Tubastatin A Hcl對慢性支氣管哮喘小鼠的治療作用

任媛，蘇新明，李孟露，趙萱，康健

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所，沈陽110001）

Tubastatin A Hcl對慢性支氣管哮喘小鼠的治療作用

任媛，蘇新明，李孟露，趙萱，康健

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病研究所，沈陽110001）

目的探討組蛋白去乙?；?抑制劑（Tubastatin A Hcl）對慢性支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)的影響。方法將BALB/C小鼠分為正常組、哮喘組、地塞米松組和Tubastatin A Hcl組。測定氣道阻力，計數(shù)支氣管肺泡灌洗液（BALF）中細(xì)胞總數(shù)和分類細(xì)胞數(shù)，ELISA檢測白細(xì)胞介素（IL）4、IL?5和轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）β1。HE、AB?PAS和Masson染色觀察氣道炎癥、氣道重塑。免疫組化和Western blotting測定α?平滑肌肌動蛋白（α?SMA）和TGF?β1表達(dá)。結(jié)果藥物治療后氣道阻力降低，BALF中IL?4、IL?5和TGF?β1表達(dá)下降，炎癥細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)減少；肺組織氣道周圍炎癥減輕，杯狀細(xì)胞化生降低，膠原沉積減少，且地塞米松治療效果優(yōu)于Tubastatin A Hcl。藥物治療后肺組織中α?SMA和TGF?β1表達(dá)下降，且Tubastatin A Hcl治療效果略優(yōu)于地塞米松。結(jié)論Tubastatin A Hcl能夠有效緩解慢性支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)，其抗炎效果略差于激素，但在抗氣道重塑方面略優(yōu)于激素治療。

哮喘；組蛋白去乙?；?；氣道炎癥；氣道重塑；氣道高反應(yīng)

近年來，許多研究［1?4］表明廣譜組蛋白去乙?；敢种苿╤istone deacetylase inhibitor，HDACi）在抑制腫瘤細(xì)胞增生的同時，還具有抗炎、抗纖維化和抗血管再生的潛能，這有望為哮喘治療尤其是抑制重塑方面提供新方法。據(jù)文獻(xiàn)［5?8］報道，組蛋白去乙酰化酶（histone deacetylase，HDAC）6作為HDACs家族的重要成員，參與調(diào)控了炎癥反應(yīng)、成纖維細(xì)胞增殖分化、平滑肌細(xì)胞增殖遷移以及膠原分泌等諸多病理過程，在抑制纖維化和血管再生方面表現(xiàn)出了獨特的作用效果。因此，本研究選取特異性HDAC6抑制劑Tubastatin A Hcl，觀察其對慢性支氣管哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)的治療作用。

1 材料與方法

1.1 哮喘模型制備及分組

SPF級6～8周齡雌性BALB/C小鼠，分為正常組、哮喘組、地塞米松組和Tubastatin A Hcl組，每組12只，于實驗第0、7、14天，分別予以哮喘組、地塞米松組和Tubastatin A Hcl組小鼠卵蛋白OVA（20 μg）和氫氧化鋁凝膠（2 mg）致敏。末次致敏7 d后，行OVA（20 mg·mL-1）超聲霧化（3 mL·min-1），30 min/次，3次/周，共8周。每次激發(fā)實驗前30 min，Tubastatin A Hcl（0.5 mg·kg-1）和地塞米松（2.0 mg·mL-1）腹腔注射給藥。正常組小鼠的各處理因素均以生理鹽水代替。

1.2 小鼠氣道反應(yīng)性測定

末次激發(fā)實驗24 h后，應(yīng)用emka動物無創(chuàng)肺功能系統(tǒng)測定氣道阻力。將小鼠放入密閉的體描箱中，給予不同濃度的乙酰甲膽堿（0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg·mL-1）激發(fā)，采集Penh值3 min，用于反應(yīng)氣道阻力。

1.3 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage flu?id，BALF）細(xì)胞計數(shù)與分類計數(shù)

各組小鼠肺功能檢測結(jié)束后，水合氯醛麻醉，行支氣管肺泡灌洗，回收BALF并記錄回吸收量，回吸收量＞1.2 mL為合格標(biāo)本。BALF離心取上清，保存在-80℃冰箱。沉淀細(xì)胞重懸混勻后，在顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞總數(shù)。并進行瑞氏-吉姆薩染色計數(shù)分類細(xì)胞數(shù)，每張涂片計數(shù)200個細(xì)胞，記錄各種細(xì)胞數(shù)目。

1.4 白細(xì)胞介素（interleukin，IL）4、IL?5和轉(zhuǎn)化生長因子（transforminggrowthfactor，TGF）β1細(xì)胞因子測定

ELISA法檢測BALF中IL?4、IL?5和TGF?β1水平。操作方法按試劑盒說明書操作（CUSABIO，USA）。

1.5 肺組織炎癥、膠原沉積和杯狀細(xì)胞觀察

取左側(cè)肺組織，10%甲醛固定，石蠟包埋并切片后，行HE、AB?PAS和Masson染色。采用半定量法評估HE染色中氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤程度：（1）0分，支氣管周圍無炎癥細(xì)胞；（2）1分，少量炎癥細(xì)胞；（3）2分，較多炎癥細(xì)胞，分布不均勻，未聚集成團；（4）3分，大量炎癥細(xì)胞，分布較均勻，少見聚集成團；（5）4分，大量炎癥細(xì)胞，并聚集成團。計數(shù)氣道周圍單位基底膜面積內(nèi)的炎癥細(xì)胞數(shù)。AB?PAS染色結(jié)果行半定量分析觀察氣道上皮杯狀細(xì)胞增生改變及黏液分泌情況，計算杯狀細(xì)胞占上皮細(xì)胞百分比。Masson染色觀察膠原沉積，以固定顏色定義膠原，測定單位長度基底膜的氣道壁膠原沉積面積（膠原面積/基底膜周徑，WAc/Pbm，μm2·μm-1）。以上所有分析每組至少測定20個氣道。

1.6 肺組織中α?平滑肌肌動蛋白（α?smooth muscle actin，α?SMA）和TGF?β1的表達(dá)

1.6.1 α?SMA和TGF?β1半定量檢測：采用SP法行肺組織α?SMA和TGF?β1免疫組織化學(xué)染色。石蠟切片脫蠟水化后，H2O2孵育5 min，微波爐抗原修復(fù)4次，6 min/次，10%BSA室溫封閉30 min，α?SMA和TGF?β1一抗（1∶1 000）4℃孵育過夜。二抗（1∶500）孵育60 min，顯微鏡下控制DAB顯色，復(fù)染，脫水，透明，封片。隨機選取20個直徑為200～400 μm支氣管壁，采用Image?Pro Plus 6.0軟件分析免疫組化結(jié)果。α?SMA結(jié)果以單位長度氣道平滑肌面積（WAc/Pbm，μm2·μm-1）表示，TGF?β1以單位長度氣道上皮陽性信號IOD值（IOD/Pbm）表示。

1.6.2 α?SMA和TGF?β1 Western blotting定量檢測：右側(cè)肺組織30～50 mg加入RIPA裂解液150 μL（含10%PMSF），冰上剪碎，勻漿，超聲粉碎后，4℃12 000g離心30 min。取上清后，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，并變性。選用12%SDS聚丙烯酞胺凝膠電泳（80 V，30 min；120 V，90 min）分離。將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上（0.25 mA，60 min）。脫脂奶粉封閉液中室溫封閉2 h，4℃孵育一抗α?SMA和TGF?β1（1∶1 000）過夜。二抗室溫孵育1 h。ECL發(fā)光法檢測蛋白質(zhì)表達(dá)，UVP成像系統(tǒng)成像，結(jié)果用Gel?Pro analyzer凝膠定量分析軟件分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 Tubastatin A Hcl抑制慢性哮喘氣道高反應(yīng)性

小鼠氣道阻力與乙酰膽堿間具有濃度依賴性。相比于哮喘組，Tubastatin A Hcl治療后，小鼠氣道阻力明顯降低，效果與地塞米松組相似，說明Tu?bastatin A Hcl能夠有效的緩解哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性，見表1。

2.2 Tubastatin A Hcl抑制BALF中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)

表1 不同濃度的乙酰膽堿刺激后各組小鼠的Penh值Tab.1The Penh values of different mice groups following stimulation with acetylcholine

表1 不同濃度的乙酰膽堿刺激后各組小鼠的Penh值Tab.1The Penh values of different mice groups following stimulation with acetylcholine

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs asthma group.

GroupBasic valueAcetylcholine（mg·mL-1）3.1256.2512.52550 Control group0.54±0.030.62±0.030.84±0.041.04±0.081.85±0.172.29±0.09 Asthma group0.82±0.021）1.12±0.051）1.52±0.111）2.75±0.524.54±0.641）6.50±0.281）Dexamethasone group0.65±0.030.71±0.032）0.92±0.062）1.41±0.142.22±0.262.89±0.112）Tubastatin A Hcl group0.61±0.022）0.73±0.042）0.85±0.062）1.20±0.061.71±0.092）2.51±0.212）

哮喘組BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)顯著增加。地塞米松和Tubastatin A Hcl治療能夠顯著減少BALF中細(xì)胞總數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，地塞米松治療效果明顯優(yōu)于Tubastatin A Hcl，2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

2.3 Tubastatin A Hcl抑制BALF中IL?4、IL?5和 TGF?β1水平

表2 BALF中細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計數(shù)（，n=6）Tab.2 The total and differential cell count in BALF（，n=6）

表2 BALF中細(xì)胞總數(shù)及細(xì)胞分類計數(shù)（，n=6）Tab.2 The total and differential cell count in BALF（，n=6）

1）P＜0.05 compared with control group；2）P＜0.05 compared with asthma group；3）P＜0.05 compared with dexamethasone group.

GroupTotal cell numberMacrophagesEosinophilsLymphocytesNeutrophils Control group13.42±4.2811.23±3.920.61±0.280.88±0.300.72±0.26 Asthma group98.04±9.271）25.10±4.201）37.64±6.981）23.57±6.081）11.73±3.431）Dexamethasone group27.67±6.531），2）10.62±2.522）7.16±1.982）5.14±2.042）4.75±1.772）Tubastatin A Hcl group73.75±9.261），2），3）27.70±5.001），3）27.33±4.511），3）11.48±4.321），2）10.02±5.111）

哮喘組小鼠BALF中IL?4、IL?5和TGF?β1水平顯著升高。地塞米松和Tubastatin A Hcl能夠明顯抑制BALF中IL?4、IL?5和TGF?β1水平，且2治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

2.4 Tubastatin A Hcl影響肺組織氣道炎癥和氣道重塑

圖1 BALF中IL?4、IL?5和TGF?β1水平Fig.1The levels of IL?4，IL?5，and TGF?β1 in the BALF

2.4.1 Tubastatin A Hcl抑制哮喘肺組織炎癥水平：HE染色顯示哮喘組小鼠氣道及血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤，氣道上皮脫落，平滑肌增厚，氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤評分和炎癥細(xì)胞數(shù)顯著高于正常小鼠。與哮喘組相比，地塞米松和Tubastatin A Hcl治療后，氣道和血管周圍炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，平滑肌增厚減輕，且地塞米松治療效果略優(yōu)于Tu?bastatin A Hcl，2組間無統(tǒng)計學(xué)差異，見圖2，表3。

2.4.2 Tubastatin A Hcl抑制哮喘氣道黏液高分泌：AB?PAS染色顯示，正常組小鼠氣道上皮PAS陽性細(xì)胞極少；哮喘組PAS陽性染色顯著增加，氣道粘液分泌增多；地塞米松和Tubastatin A Hcl治療后杯狀細(xì)胞化生減輕，且Tubastatin A Hcl治療效果略差于激素治療，但2者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2，表3。

圖2 各組小鼠肺組織病理染色×200Fig.2The pathological staining of lung tissue of mice in each group×200

表3 肺組織病理改變Tab.3The pathological changes of lung tissue

表3 肺組織病理改變Tab.3The pathological changes of lung tissue

1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs asthma group.

GroupThe score of inflammatoryInflammatory cell numbersPAS positive cellsRatio of collagen deposition around cell infiltration（0?4）around the airwayin airway epitheliumthe airway/airway circumference Control group0.40±0.058.80±3.992.04±0.6230.76±8.08 Asthma group3.40±0.681）601.25±186.851）57.21±11.561）111.81±12.401）Dexamethasone group1.55±0.681），2）105.00±31.911），2）20.15±7.241），2）51.79±7.351），2）Tubastatin A Hcl group1.80±0.771），2）169.95±65.801），2）35.21±5.191）76.71±7.251），2）

2.4.3 Tubastatin A Hcl抑制哮喘膠原沉積：Masson染色顯示OVA霧化8周后，哮喘組氣道周圍可見大量膠原沉積，上皮下纖維化增加；相比于哮喘組，地塞米松和Tubastatin A Hcl治療后有效緩解上皮下纖維化，氣道壁周圍膠原沉積，且兩治療組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2，表3。

2.5 Tubastatin A Hcl抑制肺組織中α?SMA和TGF?β1的表達(dá)

2.5.1 Tubastatin A Hcl抑制肺組織中α?SMA的表達(dá)：免疫組化和Western blotting結(jié)果顯示，哮喘小鼠氣道平滑肌層α?SMA表達(dá)顯著增加，平滑肌明顯增厚；地塞米松和Tubastatin A Hcl治療后，α?SMA表達(dá)減少，且Tubastatin A Hcl抑制平滑肌增厚效果明顯優(yōu)于地塞米松組，見圖3A、3C、4A。

2.5.2 Tubastatin A Hcl抑制肺組織中TGF?β1的表達(dá)變化：免疫組化和Western blotting結(jié)果顯示，TGF?β1主要表達(dá)在氣道上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，且在正常小鼠氣道上皮中表達(dá)量極少。OVA霧化8周后哮喘小鼠氣道上皮TGF?β1表達(dá)量顯著增多，地塞米松和Tu?bastatin A Hcl治療后，TGF?β1表達(dá)量顯著減少，且2組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖3B、3D、4B。

圖3 肺組織α?SMA和TGF?β1免疫組化染色×200Fig.3The immunohistochemical staining of α?SMA and TGF?β1 in the lung tissue×200

圖4 肺組織α?SMA和TGF?β1表達(dá)量Fig.4The protein expression of α?SMA and TGF?β1 in the lung tissue

3 討論

支氣管哮喘主要是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的慢性炎性疾病，長期反復(fù)的炎癥刺激，會導(dǎo)致氣道重塑或塌陷，出現(xiàn)不可逆性氣流受限［9］。HDAC6是組蛋白去乙?；讣易逯醒芯孔顬閺V泛的一員，主要分布在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，通過調(diào)控組蛋白和一些非組蛋白底物的乙酰化修飾，參與調(diào)控細(xì)胞的諸多生物過程［10］，如炎癥反應(yīng)，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，損傷修復(fù)等［11］。本研究發(fā)現(xiàn)Tubastatin A Hcl治療后，在一定程度上緩解了哮喘嗜酸粒細(xì)胞性炎癥，表現(xiàn)為BALF中細(xì)胞總數(shù)和EOS數(shù)明顯降低，炎性細(xì)胞因子分泌減少，肺組織中氣道血管周圍炎癥浸潤減輕，黏液分泌以及上皮下纖維化減輕。但在與地塞米松組比較時，發(fā)現(xiàn)其上述效果并不如地塞米松組理想，說明Tubastatin A Hcl在治療哮喘時其抗炎作用是有限的。然而在比較氣道重塑和氣道高反應(yīng)的結(jié)果時，發(fā)現(xiàn)Tubastatin A Hcl組小鼠肺組織中TGF?β1和α?SMA表達(dá)減弱，平滑肌增厚減輕，氣道高反應(yīng)性明顯降低，而且其作用效果反而略優(yōu)于地塞米松組，說明Tubastatin A Hcl在緩解哮喘氣道重塑和氣道高反應(yīng)方面具有獨特的療效。

哮喘氣道重構(gòu)主要與持續(xù)存在的炎癥和反復(fù)的氣道上皮損傷修復(fù)有關(guān)。HDAC6作為Ⅱ類HDACs成員，具有2個高度同源性的催化區(qū)，能夠去乙酰化修飾組蛋白的同時，還能夠去乙酰化修飾許多非組蛋白底物，如α?tubulin、HSP90和皮質(zhì)肌動蛋白等。研究［12］表明抑制HDAC6表達(dá)，能夠促使HSP90高乙酰化修飾，促使HSP90客戶蛋白失活并快速降解。最新研究［13?14］發(fā)現(xiàn)抑制HSP90，能夠通過多個環(huán)節(jié)抑制NF?κB介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，同時抑制TGF?β介導(dǎo)的膠原沉積、成纖維細(xì)胞分化、以及平滑肌細(xì)胞增殖等重塑性過程［15?17］。而既往研究［18］也已經(jīng)證實，HDAC6與HDAC4和HDAC8一起調(diào)節(jié)TGF?β1介導(dǎo)的平滑肌α?SMA的表達(dá)，參與平滑肌細(xì)胞形態(tài)維持和組織修復(fù)。因此推測HDAC6特異性抑制劑Tubastatin A Hcl緩解慢性哮喘小鼠氣道炎癥、氣道重塑和氣道高反應(yīng)的作用，很可能與HDAC6特異性抑制劑促使其底物蛋白HSP90高乙?；揎?，進而抑制哮喘致病過程中NF?κB相關(guān)的炎癥反應(yīng)的激活和轉(zhuǎn)錄，以及TGF?β介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞增殖分化、膠原蛋白分泌、平滑肌細(xì)胞增殖等的重塑性改變相關(guān)，而為了驗證這一推測仍需進一步深入研究。值得注意的是，Tubastatin A Hcl治療哮喘可能并不是單純的通過抗炎作用實現(xiàn)的，其在緩解哮喘氣道重塑方面的療效有望打破目前哮喘激素治療的不足，為哮喘的臨床治療提供新的靶向藥物。

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（編輯于溪）

Therapeutic Effects of Tubastatin A Hcl in Chronic Murine Asthma Model

REN Yuan，SU Xinming，LI Menglu，ZHAO Xuan，KANG Jian
（Institute of Respiratory Disease，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the effects of Tubastatin A Hcl，a selective HDAC6 inhibitor，on the development of chronic asthmatic mice with airway inflammation，airway remodeling and airway hyperresponsiveness.MethodsBALB/C mice were randomly divided into control group，asthma group，dexamethasone group and Tubastatin A Hcl group.The airway resistance，total cells and different cells in BALF，IL?4，IL?5，TGF?β1 were detected by ELISA.HE、AB?PAS and Masson trichrome staining were carried out to assess the airway inflammation and remodeling.Immuno?histochemical staining and western blotting were adopted to determine the expression of α?SMA and TGF?β1.ResultsAfter drugs treatment，air?way resistance decreased，and levels of IL?4，IL?5，TGF?β1，total inflammatory cells and eosinophils in BALF were relieved.Meanwhile，inflamma?tory cells infiltration，goblet cells metaplasia and collagen deposition in lung tissue were also reduced，but all of above the effects of dexamethasone were better than Tubastatin A Hcl.The expression of α?SMA and TGF?β1 in the lung tissue decreased significantly after treatment，in which Tu?bastatin A Hcl were slightly better than dexamethasone treatment.ConclusionTubastatin A Hcl can effectively relieve airway inflammation，air?way remodeling and airway hyperresponsiveness in chronic asthmatic mice，but its effect of anti?inflammatory is worse than dexamethasone treat?ment，while it is better than dexamethasone in the effect of relief airway remodeling.

asthma；histone deacetylase；airway inflammation；airway remodeling；airway hyperresponsiveness

R562.25

A

0258-4646（2017）01-0017-07

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.01.004

國家自然科學(xué)基金（81300024）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（2013225049）；遼寧省教育廳創(chuàng)新團隊（LT2013015）

任媛（1989-），女，博士研究生.

蘇新明，E-mail：xinming_s@163.com

2016-06-29

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