。樣品用磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.6)配制，蛋白質(zhì)溶液質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL。為降低酪氨酸殘基干擾，熒光發(fā)射光譜分析采用290 nm的激發(fā)光波長(zhǎng)，掃描范圍300～400 nm，激發(fā)狹縫寬5 nm，發(fā)射狹縫寬5 nm。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

單項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析包括單因素方差分析和相關(guān)性分析，均采用SPSS V18.0軟件，方差分析差異性顯著(P<0.05)時(shí)采用Duncan方法進(jìn)行多重比較。圖譜的分析處理和圖表的制作采用Origin8.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 表面疏水性分析(見(jiàn)圖1)

圖1 不同品種大豆7S球蛋白的表面疏水性

由圖1可知，品種差異對(duì)大豆7S球蛋白的表面疏水性影響極顯著(P<0.01)，表面疏水性指數(shù)在707.14～868.54之間，合豐55(868.54)>福豆234(832.51)>黑農(nóng)46(816.98)>冀豆12(749.06)>皖豆28(729.02)>東農(nóng)42(707.14)。這可能與不同品種大豆7S球蛋白的結(jié)構(gòu)特性差異有關(guān)。

2.2 拉曼光譜分析

采用激光拉曼光譜對(duì)大豆7S球蛋白的主鏈構(gòu)象、酪氨酸和色氨酸側(cè)鏈構(gòu)象及其微環(huán)境情況、二硫鍵構(gòu)象進(jìn)行分析，不同品種大豆7S球蛋白的拉曼光譜如圖2所示，不同品種大豆7S球蛋白的拉曼光譜及特征頻率歸屬見(jiàn)表1。

圖2 不同品種大豆7S球蛋白的拉曼光譜

峰位歸屬特征峰位/cm-1東農(nóng)42黑農(nóng)46合豐55冀豆12皖豆28福豆234二硫鍵506507512507510508二硫鍵525525525526525524二硫鍵539536542540539540酪氨酸829834830830834830酪氨酸848846852852846852苯丙氨酸100210041004100310031003色氨酸133913411340133613401342色氨酸135813611360136213581362酰胺I帶(β-轉(zhuǎn)角)1641- 1642164216441644酰胺I帶(α-螺旋)164616461647164816491649酰胺I帶(α-螺旋)165016521654165616541654酰胺I帶(無(wú)規(guī)則卷曲)166316601661166416641663酰胺I帶(β-折疊)1669166616691669- 1670酰胺I帶(β-折疊)167316721671167516721674酰胺I帶(β-折疊)16801679167716791680- 酰胺I帶(β-轉(zhuǎn)角)168916891688168916871686

2.3 主鏈構(gòu)象與表面疏水性關(guān)系

表2 不同品種大豆7S球蛋白的拉曼光譜酰胺I帶擬合結(jié)果 %

注：表中同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)字母表示不同樣品P<0.01水平的差異顯著性，字母相同表示差異不顯著，字母不同表示差異極顯著。

由表2可知，品種差異對(duì)大豆7S球蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)4種類型α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲的含量影響極顯著(P<0.01)。相關(guān)性分析表明：大豆7S球蛋白的表面疏水性與α-螺旋含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.012)，相關(guān)性系數(shù)為-0.910；與β-折疊含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.015)，相關(guān)性系數(shù)為-0.898；與β-轉(zhuǎn)角含量呈顯著正相關(guān)(P=0.030)，相關(guān)性系數(shù)為0.855；與無(wú)規(guī)則卷曲含量呈顯著(P=0.018)正相關(guān)，相關(guān)性系數(shù)為0.889。分析其原因可能與α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲自身結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，以及它們對(duì)大豆7S球蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)形成的影響有關(guān)。

2.4 側(cè)鏈芳香氨基酸殘基微環(huán)境與表面疏水性關(guān)系

2.4.1 拉曼光譜酪氨酸費(fèi)米共振分析結(jié)果

蛋白質(zhì)拉曼光譜的830 cm-1和850 cm-1譜峰是酪氨酸殘基的對(duì)位取代苯的有關(guān)振動(dòng)，可用兩譜峰的強(qiáng)度比I850/I830來(lái)表征酪氨酸殘基的包埋與暴露情況。當(dāng)I850/I830的值在0.5～1.25之間時(shí)，可根據(jù)方程式(0.5N包埋+1.25N暴露=I850/I830，N包埋+N暴露=1)計(jì)算包埋在分子內(nèi)部和暴露在分子表面的酪氨酸殘基的克分子數(shù)N[15]。 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同品種大豆7S球蛋白的I850/I830及酪氨酸殘基分析結(jié)果

由表3可知，6個(gè)品種大豆7S球蛋白的酪氨酸殘基均較多暴露于分子表面，且品種差異對(duì)暴露程度影響顯著。相關(guān)性分析表明：大豆7S球蛋白的表面疏水性與拉曼光譜酪氨酸費(fèi)米共振I850/I830的值呈顯著正相關(guān)(P=0.020)，相關(guān)性系數(shù)為0.883；與暴露的酪氨酸殘基克分子數(shù)呈顯著正相關(guān)(P=0.019)，相關(guān)性系數(shù)為0.886；與N暴露和N包埋的比值呈顯著正相關(guān)(P=0.017)，相關(guān)性系數(shù)為0.891。說(shuō)明酪氨酸殘基暴露于分子表面的數(shù)量越多，大豆7S球蛋白的表面疏水性越高。可見(jiàn)，大豆7S球蛋白的表面疏水性與酪氨酸殘基暴露程度密切相關(guān)。

2.4.2 拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振分析結(jié)果

蛋白質(zhì)拉曼光譜的1 360 cm-1和1 340 cm-1附近的色氨酸雙線是環(huán)境疏水性的標(biāo)志，吲哚環(huán)的親脂反應(yīng)會(huì)使1 340 cm-1附近的譜峰減弱，而使1 360 cm-1附近的譜峰增強(qiáng)，可用拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1 360/I1 340的值來(lái)反映色氨酸殘基微環(huán)境的情況[16]。結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，6個(gè)品種大豆7S球蛋白的拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1 360/I1 340的值差異較大，說(shuō)明品種差異對(duì)大豆7S球蛋白的色氨酸殘基微環(huán)境影響較大。相關(guān)性分析表明：大豆7S球蛋白的表面疏水性與拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1 360/I1 340的值呈顯著負(fù)相關(guān)(P=0.014)，相關(guān)性系數(shù)為-0.902。說(shuō)明拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1 360/I1 340的值越大，色氨酸吲哚環(huán)與環(huán)境中的脂肪類基團(tuán)之間的親脂反應(yīng)越強(qiáng)，表示色氨酸所處微環(huán)境的極性越弱，即色氨酸殘基的暴露程度越小，暴露數(shù)量越少，其表面疏水性越低?？梢?jiàn)，大豆7S球蛋白的表面疏水性與色氨酸殘基的暴露情況密切相關(guān)。

圖3 不同品種大豆7S球蛋白的拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1 360/I1 340

2.4.3 熒光光譜分析結(jié)果

由于酪氨酸殘基的熒光熄滅及色氨酸殘基的熒光增加，大豆7S球蛋白的熒光發(fā)射光譜實(shí)際上是色氨酸殘基的熒光光譜。不同品種大豆7S球蛋白的熒光光譜見(jiàn)圖4。

圖4 不同品種大豆7S球蛋白的熒光光譜

由圖4可知，6個(gè)品種大豆7S球蛋白的λmax分布在327.60～340.60 nm。皖豆28、東農(nóng)42的λmax小于330 nm，其余品種的λmax大于330 nm，說(shuō)明皖豆28和東農(nóng)42的色氨酸殘基位于蛋白質(zhì)分子內(nèi)部非極性環(huán)境中，其余品種的色氨酸殘基暴露于分子外部極性環(huán)境中[17]。6個(gè)品種大豆7S球蛋白的色氨酸殘基微環(huán)境極性，即色氨酸殘基暴露程度為合豐55>福豆234>黑農(nóng)46>冀豆12>皖豆28>東農(nóng)42。相關(guān)性分析表明：大豆7S球蛋白的表面疏水性與色氨酸殘基熒光峰λmax呈極顯著正相關(guān)(r=0.987，P=0.000)。說(shuō)明λmax越大，色氨酸殘基微環(huán)境極性越強(qiáng)，即色氨酸殘基暴露程度越大，其表面疏水性越高。

拉曼光譜和熒光光譜的分析結(jié)果一致表明：疏水性氨基酸殘基暴露程度越大，暴露數(shù)量越多，大豆7S球蛋白的表面疏水性越大?？梢?jiàn)，疏水性基團(tuán)的暴露程度是決定其表面疏水性強(qiáng)弱的主要原因，而不同品種的大豆7S球蛋白疏水性基團(tuán)暴露程度的差異，正是由于其氨基酸組成、亞基組成和空間構(gòu)象等結(jié)構(gòu)特性的不同而導(dǎo)致的。

2.5 巰基基團(tuán)組成與表面疏水性關(guān)系

2.5.1 巰基和二硫鍵含量與表面疏水性關(guān)系(見(jiàn)圖5)

圖5 不同品種大豆7S球蛋白的巰基基團(tuán)含量

由圖5可知，6個(gè)品種大豆7S球蛋白的巰基基團(tuán)主要以二硫鍵的形式存在，以游離巰基形式存在的巰基基團(tuán)一部分包埋在蛋白質(zhì)疏水基團(tuán)內(nèi)部，一部分暴露于蛋白質(zhì)分子表面(即暴露巰基)。并且，品種差異對(duì)大豆7S球蛋白的暴露巰基含量、游離巰基含量和二硫鍵含量的影響極顯著(P<0.01)。相關(guān)性分析表明：大豆7S球蛋白的表面疏水性與游離巰基含量相關(guān)性不顯著(P=0.053)，與二硫鍵含量相關(guān)性也不顯著(P=0.746)。

2.5.2 巰基暴露程度與表面疏水性關(guān)系

由于不同品種大豆7S球蛋白的游離巰基含量存在極顯著差異，因此只考慮暴露巰基含量對(duì)表面疏水性的影響還不夠嚴(yán)謹(jǐn)，巰基的暴露程度(即暴露巰基含量占游離巰基含量的百分比)可能更能說(shuō)明問(wèn)題。相關(guān)性分析表明：大豆7S球蛋白的表面疏水性與暴露巰基含量呈顯著正相關(guān)(P=0.026)，相關(guān)性系數(shù)為0.866；與巰基暴露程度呈顯著正相關(guān)(P=0.031)，相關(guān)性系數(shù)為0.851。分析其原因：大豆7S球蛋白的巰基暴露程度越大，說(shuō)明其結(jié)構(gòu)越伸展，疏水性基團(tuán)暴露于蛋白質(zhì)表面的概率越大，其表面疏水性越高。

2.5.3 二硫鍵構(gòu)象與表面疏水性關(guān)系

蛋白質(zhì)拉曼光譜500～550 cm-1是二硫鍵伸縮振動(dòng)的特征頻率。兩個(gè)半胱氨酸形成的二硫橋結(jié)構(gòu)單元(C—C—S—S—C—C)有3種構(gòu)型，通常將510 cm-1附近譜峰歸屬為g-g-g構(gòu)型，即扭曲-扭曲-扭曲構(gòu)型；525 cm-1附近譜峰歸屬為g-g-t構(gòu)型，即扭曲-扭曲-反式構(gòu)型；540 cm-1附近譜峰歸屬為t-g-t構(gòu)型，即反式-扭曲-反式構(gòu)型[16]。不同品種大豆7S球蛋白的二硫鍵構(gòu)象分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同品種大豆7S球蛋白的二硫鍵構(gòu)象分析結(jié)果

由表4可知，不同品種大豆7S球蛋白的二硫鍵構(gòu)型模式不同，差別較大，說(shuō)明品種差異對(duì)大豆7S球蛋白的二硫鍵構(gòu)象影響較大。相關(guān)性分析表明：大豆7S球蛋白的表面疏水性與二硫鍵g-g-g構(gòu)型模式含量相關(guān)性不顯著(P=0.780)，與g-g-t構(gòu)型模式含量相關(guān)性不顯著(P=0.891)，與t-g-t構(gòu)型模式含量相關(guān)性也不顯著(P=0.970)。

以上分析結(jié)果表明，大豆7S球蛋白的表面疏水性與其巰基和二硫鍵含量相關(guān)性不顯著，與巰基暴露程度顯著正相關(guān)，與二硫鍵構(gòu)象相關(guān)性不顯著。

3 結(jié) 論

(1)大豆7S球蛋白的表面疏水性與其主鏈構(gòu)象α-螺旋含量的相關(guān)性系數(shù)為-0.910，與β-折疊含量的相關(guān)性系數(shù)為-0.898，與β-轉(zhuǎn)角含量的相關(guān)性系數(shù)為0.855，與無(wú)規(guī)則卷曲含量的相關(guān)性系數(shù)為0.889。

(2)疏水性氨基酸殘基的暴露程度越大，大豆7S球蛋白的表面疏水性越高，其與拉曼光譜酪氨酸費(fèi)米共振I850/I830值的相關(guān)性系數(shù)為0.883，與暴露的酪氨酸殘基克分子數(shù)的相關(guān)性系數(shù)為0.886，與N暴露和N包埋的比值的相關(guān)性系數(shù)為0.891，與拉曼光譜色氨酸費(fèi)米共振I1 360/I1 340值的相關(guān)性系數(shù)為-0.902，與熒光光譜色氨酸殘基熒光峰λmax的相關(guān)性系數(shù)為0.987。

(3)巰基暴露程度越大，大豆7S球蛋白的表面疏水性越強(qiáng)，其與暴露巰基含量的相關(guān)性系數(shù)為0.866，與巰基暴露程度的相關(guān)性系數(shù)為0.851，而與游離巰基含量、二硫鍵含量、二硫鍵構(gòu)象的相關(guān)性均不顯著。

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Correlation between structure characteristics and surface hydrophobicity ofβ-conglycinin(7S)

LI Dan1, WEI Dongxu2, JIA Ye3, LIU Chunlei1, JIANG Lianzhou4

(1.Ningde Normal University, Ningde 352100, Fujian,China; 2.Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China; 3. Hangzhou Wahaha Group Co., Ltd., Hangzhou 310018, Chian; 4.College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

Withβ-conglycinin (7S) prepared from six representative soybean varieties as raw material, the correlation between the structure characteristics and surface hydrophobicity of 7S was studied. The surface hydrophobicity of 7S was determined by ANS fluorescent probe method, the content of sulfhydryl and disulfide bond was determined by Ellman reagent analysis method, and conformation was analyzed by Raman spectroscopy and fluorescence spectroscopy. The results showed that there were negative correlations between surface hydrophobicity and the content ofα-helix,β-sheet and Fermi resonance Raman spectra of tryptophanI1 360/I1 340ratio. There were positive correlations between surface hydrophobicity andβ-turn, random coil,λmaxof tryptophan residues, Fermi resonance Raman spectra of tryptophanI850/I830ratio, the number of exposed tyrosine residues, the value ofNexposure∶Nembeddingand the content and degree of exposed sulfhydryl. There was not correlation between the surface hydrophobicity and the content of free sulfhydryl, the content of disulfide bond and disulfide bond conformation.

β-conglycinin(7S); Raman spectroscopy；fluorescence spectroscopy；sulfhydryl; disulfide bond；surface hydrophobicity

2016-10-09;

2017-01-17

國(guó)家863高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013AA102104)；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31071493)；寧德師范學(xué)院服務(wù)閩東項(xiàng)目(2012H314)；寧德師范學(xué)院6.18項(xiàng)目(2012H213)

李 丹(1983)，女，講師，博士，研究方向?yàn)榧Z食、油脂及植物蛋白工程(E-mail)116127847@qq.com。

江連洲，教授，博士生導(dǎo)師(E-mail)501342131@qq.com。

TS201.2;TQ937

A

1003-7969(2017)04-0093-06