艾塞那肽通過抑制黃嘌呤氧化酶-活性氧類降低內(nèi)皮細胞缺氧復氧損傷

王紅雷，韓延輝，賈靜靜，來利紅，朱繼紅，董平栓

(河南科技大學第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，洛陽 471003)

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療(percutaneous coronary intervention，PCI)是目前治療急性心肌梗死(acute myocardial infarction，MI)的最有效手段[1,2]。然而開通血管后，雖然消除了血管的機械性阻塞，但遠端的分支及末端微血管并未得到有效灌注[3]，各分支血管供應的心肌組織仍處于缺氧狀態(tài)，甚至開通血管后，梗死面積進一步擴大，即PCI術后的缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)[4]。IRI的發(fā)生減少了血運重建帶給患者的益處。再灌注階段活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的爆發(fā)以及隨后發(fā)生的細胞凋亡是IRI發(fā)生重要因素。冠狀動脈分支末梢的心肌微血管內(nèi)皮細胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMEC)是血管與心肌細胞之間的第1道屏障，在IRI發(fā)生時最早受到影響[5,6]。因此，在防治PCI術后的二次打擊中，降低IRI誘導的CMEC氧化應激損傷起到至關重要的作用。胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)是由腸道內(nèi)分泌細胞分泌的腸促胰島素，可被二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)迅速降解[7,8]。艾塞那肽(exenatide，Exe)是GLP-1受體激動劑，能更好地耐受DPP-4降解，使低血糖事件發(fā)生率降低[9]。此外，Exe還具有減少心肌梗死面積、抑制心肌細胞凋亡等作用[10,11]。但Exe對IRI誘導的CMEC氧化應激損傷的保護機制尚未完全明確。因此，我們通過建立體外缺氧復氧模型(hypoxia/reoxygenation model，H/R)，探究氧化應激損傷誘導CMEC凋亡的信號通路及Exe的保護機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)(Santa Cruz，上海)，一抗黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XO)(1∶1000，Abcam，上海)，β-actin(1∶2000，Santa Cruz，上海)，F(xiàn)ura-3AM熒光探針試劑盒和DCFH-DA熒光探針試劑盒(Molecular probe，美國)，JC-1染色試劑盒(碧云天，上海)。共聚焦顯微鏡(OLYMPUS DX51，日本)，酶標儀(Epoch 2，美國)。

1.2 CMEC的提取及鑒定

在文獻基礎上進行改良[12]。5只5～6 d的SD大鼠處死后取出左心室，75%乙醇中浸泡15 s，清洗后剪碎，采用I型膠原酶和胰蛋白酶37℃水浴消化10 min，離心后重懸于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)4 h，去除懸浮未貼壁的細胞。細胞固定封閉后，分別滴加Ⅷ因子多克隆抗體和CD31單克隆抗體(均為1∶100)，孵育過夜。倒置熒光顯微鏡觀察，計數(shù)3個視野及均數(shù)。

1.3 H/R模型的建立以及Exe干預

CMEC缺氧處理4 h，換氧含量正常的復箱放置4 h，建立H/R模型。為了考察Exe對H/R模型的影響，分別5組：正常對照組、H/R模型組、1 nmol/L Exe組、10 nmol/L Exe組和100 nmol/L Exe組。采用完全培養(yǎng)基[20%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)+高糖DMEM)]， 37°C、5% CO2條件下放置12 h。

1.4 Ca2+和siRNA干擾技術對H/R模型的影響

1.4.1 Ca2+對XO表達量的影響 采用Western blotting檢測XO的表達量。分為5組：正常對照組、H/R 模型組、H/R+Exe組、H/R+BAPTA組和H/R+Iono組。其中BAPTA為胞漿Ca2+螯合劑，而Iono為胞漿Ca2+激活劑。

1.4.2 siRNA干擾技術對ROS的影響 為證實XO是胞漿過量ROS的主要來源，采用2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針檢測各組胞漿ROS熒光強度，分為5組：正常對照組、H/R模型組、H/R+Exe組、H/R+siRNA組和H/R+siRNA對照組。其中H/R+siRNA組采用siRNA干擾技術敲低XO蛋白。將SD大鼠XO的siRNA序列修改為5’-CCACCUCCAAGAUUCAUAUTT-3’。CMEC細胞培養(yǎng)至80%融合，梯度更換低濃度血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h并同步化細胞。加入Lipo2000 和對應的siRNA，確定最終轉(zhuǎn)染時間。XO表達的抑制時間為48 h。

1.5 ROS對線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響

分為6組：正常對照組、H/R模型組、H/R+Exe組、H/R+siRNA組、H/R+siRNA對照組和H/R+N-乙酰半胱氨酸(NAC)組。其中NAC為胞漿ROS清除劑。

1.5.1 JC-1染色 依據(jù)JC-1染料在正常細胞線粒體中為紅色熒光、而在受損線粒體中為綠色熒光的特質(zhì)，考察ROS對線粒體結(jié)構(gòu)和功能的影響。各組中添加JC-1 染料于37℃條件下孵育30 min，熒光顯微鏡下拍照。Jmage Pro軟件熒光半定量檢測膜電位。使用四甲基若丹明乙酯酸銨染料，于細胞處理結(jié)束后，添加染料與細胞共同孵育30 min，隨后用酶標儀測定520 nm 處吸光度值(A520 nm)，計算相對值為膜孔道開放程度。

1.5.2 細胞色素-C釋放 細胞色素-C(cytochrome-C, Cyt-C)釋放是線粒體膜電位受損、膜孔道開放比例增加的結(jié)果。在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用4%的多聚甲醛固定爬片15 min；0.5% Triton X-100室溫通透20 min；在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，滴加足夠量稀釋好的Cyt-C一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；加熒光二抗；滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，封片。共聚焦顯微鏡觀察并檢測caspase-3和caspase-9的活性。

1.6 TUNEL檢測

處理組：50 μl脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT)+450 μl熒光素標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸(dUTP)。對照組：50 μl 熒光素標記的dUTP。37℃孵育細胞30 min，50 μl TdT介導的dUTP 缺口末端標記測定法(TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)反應混合液加入標本中，暗濕盒中反應60 min。每組細胞隨機選10個不同視野，熒光顯微鏡下計數(shù)凋亡細胞均值，重復3次。

1.7 免疫熒光檢測

細胞爬片固定、通透、封閉后，分別加入CD31抗體(1∶500，Abcam)、Ⅷ因子(1∶1000，Abcam)和Cyt-C(1∶500，Abcam)孵育， 4℃過夜，加入驢抗兔二抗(1∶2000，Sigma)，孵育2 h。加細胞核染料4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)后孵育3 min，熒光顯微鏡觀察。

1.8 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 CMEC的培養(yǎng)、鑒定及Exe對CMEC的毒性作用

CMEC于培養(yǎng)瓶中貼壁生長24 h后逐漸鋪展；72～96 h鋪滿瓶底，呈典型鋪路石樣結(jié)構(gòu)。CD31和Ⅷ免疫細胞熒光染色檢測結(jié)果顯示，雙陽性率>95%，證實為CMEC(圖1)。MTT檢測示，各組細胞細胞間活性差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

2.2 Exe對H/R誘導的細胞凋亡的影響

與正常組相比，H/R模型組表現(xiàn)為TUNEL綠色熒光顯著增強。予以Exe預處理 12 h，其以濃度依賴的方式降低TUNEL綠色熒光(P<0.05)[13]。熒光半定量實驗結(jié)果表明，10 nmol/L為Exe的最佳抗凋亡濃度，因此作為后續(xù)干預的最佳處理條件(圖3)。

圖1 CMEC的免疫組織化學染色鑒定Figure 1 Identification of CMEC by immunohistochemistry (×400) CMEC: cardiac microvascular endothelial cells

圖2 Exe對CMEC活性的影響Figure 2 Effect of Exe on cell viability (n=3) Exe: exenatide; CMEC: cardiac microvascular endothelial cells

2.3 Ca2+對H/R模型內(nèi)XO表達量的影響

與H/R組和H/R+Iono組相比，H/R+Exe組和H/R+BAPTA組的XO表達量均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖4)。

2.4 siRNA干擾技術對H/R模型內(nèi)ROS的影響

與H/R組和H/R+siRNA對照組相比，H/R+Exe組和H/R+siRNA組的ROS熒光強度均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖5)。

2.5 JC-1染色結(jié)果

與H/R組和H/R+siRNA對照組相比，H/R+Exe組、H/R+siRNA組和H/R+NAC組的線粒體膜電位均顯著增加，而膜孔道開放程度均顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖6)。

2.6 Cyt-C釋放

通過共聚焦顯微鏡觀察Cyt-C的亞細胞定位發(fā)現(xiàn)，H/R損傷模型導致Cyt-C熒光在胞質(zhì)內(nèi)呈彌散狀分布，并伴隨caspase-3和caspase-9活性的顯著上升，提示H/R模型使得線粒體凋亡通路激活。而與H/R組和H/R+siRNA對照組相比，H/R+Exe組、H/R+siRNA組和H/R+NAC組均可在一定程度上減少Cyt-C的釋放，并伴隨caspase-3和caspase-9活性顯著降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05；圖7)。

圖3 Exe對H/R誘導的CMEC凋亡的影響Figure 3 Effect of Exe on apoptosis of CMEC induced by H/R A: results of staining (TUNEL ×200); B: quantitative analysis (n=5). Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model; CMEC: cardiac microvascular endothelial cells. Compared with control group, *P<0.05; compared with H/R group, #P<0.05

圖4 Ca2+對XO表達量的影響Figure 4 Influence of Ca2+ on expression of XO (n=3) A: western blotting; B: quantitative analysis. XO: xanthine oxidase; Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model. Compared with control group, *P<0.05; compared with H/R group, #P<0.05; compared with H/R+Iono group, △P<0.05

圖5 siRNA干擾技術對ROS熒光強度的影響Figure 5 Influence of siRNA on intensity of ROS (n=5)

ROS: reactive oxygen species; Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model. Compared with control group,*P<0.05; compared with H/R group,#P<0.05; compared with H/R+siCtrl group,△P<0.05

3 討 論

盡管PCI術能迅速開通堵塞血管、恢復冠狀動脈血流灌注，但也增加了組織發(fā)生IRI的可能[14,20]。ROS爆發(fā)可導致組織細胞呈現(xiàn)氧化應激狀態(tài)，是損傷細胞亞結(jié)構(gòu)、誘導細胞進入程序性死亡的關鍵點[15]。

內(nèi)皮細胞中ROS的來源較多，如線粒體呼吸鏈損傷、胞漿中的XO，以及蛋白底物代謝過程中產(chǎn)生的負離子電荷[16,17]。內(nèi)皮細胞中線粒體的含量相對缺乏，在CMEC中，線粒體主要作為信號傳導器發(fā)揮作用。已有研究證實[18]，在黃嘌呤脫氫酶大量轉(zhuǎn)變?yōu)閄O、以及XO自身轉(zhuǎn)錄增加的作用下，H/R環(huán)境中XO的表達量顯著升高，其生成的ROS最終可誘導細胞凋亡的發(fā)生。

正常情況下，胞漿和線粒體內(nèi)ROS的生成和清除處于動態(tài)平衡，但在病理情況下，CMEC胞漿的ROS生成過量，滲漏進入線粒體，導致線粒體呼吸鏈Ⅰ～Ⅳ型復合物的氧化，發(fā)生電子傳遞功能障礙，線粒體膜電位下降導致膜孔道開放，線粒體內(nèi)膜與Cyt-C結(jié)合力下降，滲漏至胞漿，從而激活caspase-9/3線粒體凋亡蛋白家族[16]。已有研究證實[17]，H2O2誘導的干細胞氧化應激損傷模型可以激活線粒體經(jīng)典凋亡通路、誘導干細胞凋亡，這一過程也是通過上述途徑完成的。而予以Exe則可逆轉(zhuǎn)這一損傷過程，顯著降低干細胞凋亡。本研究證實，在CMEC的H/R損傷過程中，施加Exe預處理能夠有效逆轉(zhuǎn)XO-ROS誘導的線粒體損傷。

圖6 JC-1染色結(jié)果及mPTP開放程度檢測Figure 6 Results of JC-1 staining and mPTP tests A: results of staining (×200); B: quantitative analysis. Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model; mPTP: mitochondrial permeability transition pore. Compared with control group, *P<0.05; compared with H/R group, #P<0.05; compared with H/R+siCtrl group, △P<0.05

圖7 Cyt-C釋放檢測結(jié)果Figure7 Results of Cyt-C discharge A: results of staining (×400); B: quantitative analysis (n=5). Exe: exenatide; H/R: hypoxia/reoxygenation model. Compared with control group, *P<0.05; compared with H/R group, #P<0.05; compared with H/R+siCtrl group, △P<0.05

Exe為GLP-1受體激動劑，作用于胰島細胞，降糖作用明顯[18]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)[19]，在循環(huán)血液中，Exe還可以與心臟上的GLP-1受體結(jié)合，進入細胞內(nèi)，發(fā)揮抗凋亡作用，主要通過Camp/PKA信號轉(zhuǎn)導途徑，可顯著改善線粒體功能。

綜上所述，本研究證實了H/R損傷模型通過激活XO-ROS損傷信號，激活線粒體凋亡通路，引起CMEC結(jié)構(gòu)和功能障礙。而予以Exe預處理可有效逆轉(zhuǎn)此損傷信號通路，降低細胞的氧化應激損傷，提示Exe在I/R損傷過程中具有保護作用，不僅豐富了臨床藥物選擇范圍，也為應用Exe提供了可靠的理論基礎。

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