酵母菌發(fā)酵啤酒生產(chǎn)廢水產(chǎn)微生物油脂和菌體蛋白的研究

王冬梅 ,郭書(shū)賢 ,梁躍輝 ,劉 歡 ,張艷平

(1.南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,河南 南陽(yáng) 473000； 2.南陽(yáng)市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽(yáng) 473000；3.車(chē)用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 南陽(yáng) 473000； 4.海南大學(xué)食品學(xué)院,海口 570100)

生物工程

酵母菌發(fā)酵啤酒生產(chǎn)廢水產(chǎn)微生物油脂和菌體蛋白的研究

王冬梅1,2,郭書(shū)賢1,2,梁躍輝1,劉 歡3,張艷平4

(1.南陽(yáng)理工學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,河南 南陽(yáng) 473000； 2.南陽(yáng)市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 南陽(yáng) 473000；3.車(chē)用生物燃料技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 河南 南陽(yáng) 473000； 4.海南大學(xué)食品學(xué)院,海口 570100)

為探索啤酒生產(chǎn)廢水綜合利用的方法和途徑，采用液體發(fā)酵的方法，從7個(gè)酵母菌株中篩選出既能產(chǎn)微生物油脂和菌體蛋白，又能有效降解COD的菌株。考察了優(yōu)良酵母菌株的發(fā)酵周期，并對(duì)其所產(chǎn)油脂的脂肪酸組成和菌體蛋白的氨基酸組成進(jìn)行分析。結(jié)果表明：6#菌株——TrichosporonporosumD02、1#菌株——斯達(dá)油脂酵母Lipomycesstarkeyi1809對(duì)廢水的資源化利用程度最高，6#和1# 2個(gè)優(yōu)良酵母菌株在發(fā)酵120 h時(shí)的油脂產(chǎn)量、菌體粗蛋白產(chǎn)量、COD降解率分別達(dá)到8.93 g/L、6.1 g/L、89.09%和4.62 g/L、4.42 g/L、81.47%。2個(gè)優(yōu)良酵母菌株所產(chǎn)油脂的脂肪酸組成均以C16和 C18系為主，含量最高的為油酸(C18∶1)和棕櫚酸(C16∶0)，不飽和脂肪酸指數(shù)(IUFA)分別達(dá)到80.33%和61.57%。除脯氨酸未檢出外，2個(gè)優(yōu)良酵母菌株菌體蛋白均含有17種氨基酸，其中8種必需氨基酸占氨基酸總量的比例分別為44.14%和44.23%，可完全充當(dāng)動(dòng)物蛋白飼料。

啤酒生產(chǎn)廢水；產(chǎn)油脂酵母；微生物油脂；菌體蛋白；COD；脂肪酸組成；必需氨基酸

從2003年起，我國(guó)啤酒產(chǎn)銷(xiāo)量均為世界第一， 并保持連續(xù)增長(zhǎng)[1]。與此同時(shí)，啤酒企業(yè)每年要投入大量費(fèi)用用于處理生產(chǎn)廢水[2]。由于啤酒生產(chǎn)廢水含有較高濃度的有機(jī)物、N、P、無(wú)機(jī)鹽等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，直接處理會(huì)造成資源的浪費(fèi)。目前，研究者對(duì)資源化利用啤酒生產(chǎn)廢水進(jìn)行了有益的探索[3-6]，但啤酒生產(chǎn)廢水的綜合利用仍是尚未解決的實(shí)際難題，是當(dāng)今環(huán)保領(lǐng)域亟待研究的課題之一。為探討啤酒廢水資源化利用的有效途徑，筆者在前期研究基礎(chǔ)上[7-9]，對(duì)7種酵母菌利用啤酒廢水發(fā)酵進(jìn)行了篩選，考察了酵母菌株對(duì)啤酒廢水COD降解率、產(chǎn)微生物油脂和產(chǎn)菌體蛋白能力的影響，以期為實(shí)現(xiàn)啤酒生產(chǎn)廢水的資源化利用探索新的途徑和方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株(見(jiàn)表1)

表1 實(shí)驗(yàn)菌株

1.1.2 培養(yǎng)基

(1)活化培養(yǎng)基為YEPD固體培養(yǎng)基[7]：葡萄糖20 g/L，酵母膏或酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH。于121℃飽和蒸汽滅菌20 min。

(2)種子培養(yǎng)基為YEPD液體培養(yǎng)基[7]：葡萄糖20 g/L，酵母膏或酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，自然pH。于121℃飽和蒸汽滅菌20 min。

(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：自然沉降24 h的啤酒生產(chǎn)廢水(南陽(yáng)天冠啤酒廠)，以1∶1稀釋后調(diào)節(jié)其pH為5.8～6.0。于121℃飽和蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

酵母粉(BR)、蛋白胨(BR)、葡萄糖(AR)、瓊脂(BR)、硫酸銅(AR)、硫酸鉀(AR)、硼酸(AR)、氫氧化鈉(AR)、苯酚(AR)、濃鹽酸(AR)、濃硫酸(AR)、3,5-二硝基水楊酸(AR)、無(wú)水乙醇(AR)、硫酸亞鐵銨(AR)、硫酸汞(AR)、七水硫酸鎂(AR)、甲醇(AR)、三氯甲烷(AR)、重鉻酸鉀(AR)、鄰苯二甲酸氫鉀(AR)等。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器

SW-CJ-2G超凈工作臺(tái)；HZQ-B大型全溫?fù)u床；752N紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；TDL-40B低速離心機(jī)；TDL-40B高速離心機(jī)；DNP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱；101-2A電熱鼓風(fēng)干燥箱； LDZX-50FB立式壓力蒸汽滅菌鍋； PHS-3C精密pH計(jì)；-20℃冰箱；日立L-8900 全自動(dòng)氨基酸分析儀，日立株式會(huì)社；天美TM 7890ⅡGC氣相色譜儀附氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，上海天美分析儀器有限公司；浙江大學(xué)T2100色譜工作站，浙江大學(xué)智能信息工程有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

接1環(huán)保藏菌株至YEPD固體斜面培養(yǎng)基，28℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d。接適量活化后的菌體于YEPD液體種子培養(yǎng)基中(250 mL錐形瓶中裝液量為50 mL)，28℃、120 r/min培養(yǎng)36～48 h。然后把種子培養(yǎng)液按10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中(500 mL錐形瓶中裝液量為100 mL)，28℃、120 r/min搖床培養(yǎng)120 h。

1.2.2 測(cè)定方法

(1)菌體生物量的測(cè)定：采用干重法[10]測(cè)定菌體生物量。

(2)油脂的測(cè)定：采用酸熱法[11]提取微生物油脂。

油脂產(chǎn)量=提取油脂的質(zhì)量/發(fā)酵液體積

油脂含量=提取油脂的質(zhì)量/發(fā)酵液生物量×

100%

油脂系數(shù)=消耗100 g糖轉(zhuǎn)化為油脂的質(zhì)量

(3)總糖的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法[11]測(cè)定總糖。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=0.001 01+0.008 49X，R2=0.998 4。

(4)還原糖的測(cè)定：采用3、5-二硝基水楊酸(DNS)法[12]測(cè)定還原糖。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，Y=-0.006 1+0.499 43X，R2=0.999 7。

(5)總氮的測(cè)定：采用凱氏定氮法[13]測(cè)定總氮。

菌體粗蛋白產(chǎn)量=粗蛋白質(zhì)量/發(fā)酵液體積

干菌粗蛋白含量=粗蛋白質(zhì)量/干菌體質(zhì)量×100%

蛋白系數(shù)=消耗100 g糖轉(zhuǎn)化為蛋白質(zhì)的質(zhì)量

(6)COD的測(cè)定：采用重鉻酸鉀法[14]測(cè)定COD。

(7)pH的測(cè)定：采用PHS-3C精密pH計(jì)測(cè)定pH[15]。

(8)菌體蛋白氨基酸組成的測(cè)定：采用GB/T 18246—2000茚三酮分光光度法測(cè)定氨基酸組成。

(9)菌體油脂脂肪酸組成分析：待測(cè)樣品甲酯化。色譜柱為T(mén)M石英毛細(xì)管柱(25 m×0.25 mm×0.25 μm)；程序升溫：150 ℃保持1 min，以15 ℃/min升至190 ℃后保持5 min；汽化溫度280℃；進(jìn)樣量0.3 μL；檢測(cè)器(FID)溫度280℃；燃?xì)?H2)流速20 mL/min；載氣(N2)流速90 mL/min；助燃?xì)?空氣)流速60 mL/min；分流比1∶10。脂肪酸通過(guò)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品定性，用面積歸一化法[6]確定相對(duì)含量。

(10)不飽和脂肪酸指數(shù)(IUFA)計(jì)算：參照文獻(xiàn)[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同酵母菌利用啤酒廢水的產(chǎn)油脂能力

以啤酒生產(chǎn)廢水為培養(yǎng)基，分別將7個(gè)菌株用1.2.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定其生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，在接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、搖床轉(zhuǎn)速等相同的條件下，不同菌株的產(chǎn)油脂能力不同。6#菌株的油脂產(chǎn)量、油脂含量最高，其次是1#菌株，其油脂含量達(dá)31.99%； 2#、5#和7#菌株的油脂含量均在20%以上；而3#和4#菌株的油脂含量較低，分別只有15.38%和17.07%。以菌體生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)指標(biāo)綜合來(lái)考慮，可以確定6#和1#菌株在啤酒廢水中產(chǎn)油能力最好。

表2 不同菌株產(chǎn)油脂能力的比較

2.2 不同酵母菌利用啤酒廢水產(chǎn)菌體蛋白能力

以啤酒生產(chǎn)廢水為培養(yǎng)基，分別將7個(gè)產(chǎn)油脂酵母菌株按1.2.1的方法培養(yǎng)，測(cè)定其生物量、菌體粗蛋白產(chǎn)量、干菌粗蛋白含量和蛋白系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同酵母菌株產(chǎn)菌體蛋白能力的比較

由表3可見(jiàn)，在相同的培養(yǎng)條件下，不同菌株的產(chǎn)菌體蛋白能力有顯著的差異，不同酵母菌株的干菌粗蛋白含量也不相同。1#和6#菌株的干菌粗蛋白含量最高，分別達(dá)到30.64%和29.15%；其次3#、5#和7#菌株的干菌粗蛋白含量為20%以上，2#和4#菌株的干菌粗蛋白含量最低， 只有16%左右。以菌體生物量、菌體粗蛋白產(chǎn)量、干菌粗蛋白含量和蛋白系數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮，1# 、5#和6#菌株利用啤酒生產(chǎn)廢水產(chǎn)菌體蛋白能力較好。

2.3 不同酵母菌處理啤酒廢水的COD降解率

以啤酒生產(chǎn)廢水為培養(yǎng)基，分別將7個(gè)菌株用1.2.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定其COD降解率，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可以看出，在相同的培養(yǎng)條件下，不同菌株對(duì)廢水的COD降解率不同。6# 和7#菌株對(duì)廢水的COD降解率最高，分別達(dá)到89.09%和89.67%；其次1# 和2#菌株分別為81.47%和79.83%；3# 、4#和5#菌株對(duì)廢水的COD降解率較低，均在60%以下。

圖1 不同酵母菌株對(duì)廢水COD降解率

綜上所述，通過(guò)對(duì)7個(gè)不同酵母菌株利用啤酒生產(chǎn)廢水產(chǎn)油脂能力、產(chǎn)菌體蛋白能力和對(duì)廢水COD降解率的考察，6# 和1#菌株的各項(xiàng)指標(biāo)較好，可以確定為啤酒生產(chǎn)廢水資源化利用的優(yōu)良酵母菌株。6# 和1#產(chǎn)油脂酵母菌株在啤酒生產(chǎn)廢水中發(fā)酵后菌體和脂肪球形態(tài)，見(jiàn)圖2。

2.4 6#和1#菌株發(fā)酵周期分析

利用不添加任何營(yíng)養(yǎng)成分的啤酒生產(chǎn)廢水為培養(yǎng)基，分別將篩選出的6#菌株和1#菌株用1.2.1的方法進(jìn)行培養(yǎng)，每24 h取樣，測(cè)定各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)，結(jié)果分別見(jiàn)表4和表5。

表4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)6#菌株產(chǎn)油脂的影響

表5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)1#菌株產(chǎn)油脂的影響

由表4和表5可以看出，6#菌株和1#菌株的發(fā)酵過(guò)程可分為菌體生長(zhǎng)期和油脂積累期。6#菌株和1#菌株在培養(yǎng)的前72 h，菌體生長(zhǎng)旺盛，菌體生物量有較大增幅，COD降解率也有較大提高，而油脂積累較少；6#菌株在培養(yǎng)96 h時(shí)，菌體的油脂系數(shù)和油脂含量達(dá)到最大，分別為14.79和44.98%，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，在120 h菌體油脂產(chǎn)量達(dá)到最大值、生物量和COD降解率接近最高值，分別為8.93、20.94 g/L和89.09%，而油脂含量和油脂系數(shù)卻略有降低。1# 菌株在發(fā)酵120 h時(shí)，菌體生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、油脂系數(shù)和COD降解率均基本達(dá)到最高值，分別為14.44 g/L、4.62 g/L、31.99%、13.76和81.47%。在培養(yǎng)120 h后，由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的大量消耗，6#菌株和1#菌株的發(fā)酵進(jìn)入衰亡期，菌體油脂產(chǎn)量、油脂含量和油脂系數(shù)均有所降低，但COD降解率卻沒(méi)有明顯變化。因此，經(jīng)過(guò)綜合分析，可以確定6#和1# 菌株的適宜發(fā)酵周期為120 h。

2.5 6#和1#菌株產(chǎn)油脂的脂肪酸組成和菌體蛋白的氨基酸組成分析

以啤酒生產(chǎn)廢水為培養(yǎng)基，在10%的接種量、100 mL的裝液量、28 ℃、120 r/min的條件下對(duì)6#和1#菌株培養(yǎng)120 h，發(fā)酵結(jié)束后收集菌體并進(jìn)行干燥，提取微生物油脂，利用氣相色譜對(duì)其脂肪酸組成進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)表6。并依據(jù)GB/T 18246—2000的檢測(cè)方法，利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定菌體蛋白的氨基酸含量，結(jié)果見(jiàn)表7。

表6 利用啤酒生產(chǎn)廢水培養(yǎng)6#和1#菌株

注：“-”為未檢出。下同。

由表6可以看出，6#和1#菌株產(chǎn)油脂的脂肪酸組成均以C16和C18系列為主，脂肪酸相對(duì)含量最高的是油酸(C18∶1)和棕櫚酸(C16∶0)，分別為61.57%、22.20%和58.86%、34.38%，不飽和脂肪酸指數(shù)分別達(dá)到80.33%和61.57%，均與植物油的脂肪酸組成相似，可作為生物柴油新油源。

表7 利用啤酒生產(chǎn)廢水培養(yǎng)6#和1#菌株產(chǎn)菌體蛋白的氨基酸組成分析 %

由表7可以看出，6#和1#菌株菌體蛋白在18種氨基酸中只有脯氨酸未被檢出，其中8種必需氨基酸占氨基酸總量的比例分別達(dá)到44.14%和44.23%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值分別為0.790和0.793。由此可以看出，6#和1#菌株菌體蛋白中必需氨基酸含量高于常見(jiàn)的蛋白飼料，且還普遍高于常見(jiàn)的肉類(lèi)食物，完全達(dá)到了FAO/WHO 40%的要求，完全可以充當(dāng)動(dòng)物的蛋白飼料。

3 結(jié) 論

(1)從7個(gè)酵母菌株篩選出資源化利用啤酒生產(chǎn)廢水程度較高的2個(gè)優(yōu)良菌株6#——TrichosporonporosumD02和1#——斯達(dá)油脂酵母Lipomycesstarkeyi1809，培養(yǎng)120 h時(shí)，2個(gè)優(yōu)良菌株的生物量、油脂產(chǎn)量、油脂含量、菌體粗蛋白產(chǎn)量、干菌粗蛋白含量和COD降解率依次分別為20.94 g/L、8.93 g/L、42.65%、6.1 g/L、29.15%、89.09%和14.44 g/L、4.62 g/L、31.99%、4.42 g/L、30.64%、81.47%，2個(gè)酵母菌株利用啤酒工業(yè)廢水的綜合發(fā)酵效果較好。

(2)2個(gè)優(yōu)良菌株6#——TrichosporonporosumD02和1#——斯達(dá)油脂酵母Lipomycesstarkeyi1809利用啤酒生產(chǎn)廢水產(chǎn)菌體油脂的脂肪酸組成均以C18和C16系列為主，脂肪酸相對(duì)含量最高的是油酸(C18∶1)和棕櫚酸(C16∶0)，分別為61.57%、22.20%和58.86%、34.48%，不飽和脂肪酸指數(shù)分別達(dá)到80.33%和61.57%，與植物油的脂肪酸組成相似，可作為生物柴油新油源。

(3)2個(gè)優(yōu)良菌株6#——TrichosporonporosumD02和1#——斯達(dá)油脂酵母Lipomycesstarkeyi1809利用啤酒生產(chǎn)廢水產(chǎn)菌體粗蛋白的氨基酸組成除脯氨酸未被檢出，其余17種氨基酸均被檢出。其中8種必需氨基酸占氨基酸總量的比例分別達(dá)到44.14%和44.23%，必需氨基酸與非必需氨基酸的比值分別為0.790和0.793。6#和1#菌株菌體蛋白中必需氨基酸含量與常見(jiàn)的蛋白飼料相比要高，并且普遍高于常見(jiàn)的肉類(lèi)食物，達(dá)到了FAO/WHO 40%的要求，完全可以充當(dāng)動(dòng)物飼料，其營(yíng)養(yǎng)成分甚至達(dá)到了食品的要求。

(4)啤酒生產(chǎn)廢水中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可利用性較高，采用優(yōu)良產(chǎn)油脂酵母菌對(duì)廢水進(jìn)行處理，不僅可以極大降低啤酒廢水中的COD，同時(shí)還可以獲得高附加值的微生物油脂和菌體蛋白等產(chǎn)品，這為探索實(shí)現(xiàn)廢水的綜合資源化利用提供了新的途徑和依據(jù)。

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Production of microbial oil and bacterial protein from beer production wastewater fermented by yeast

WANG Dongmei1,2,GUO Shuxian1,2,LIANG Yuehui1, LIU Huan3, ZHANG Yanping4

(1.School of Biological and Chemical Engineering, Nanyang Institute of Technology, Nanyang 473000, Henan,China； 2.Nanyang Key Laboratory of Industrial Microbiology, Nanyang 473000, Henan,China； 3.State Key Laboratory for Automotive Biofuel, Nanyang 473000, Henan,China; 4.College of Food, Hainan University, Haikou 570100,China)

For exploring the comprehensive utilization method and way of beer production wastewater, using the liquid fermentation to select high-yield strains which could product microbial oil, bacterial protein and could effectively degrade COD from seven yeast strains were studied. The fermentation period was examined and the fatty acid composition of microbial oil and amino acid composition of bacterial protein of the screened yeast strains were analyzed. The results showed that the resource utilization degrees of 6# strain (TrichosporonporosumD02) and 1# strain (Lipomycesstarkeyi1809) on wastewater were the highest. When two screened strains 6# strain and 1# strain were fermented for 120 h, the oil productivity, crude bacterial protein productivity and degradation rate of COD were 8.93 g/L, 6.1 g/L, 89.09% and 4.62 g/L, 4.42 g/L, 81.47% respectively. C18and C16fatty acids were the main components in the fatty acid composition of microbial oil of two screened strains. The contents of oleic acid and palmitic acid were the highest. The indexes of unsaturated fatty acid (IUFA) were 80.33% and 61.57% respectively. Except proline was not detected, the bacterial protein of two screened strains contained 17 kinds of amino acids and the contents of eight kinds of essential amino acids were 44.14% and 44.23% respectively. Bacterial protein could be used as a new source of animal protein feed.

beer production wastewater; oleaginous yeast; microbial oil; bacterial protein;COD;fatty acid composition; essential amino acid

2016-05-26；

2017-01-03

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目(132300410087)；河南省重點(diǎn)科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(102102310033)

王冬梅(1964)，女，教授，碩士，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)(E-mail)Wdm0410@sohu.com。

郭書(shū)賢，教授(E-mail)guoshux@163.com。

TS222;TQ920.6

A

1003-7969(2017)04-0108-06