醇洗法提取杜仲籽仁粕中桃葉珊瑚苷及制取濃縮蛋白

劉玉蘭，焦惠麗，李 驍

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州450001)

油料蛋白

醇洗法提取杜仲籽仁粕中桃葉珊瑚苷及制取濃縮蛋白

劉玉蘭，焦惠麗，李 驍

(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，鄭州450001)

以杜仲籽仁粕為原料，利用醇洗工藝提取桃葉珊瑚苷同時制備濃縮蛋白，并采用高效液相色譜法(HPLC-UV)檢測杜仲籽仁及其粕、濃縮蛋白中桃葉珊瑚苷含量。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地杜仲籽仁及其粕中桃葉珊瑚苷含量分別為6.86%～15.44%、5.25%～16.60%。利用含水乙醇對杜仲籽仁粕進(jìn)行醇洗時，濃縮蛋白和提取液均會變黑，且基本檢測不出桃葉珊瑚苷。只有用無水乙醇作為醇洗溶劑時，才能得到乳白色的濃縮蛋白和富含桃葉珊瑚苷的提取液，此時濃縮蛋白的蛋白質(zhì)含量達(dá)到51.78%，較杜仲籽仁粕中提高16.54個百分點(diǎn)。以無水乙醇為溶劑提取杜仲籽仁粕中的桃葉珊瑚苷，最佳提取條件為提取溫度80℃、提取時間20 min、液料比8∶1、提取次數(shù)2次。在最佳提取條件下，桃葉珊瑚苷的提取率達(dá)到94.82%。

杜仲籽；杜仲籽仁粕；桃葉珊瑚苷；醇洗；濃縮蛋白

杜仲，落葉喬木，是我國特有的單科植物?！渡褶r(nóng)百草經(jīng)》和《本草綱目》中記載，杜仲的干燥樹皮是我國特有的名貴滋補(bǔ)藥材，它具有強(qiáng)筋健骨和防止衰老的功效。杜仲翅果油脂含量為13.53%～16.36%，杜仲翅果由籽仁和果殼組成，籽仁油脂含量為27.70%～31.84%[1-2]。杜仲籽油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%，其中α-亞麻酸占脂肪酸總量的60%以上，是一種優(yōu)質(zhì)食用油[3]。衛(wèi)生部2009年12號公告將杜仲籽油確定為新資源食品。杜仲籽仁除了富含油脂，還含有較為豐富的蛋白質(zhì)及必需氨基酸[4]，以及多種次生代謝產(chǎn)物，主要有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、苯丙烷類、多糖、酚類、三萜類、甾類、有機(jī)酸、氨基酸、微量元素等[5]。其中桃葉珊瑚苷(aucubin，AU)是杜仲籽仁中含量最高的一種環(huán)烯醚萜類活性成分。在已報(bào)道含有AU的植物中，杜仲籽仁中AU的含量最高，達(dá)8%～11%[6]。AU又名珊瑚木苷，化學(xué)名為β-D-吡喃葡萄糖苷，易溶于水、甲醇、乙醇，幾乎不溶于親脂性有機(jī)溶劑(乙醚、氯仿、苯及石油醚)[7]。AU具有抗炎消腫鎮(zhèn)痛、抗氧化、抗衰老、利尿、抗骨質(zhì)疏松、促進(jìn)干細(xì)胞再生、抗腫瘤、保護(hù)肝臟的作用[8-9]。有不少以AU為主要藥性成分的藥品和洗化用品，包括含有AU成分的染發(fā)劑，因?yàn)锳U能與氨基酸反應(yīng)生成棕黑色到黑色的樹脂狀聚合物沉淀，這種沉淀與發(fā)纖維附著性強(qiáng)，且色澤自然，對皮膚無刺激[10]。

AU含量測定方法有硫酸銅-分光光度法、薄層色譜分離-分光光度法、對二甲氨基苯甲醛法、高效液相色譜法等[11-12]。其中高效液相色譜法的分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高。本課題采用高效液相色譜法(HPLC-UV)進(jìn)行樣品中AU含量測定，以杜仲籽仁粕為原料，研究醇洗法制取濃縮蛋白同時得到富集AU提取液的方法和工藝條件，濃縮蛋白可以作為食用，富集AU提取液可以作為提純AU產(chǎn)品的優(yōu)良原料。本課題研究結(jié)果旨在為杜仲籽制油綜合加工和資源高效利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

3個產(chǎn)地杜仲翅果原料樣品，其中樣品1產(chǎn)地為陜西省略陽縣，樣品2產(chǎn)地為河南省靈寶市，樣品3產(chǎn)地為貴州省遵義市。

95%乙醇、無水乙醇、甲醇、甲酸、硫酸銅、硫酸鉀、硫酸、硼酸、氫氧化鈉、甲基紅、溴甲酚綠：分析純；甲醇：色譜純；AU標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥99.0%，Sigma公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec 8100凱氏定氮儀，丹麥Foss公司；e2695高效液相色譜儀(配2489紫外檢測器)，美國Waters公司；RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器；LD5-10型低速離心機(jī)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC-UV檢測樣品中AU含量[13]

液相色譜條件：Waters symmetryC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)； 流動相為乙腈-水(體積比5∶95)；檢測波長206 nm；柱溫30℃；流速0.6 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：精確稱取AU標(biāo)準(zhǔn)品25 mg于25 mL的棕色容量瓶中，用甲醇溶解，定容，得到質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的AU標(biāo)準(zhǔn)母液。用甲醇對母液逐級稀釋，得到15.625、31.25、62.5、125、250、500 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后進(jìn)入液相色譜檢測。

樣品的前處理：6 mL甲醇(40%)溶解適量杜仲籽仁或濃縮蛋白樣品，超聲2 min，提取3次。

1.2.2 杜仲籽仁及濃縮蛋白主要組分測定

水分測定參照GB/T 5497—1985；粗脂肪測定參照GB/T 5512—2008；粗蛋白質(zhì)測定參照GB/T 14489.2—2008。

1.2.3 AU的提取及醇洗濃縮蛋白制取

杜仲籽仁粕的制取：杜仲翅果經(jīng)手工剝殼取籽仁，籽仁經(jīng)粉碎后用石油醚在40℃條件下進(jìn)行浸出取油，脫脂后的粕經(jīng)真空干燥脫溶，用高速粉碎機(jī)粉碎，過80目篩，篩下物置于黑色自封袋內(nèi)，放入4℃的冰箱中保存，備用。

AU的提取及醇洗濃縮蛋白制取[14]：稱取一定量的杜仲籽仁粕，在設(shè)定的提取溫度、提取時間、液料比、提取次數(shù)條件下進(jìn)行攪拌萃取，然后抽濾得到固形物及萃取液。固形物在潔凈的培養(yǎng)皿中進(jìn)行真空干燥，得到杜仲濃縮蛋白，測定其蛋白質(zhì)含量和AU含量，同時測定提取液中AU含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 AU含量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率和重復(fù)性

采用HPLC-UV檢測AU含量，所得AU的質(zhì)量濃度(X)與峰面積(Y)具有良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：Y=7 044.967 4X-4 843.385 8，R2=0.999 9。線性范圍為15.625～500 mg/L。對該方法進(jìn)行加標(biāo)回收和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明：該方法回收率在85.34%～99.09%之間，RSD在0.95%～1.78%之間，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD在1.60%～4.36%之間，具有較好準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

2.2 杜仲籽仁與其粕中主要組分及AU含量

對3個產(chǎn)地的杜仲籽仁和粕中主要組分及AU含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表1。從表1可以看出，不同產(chǎn)地杜仲籽仁中粗脂肪含量和AU含量均有差別，其中陜西略陽縣籽仁中AU含量(6.86%)明顯低于河南靈寶市和貴州遵義市籽仁AU含量(14.41%、15.44%)，這可能與原料產(chǎn)地有關(guān)，也可能與原料采收年份有關(guān)(陜西略陽縣杜仲翅果產(chǎn)于2013年，河南靈寶市和貴州遵義市的產(chǎn)于2014年)。而粕中AU含量(5.25%～16.60%)與籽仁中含量有關(guān)。

表1 不同產(chǎn)地杜仲籽仁與其粕中主要組分及AU含量 %

注：以干基表示；“-”表示含量小于1%；蛋白質(zhì)與氮的換算系數(shù)以6.25計(jì)。

2.3 醇洗濃縮蛋白制取及AU提取條件確定

2.3.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對醇洗濃縮蛋白制取及AU提取效果的影響

以樣品3杜仲籽仁粕為原料，采用醇洗工藝制取濃縮蛋白。液料比10∶1，提取溫度50℃，提取時間60 min，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對濃縮蛋白產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量、AU含量和提取液中AU含量的影響，結(jié)果見表2。

表2 醇洗濃縮蛋白的蛋白質(zhì)含量和AU含量

注：“ND”表示未檢出。

從表2可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時，濃縮蛋白產(chǎn)品中蛋白質(zhì)含量最高(62.88%)。但實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，將體積分?jǐn)?shù)為50%～90%的乙醇溶液與乳白色的粕粉混合于燒杯中進(jìn)行萃取時，5 min后乳白色的溶液逐漸變綠，20 min后溶液變?yōu)樯罹G色，最終變?yōu)槟G色。用抽濾法將提取液與濃縮蛋白進(jìn)行分離時，發(fā)現(xiàn)兩者分離緩慢，分離出的提取液為黑色，濃縮蛋白經(jīng)真空干燥后為黑色。乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%～80%時，濃縮蛋白和提取液中均未檢出AU，脫除溶劑后的濃縮蛋白的顏色由褐色逐漸過渡到黑色。乙醇體積分?jǐn)?shù)為90%時，提取液中同樣未檢出AU，濃縮蛋白的顏色為草綠色，檢測AU含量為0.94%。

與上述情況明顯不同的是，當(dāng)提取溶劑為無水乙醇時，提取液為黃色，濃縮蛋白與籽仁、粕的顏色一致，均為乳白色。檢測到提取液中AU含量為1.41 g/100 mL，濃縮蛋白中AU含量為2.32%。從上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，用含水乙醇對杜仲籽仁粕進(jìn)行醇洗時，AU會損失或轉(zhuǎn)化。推測原因可能是杜仲蛋白容易被水解為氨基酸，而AU能與氨基酸反應(yīng)生成棕黑色至黑色的樹脂狀聚合物[10]。據(jù)此，利用杜仲籽仁、餅或粕進(jìn)行醇洗濃縮蛋白制取及AU提取時，選用無水乙醇最合理。

2.3.2 提取溫度對AU提取效果的影響

選用無水乙醇為提取溶劑，選取液料比為4∶1，提取時間30 min，提取1次，考察不同提取溫度對AU提取效果的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 提取溫度對AU提取率的影響

從圖1可以看出，提取溫度在20～80℃時，AU提取率持續(xù)升高，80℃時提取率達(dá)到最大(81.50%)，從80℃升溫到100℃時，AU提取率有所下降。這表明無水乙醇在微沸狀態(tài)下對AU的溶解能力最好。因此，選取提取溫度80℃為宜。

2.3.3 提取時間對AU提取效果的影響

以無水乙醇為提取溶劑，選取液料比4∶1，提取溫度80℃，提取1次，考察不同提取時間對AU提取效果的影響，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，提取時間由10 min延長至20 min，AU提取率明顯提高，20 min時提取率達(dá)到最大(88.61%)。再延長提取時間，AU提取率逐漸下降，這可能是由于AU具有烯醇式的縮醛結(jié)構(gòu)，提取時間過長會使其氧化的緣故[9]。因此，選取提取時間20 min為宜。

圖2 提取時間對AU提取率的影響

2.3.4 液料比對AU提取效果的影響

以無水乙醇為提取溶劑，選取提取溫度80℃，提取時間20 min，提取1次，考察不同液料比對AU提取效果的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對AU提取率的影響

從圖3可以看出，隨著液料比的增加，AU提取率不斷增加。當(dāng)液料比達(dá)到8∶1時，提取率達(dá)到93.20%，再增加液料比，AU提取率基本不變。因此，選取液料比8∶1為宜。

2.3.5 提取次數(shù)對AU提取效果的影響

以無水乙醇為提取溶劑，選取提取溫度80℃，提取時間20 min，液料比8∶1，考察提取次數(shù)對AU提取效果的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取次數(shù)對AU提取率的影響

從圖4可以看出，提取2次時，AU提取率已達(dá)到94.82%，再增加提取次數(shù)，提取率增幅已很小?？紤]到溶劑用量的經(jīng)濟(jì)性，選取提取次數(shù)2次為宜。

綜上，以無水乙醇為提取溶劑，采用提取溫度80℃、提取時間20 min、液料比8∶1、提取2次的工藝條件，杜仲籽仁粕中AU提取率達(dá)到94.82%。

3 結(jié) 論

采用高效液相色譜法(HPLC-UV)檢測杜仲籽及其粕和濃縮蛋白中桃葉珊瑚苷含量，方法回收率在85.34%～99.09%之間，RSD在0.95%～1.78%之間，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)RSD在1.60%～4.36%之間，具有較好準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

不同產(chǎn)地的杜仲籽仁及其粕中桃葉珊瑚苷含量為6.86%～15.44%、5.25%～16.60%。利用含水乙醇對杜仲籽仁粕進(jìn)行提取時，濃縮蛋白和提取液均會變黑，且基本檢測不出桃葉珊瑚苷。只有用無水乙醇為提取溶劑時，才能得到乳白色的濃縮蛋白和富含桃葉珊瑚苷的提取液，此時濃縮蛋白中蛋白質(zhì)含量達(dá)到51.78%，較杜仲籽仁粕中提高16.54個百分點(diǎn)。以無水乙醇為溶劑對杜仲籽仁粕進(jìn)行桃葉珊瑚苷提取，最佳提取條件為提取溫度80℃、提取時間20 min、液料比8∶1、提取次數(shù)2次。在最佳提取條件下，桃葉珊瑚苷提取率可達(dá)到94.82%。

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Preparation of aucubin and protein concentrate from eucommia seed kernel meal by alcohol leaching method

LIU Yulan, JIAO Huili, LI Xiao

(College of Food Science and Technology, Henan University of Technology, Zhengzhou 450001, China)

With eucommia seed kernel meal as raw material, aucubin and protein concentrate were prepared from eucommia seed kernel meal by alcohol leaching method. The aucubin contents in eucommia seed kernel, meal and protein concentrate were determined by HPLC-UV. The results showed that the aucubin contents in emucommia seed kernel and its meal from different areas were 6.86%-15.44% and 5.25%-16.60% respectively. The protein concentrate and the extract were black and the aucubin could not be detected when the extraction solvent was hydrous ethanol. Only with anhydrous ethanol as extraction solvent, the milky white protein concentrate could be obtained and the extract was rich in aucubin. And the content of protein in protein concentrate was 51.78%, which increased by 16.54 percentage points than eucommia seed kernel meal. The aucubin in the meal was extracted by anhydrous ethanol, and the optimal extraction conditions were obtained as follows: extraction temperature 80℃, extraction time 20 min, ratio of liquid to material 8∶1, extraction times twice. Under these conditions, the extraction rate of aucubin reached 94.82%.Key words：eucommia seed kernel; eucommia seed kernel meal; aucubin; alcohol leaching; protein concentrate

2016-08-08

劉玉蘭(1957)，女，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹参镉土腺Y源高效利用與品質(zhì)安全(E-mail)liuyl7446@163.com。

TS229;TQ936.2

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1003-7969(2017)04-0089-04