丙戊酸和氫氣對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響

吳曦子，曾仁慶，趙洋子，常盼盼，范晨玲，王紅，崇巍

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.急診科；2.神經(jīng)外科；3.內(nèi)分泌科，沈陽110001）

丙戊酸和氫氣對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響

吳曦子1，曾仁慶1，趙洋子1，常盼盼2，范晨玲3，王紅3，崇巍1

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院1.急診科；2.神經(jīng)外科；3.內(nèi)分泌科，沈陽110001）

目的研究丙戊酸（VPA）和氫氣（H2）對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞表型的影響。方法對(duì)缺氧BV2小膠質(zhì)細(xì)胞分別給予VPA和H2處理后，收集上清和細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)用ELISA、流式細(xì)胞術(shù)和實(shí)時(shí)PCR技術(shù)檢測表型標(biāo)志物。結(jié)果與對(duì)照組相比，缺氧增加BV2細(xì)胞M1型表型標(biāo)志物mRNA（iNOS）的表達(dá)，降低M2型表型標(biāo)志物mRNA（CD206、TGF?β）的表達(dá)，使M1型和M2型表型標(biāo)志物mRNA的比值（CD16∶CD206、iNOS∶CD206、iNOS∶TGF?β）升高（P＜0.05）。與缺氧組相比，VPA降低缺氧BV2的M1型表型標(biāo)志物蛋白（CD16/32）和mRNA（iNOS）的表達(dá)，使M1型和M2型表型標(biāo)志物mRNA的比值（CD16∶CD206、CD32∶CD206、iNOS∶CD206、iNOS∶TGF?β）降低（P＜0.05）。與缺氧組相比，H2降低缺氧BV2的M1型表型標(biāo)志物蛋白（TNF?α、CD16/32、iNOS）和mRNA（iNOS）的表達(dá)，升高M(jìn)2型表型標(biāo)志物蛋白（IL?10）和mRNA（CD206、TGF?β）的表達(dá)，使M1型和M2型表型標(biāo)志物mRNA的比值（CD16∶CD206、iNOS∶CD206、iNOS∶TGF?β）降低（P＜0.05）。結(jié)論缺氧使小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化；VPA和H2均可抑制缺氧對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的促炎作用。

缺氧；小膠質(zhì)細(xì)胞；氫氣；丙戊酸；巨噬細(xì)胞表型

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）的關(guān)鍵在于缺血（或）缺氧引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)腦細(xì)胞水腫，加重腦組織缺氧。因而抑制炎癥反應(yīng)是治療嚴(yán)重TBI的主要策略［1?2］。研究［3?5］發(fā)現(xiàn)，丙戊酸（valproic acid，VPA）和氫氣（hydrogen，H2）對(duì)TBI有治療作用，但二者抑制TBI致炎癥反應(yīng)的機(jī)制尚未闡明。

近年研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞作為炎癥反應(yīng)的主要調(diào)控者，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激時(shí)，可分化出M1型和M2型2種功能表型，二者的相對(duì)關(guān)系控制著炎癥反應(yīng)的進(jìn)程，且表達(dá)出特異性的表型標(biāo)志物。這種功能表型轉(zhuǎn)化與細(xì)胞內(nèi)外一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、轉(zhuǎn)錄因子和轉(zhuǎn)錄后修飾等有關(guān)［6］。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)中，小膠質(zhì)細(xì)胞也具有上述特點(diǎn)。嚴(yán)重的顱腦損傷可引起過度的炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)M1型小膠質(zhì)細(xì)胞占主導(dǎo)，造成神經(jīng)組織不可逆損傷［7］。因而本研究以體外缺氧刺激小膠質(zhì)細(xì)胞為研究對(duì)象，給予VPA或H2干預(yù)，進(jìn)行表型標(biāo)志物的檢測，旨在研究VPA和H2對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用，為探索二者對(duì)TBI炎癥反應(yīng)的干預(yù)機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞BV2（協(xié)和細(xì)胞資源中心，北京）在含有10%胎牛血清（Invitrogen公司）細(xì)胞培養(yǎng)液中及恒溫培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 H2和VPA處理缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞

將BV2細(xì)胞分成4組：對(duì)照（sham）組、缺氧（O2-）組、缺氧+VPA（O2-/VPA+）組、缺氧+H2（O2-/H2+）組。向O2-/VPA+組加入VPA（Sigma?Aldrich公司），使培養(yǎng)基內(nèi)終濃度達(dá)到0.3 mmol/L，迅速和O2-組一起放入密閉小室（外部水浴，使內(nèi)部恒溫37℃）A中，將O2-/H2+組放入密閉小室B中，兩小室同時(shí)接入濕潤的缺氧氣體（0.5%O2、10%CO2、89.5%N2），流速：10 L/min，10 min后改為2 L/min，2 h后，取出O2-組和O2-/VPA+組，進(jìn)行表型標(biāo)志物檢測；同時(shí)切斷小室B缺氧氣體連接，同時(shí)通入H2混合氣（2% H2、0.5%O2、10%CO2、87.5%N2），1 h后取出培養(yǎng)瓶，進(jìn)行如下操作。

1.3 ELISA測定

留取各組細(xì)胞上清，使用R&D、DaKeWe公司ELISA試劑盒檢測M1型表型標(biāo)志物腫瘤壞死因子（tu?mor necrosis factor，TNF）α和M2型表型標(biāo)志物白細(xì)胞介素（interleukin，IL）10，方法遵試劑盒說明書。使用TECAN F200PRO酶標(biāo)儀檢測。

1.4 流式熒光抗體標(biāo)記

收集細(xì)胞團(tuán)，應(yīng)用BD FACSCalibur型流式細(xì)胞儀（BD Biosciences公司）進(jìn)行流式熒光蛋白檢測。檢測抗體：M1型為CD16/32（eBioscience公司），誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iN?OS）（eBioscience公司）；M2型為CD206（AbD serotec公司）。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測

將上述得到的收集細(xì)胞團(tuán)，分別用RNeasy Mini試劑盒（Qiagen公司）和High?Capacity cDNA Reverse Transcription試劑盒（Applied Biosystems公司）提取總RNA和反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA（具體用法遵各試劑盒說明），加入熒光定量PCR試劑SYBR Green Master Mix（Roche公司）、上下游引物，引物序列：CD16Forward：5’?CATCAGCTCCTGTCTGGTT T?3’，Reverse：5’?CTCTCTGCAGCCTGTGTATTT?3’；CD32Forward：5’?AATCCTGCCGTTCCTACTC?3’，Reverse：5’?GTGTCACCGTGTCTTCCTTGAG?3’；CD206Forward：5’?GTGGTCCTCCTGATTGTGATA G?3’，Reverse：5’?CACTTGTTCCTGGACTCAGATT A?3’；iNOSForward：5’?GAACGGAGAACGTTGGA TTTG?3’，Reverse：5’?TCAGGTCACTTTGGTAGGA TTT?3’；TGF?βForward：5’?GGGAAATTGAGGGCT TTCG?3’，Reverse：5’?GAACCCGTTGATGTCCACTT G?3’；以GAPDHForward：5’?CCTGGAGAAACCTGC CAAGTAT?3’，Reverse：5’?CTCGGCCGCCTGCTT?3’作為內(nèi)參基因（Realtimeprimer公司）。應(yīng)用Roche Light Cycler480進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測。運(yùn)用2-ΔΔCt法得出相對(duì)mRNA含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用Microsoft EXCEL 2007軟件錄入數(shù)據(jù)，兩兩比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 缺氧對(duì)BV2細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化的作用

與sham組相比，缺氧增加BV2細(xì)胞M1型表型標(biāo)志物iNOSmRNA的表達(dá)（P＜0.001），降低M2型表型標(biāo)志物CD206mRNA（P＜0.05）和TGF?β mRNA的表達(dá)（P＜0.01），使CD16和CD206mRNA的比值（P＜0.05）、iNOS和CD206mRNA的比值（P＜0.01）、iNOS和TGF?βmRNA的比值（P＜0.001）均增加，見表1、2、3。

2.2 VPA對(duì)缺氧BV2表型的作用

與O2-組相比，VPA降低M1型表型標(biāo)志物CD16/32蛋白（P＜0.05）和iNOSmRNA的表達(dá)（P＜0.05），使CD16和CD206mRNA的比值（P＜0.05）、CD32和CD206mRNA的比值（P＜0.05）、iNOS和CD206mRNA的比值（P＜0.05）、iNOS和TGF?β mRNA的比值（P＜0.001）均下降，見表1、3。

2.3 H2對(duì)缺氧BV2表型的作用

與O2-組相比，H2降低M1型表型標(biāo)志物TNF?α的分泌（P＜0.05）、CD16/32蛋白（P＜0.01）、iNOS蛋白（P＜0.01）和iNOSmRNA的表達(dá)（P＜0.01），升高M(jìn)2型表型標(biāo)志物IL?10的分泌（P＜0.01）、CD206mRNA（P＜0.05）和TGF?βmRNA的表達(dá)（P＜0.01），使CD16和CD206mRNA的比值（P＜0.05）、iNOS和CD206mRNA的比值（P＜0.01）、iNOS和TGF?β mRNA的比值（P＜0.001）均下降，見表1、2、3。

表1 VPA和H2對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞BV2 M1型表型標(biāo)志物的影響Tab.1The effect of VPA and H2on M1 markers of hypoxia?treated BV2

表1 VPA和H2對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞BV2 M1型表型標(biāo)志物的影響Tab.1The effect of VPA and H2on M1 markers of hypoxia?treated BV2

1）P＜0.05 vs sham group；2）P＜0.05 vs O2-group.

ItemTNF?α（pg/mL）CD16/32（%）iNOS（%）iNOSmRNA Sham517.10±44.3049.60±0.2681.50±3.11-O2-499.45±47.0344.62±0.8674.30±1.051.52±0.141）O2-/VPA+297.99±115.6842.20±1.362）76.90±17.451.04±0.092）O2-/H2+338.99±16.0038.18±0.292）46.20±2.722）1.18±0.042）

表2 VPA和H2對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞BV2 M2型表型標(biāo)志物的影響Tab.2The effect of VPA and H2on M2 markers of hypoxia?treated BV2

表2 VPA和H2對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞BV2 M2型表型標(biāo)志物的影響Tab.2The effect of VPA and H2on M2 markers of hypoxia?treated BV2

1）P＜0.05 vs sham group；2）P＜0.05 vs O2-group.

ItemIL?10（pg/mL）CD206CD206mRNATGF?βmRNA Sham66.67±10.7031.90±1.22--O2-50.83±18.8229.70±2.820.33±0.041）0.50±0.051）O2-/VPA+132.56±27.7430.92±4.110.41±0.070.55±0.06 O2-/H2+132.56±10.832）34.87±3.760.86±0.072）0.66±0.012）

表3 VPA和H2對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞BV2表型標(biāo)志物M1型和M2型表型標(biāo)志物mRNA比值的影響Tab.3The effect of VPA and H2on the ratio of relative mRNA level between M1 markers and M2 markers in hypoxia?treated BV2n=3）

表3 VPA和H2對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞BV2表型標(biāo)志物M1型和M2型表型標(biāo)志物mRNA比值的影響Tab.3The effect of VPA and H2on the ratio of relative mRNA level between M1 markers and M2 markers in hypoxia?treated BV2n=3）

1）P＜0.05 vs sham group；2）P＜0.05 vs O2-group.

ItemCD16∶CD206CD32∶CD206iNOS∶CD206iNOS∶TGF?β Sham1 275.12±252.913 007.36±825.51431.85±90.430.63±0.02 O2-1 853.15±209.491）3 100.50±355.071 997.84±228.611）1.92±0.031）O2-/VPA+1 143.43±152.632）2 184.14±187.572）1 092.42±81.182）1.18±0.022）O2-/H2+998.28±262.082）2 408.51±688.31598.77±156.482）1.13±0.062）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，缺氧增加小膠質(zhì)細(xì)胞M1型表型標(biāo)志物的表達(dá)，降低M2型表型標(biāo)記物的表達(dá)，增加M1型和M2型表型標(biāo)志物的比值，表明缺氧使小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化。有研究［8?10］也證實(shí)，給予小膠質(zhì)細(xì)胞缺氧刺激可升高其促炎型細(xì)胞因子（TNF?α、IL?1β、IL?6、iNOS）的表達(dá)。然而，本研究未發(fā)現(xiàn)BV2細(xì)胞缺氧2 h M1型標(biāo)志物TNF?α、IL?6和CD16/ 32蛋白增加以及M2型標(biāo)志物IL?10的下降，類似現(xiàn)象在其他研究［9］中也有發(fā)現(xiàn)。原因可能是小膠質(zhì)細(xì)胞的各種表型標(biāo)志物的表達(dá)有其特有的時(shí)相性［11］，而本研究選擇的時(shí)間點(diǎn)可能無法顯示出所有M1、M2表型標(biāo)志物的變化規(guī)律。

缺氧刺激小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，一方面使缺氧誘導(dǎo)因子（hypoxia inducible factor，HIF）1α活化，間接通過NF?κB信號(hào)通路調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄；另一方面，缺氧可通過直接促進(jìn)NF?κB向細(xì)胞核轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子TNF?α、IL?1β、iNOS表達(dá)；此外，NOTCH信號(hào)的活化也可能參與其中［9，12?14］。綜上，缺氧可能通過上述信號(hào)通路誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化。

本研究發(fā)現(xiàn)，VPA降低小膠質(zhì)細(xì)胞M1型表型標(biāo)記物的表達(dá)，降低M1型和M2型表型標(biāo)志物的比值，表明VPA能夠抑制缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化。在真核細(xì)胞中，組蛋白乙?；钦{(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)的重要方式，由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（his?tone acetyltransferase，HAT）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）調(diào)控，二者在生理狀態(tài)下維持機(jī)體的“乙?；€(wěn)態(tài)”［15］。HAT可乙?；M蛋白賴氨酸殘基，使纏繞在組蛋白上的DNA松解，暴露基因序列，使得臨近的轉(zhuǎn)錄因子更容易接近轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)，反之HDAC抑制基因轉(zhuǎn)錄。而組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACI）可以阻止組蛋白去乙?；?，恢復(fù)“乙酰化穩(wěn)態(tài)”，促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)錄，影響包括免疫反應(yīng)在內(nèi)的眾多細(xì)胞信號(hào)通路，有助于改善器官功能和動(dòng)物的生存［15］。在TBI發(fā)生時(shí)，腦細(xì)胞核內(nèi)的組蛋白（尤其是組蛋白H3）乙?；浇档停阴；€(wěn)態(tài)被打破，引發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)［16?17］。VPA作為一種HDACI，既可上調(diào)組蛋白乙酰化水平，還可使細(xì)胞內(nèi)某些非組蛋白乙?；?8］。研究［19］顯示，VPA可誘導(dǎo)NF?κB活化，減少缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡；此外，VPA能夠降低燒傷大鼠小腸黏膜的HIF?1α水平［20］。VPA一方面可能是通過促進(jìn)組蛋白H3乙?；?，上調(diào)熱休克蛋白70表達(dá)，增加Akt磷酸化，從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎型分化［21］，另一方面可能上調(diào)非組蛋白乙?；?，調(diào)節(jié)如NF?κB、JNK、HIF?1α等轉(zhuǎn)錄因子的活化，進(jìn)而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，降低炎性細(xì)胞因子表達(dá)。本研究中VPA可能是通過上述表觀遺傳學(xué)機(jī)制抑制缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞促炎表型的轉(zhuǎn)化。

本研究發(fā)現(xiàn)，H2降低小膠質(zhì)細(xì)胞M1型表型標(biāo)志物的表達(dá)，升高M(jìn)2型標(biāo)志物的表達(dá)，降低M1型和M2型表型標(biāo)志物的比值，表明H2可以抑制缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎表型轉(zhuǎn)化。前期研究［22］表明H2能夠降低百草枯刺激巨噬細(xì)胞TNF?α和IL?6蛋白水平。其他研究者發(fā)現(xiàn)H2可降低小腸移植后巨噬細(xì)胞M1型表型標(biāo)志物TNF?α、IL?1β、IL?6的表達(dá)，并且可抑制LPS誘導(dǎo)的急性炎癥和酵母聚糖引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征；在氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)條件下，iNOS高表達(dá)使一氧化氮生成增加，進(jìn)一步形成過氧亞硝酸根陰離子（ONOO-），使脂質(zhì)和DNA硝化，破壞細(xì)胞膜和DNA［23?24］。H2作為還原劑既可通過直接特異性清除缺血缺氧和炎癥等產(chǎn)生的羥自由基和ONOO-，也可能通過間接降低ONOO-誘導(dǎo)產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子?O?NO2和?S?NO2，以及促進(jìn)Nrf2向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式，促進(jìn)抗氧化酶表達(dá)［25］，從而通過抗氧化作用發(fā)揮抗炎作用，抑制缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎型轉(zhuǎn)化。此外，吸入H2在缺血部位具有良好的組織彌散能力，且不影響生理氧化還原反應(yīng)和腦缺血患者的各項(xiàng)生理指標(biāo)水平［26］，應(yīng)用前景可觀。本研究也為進(jìn)一步探索H2抑制炎癥反應(yīng)的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

盡管本研究發(fā)現(xiàn)缺氧使小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎型轉(zhuǎn)化，但并非所有的表型標(biāo)志物均呈現(xiàn)該變化特點(diǎn)，需要設(shè)計(jì)更多的時(shí)間點(diǎn)檢測表型標(biāo)志物動(dòng)態(tài)變化；既然VPA和H2分別具有抑制炎癥表型的作用，應(yīng)進(jìn)一步將VPA和H2聯(lián)合使用，研究二者是否具有協(xié)同作用。該研究結(jié)果需要體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。有文獻(xiàn)［19］表明，作為非選擇性HDACI的VPA和選擇性的HDACI對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞可能均有作用，二者的比較研究可能進(jìn)一步揭示HDACI對(duì)缺氧小膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)制。

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（編輯于溪）

Effects of Valproic Acid and Molecular Hydrogen on Phenotypes of Microglia Treated with Hypoxia

WU Xizi1，ZENG Renqing1，ZHAO Yangzi1，CHANG Panpan2，F(xiàn)AN Chenling3，WANG Hong3，CHONG Wei1
（1.Department of Emergency Medicine，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；2.Departmen of Neurosurgery，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Departmen of Endocrinology and Metabolism，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effect of VPA and molecular hydrogen（H2）on phenotypes of microglia treated with hypoxia.Methods Mouse hypoxic BV2 microglia were treated with VPA or H2.The levels of phenotypic markers of supernatant and cells were detected by ELISA，flow cytometry and real?time PCR，respectively.ResultsHypoxia significantly increased mRNA level of M1 marker（iNOS）and reduced mRNA levels of M2 markers（CD206andTGF?β）in BV2（P＜0.05）.Besides，the ratio between the mRNA levels of M1 increased（P＜0.05）.VPA significantly reduced protein level（CD16/32）and mRNA production（iNOS）of M1 markers in hypoxia?treated BV2（P＜0.05）.The ratio be?tween the mRNA levels of M1 markers and M2 markers（CD16∶CD206，CD32∶CD206，iNOS∶CD206andiNOS∶TGF?β）were also significantly decreased（P＜0.05）.H2significantly reduced both protein levels（TNF?α，CD16/32 and iNOS）and mRNA production（iNOS）of M1 markers and increased secretion of M2 marker（IL?10）in hypoxia?treated BV2（P＜0.05）.The ratio between the mRNA levels of M1 markers and M2 markers（CD16∶CD206，iNOS∶CD206andiNOS∶TGF?β）were also highly declined（P＜0.05）.ConclusionHypoxia can induce microglial cells toward pro?inflammatory phenotype.Both VPA and H2can inhibit hypoxia?induced inflammatory effect on microglia.

hypoxia；microglia；hydrogen；valproic acid；macrophagic phenotypes

R641

A

0258-4646（2017）01-0036-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.01.008

沈陽市科技計(jì)劃（F15?139?9?24）

吳曦子（1991-），女，碩士研究生.

崇巍，E-mail：chongweixiena@126.com

2016-04-22

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