小鼠SPINK5基因重組過表達腺病毒載體構建及其對特應性皮炎小鼠模型皮損療效的研究

狄正鴻，許靜，侯殿東，紀蓮，劉曉梅，孫魯寧

（中國醫(yī)科大學1.附屬盛京醫(yī)院皮膚科，沈陽110004；2.附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽110001；3.附屬盛京醫(yī)院實驗中心，沈陽110004；4.基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，沈陽110122）

小鼠SPINK5基因重組過表達腺病毒載體構建及其對特應性皮炎小鼠模型皮損療效的研究

狄正鴻1，許靜1，侯殿東2，紀蓮3，劉曉梅3，孫魯寧4

（中國醫(yī)科大學1.附屬盛京醫(yī)院皮膚科，沈陽110004；2.附屬第一醫(yī)院皮膚科，沈陽110001；3.附屬盛京醫(yī)院實驗中心，沈陽110004；4.基礎醫(yī)學院病理生理學教研室，沈陽110122）

目的構建表達小鼠SPINK5基因的重組腺病毒載體，觀察其對特應性皮炎小鼠模型的治療效果。方法采用DNA重組技術，將攜帶小鼠SPINK5基因的腺病毒穿梭質粒與攜帶腺病毒基因組的包裝質粒共轉染HEK293細胞，產生重組腺病毒。采用卵清蛋白，通過腹腔，皮下注射系統(tǒng)致敏結合皮膚局部外涂局部致敏Balb/c小鼠，建立特應性皮炎小鼠模型。將攜帶SPINK5基因的腺病毒載體注射至特應性皮炎小鼠模型皮損內，觀測其對特應性皮炎小鼠模型的治療效應。結果成功構建了表達小鼠SPINK5基因的重組腺病毒載體及小鼠特應性皮炎模型，該病毒載體注射于特應性皮炎小鼠模型皮損內，治療2周可明顯減輕皮損處潮紅，水腫及炎性反應。皮損處病理檢測顯示，與模型對照相比較，皮損厚度，炎性細胞浸潤明顯改善。結論SPINK5基因治療對特應性皮炎小鼠模型具有明顯的治療效果。SPINK5基因產物局部外用有望用于特應性皮炎的治療。

SPINK5基因；重組腺病毒載體；特應性皮炎；小鼠模型

特應性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種好發(fā)于嬰幼兒并可延續(xù)至成人的慢性瘙癢性皮膚病，生命早期患有AD可進一步啟動特應性進程，引發(fā)哮喘、過敏性鼻炎等其他過敏性疾病。近年來AD的發(fā)病率在全球呈迅速上升趨勢，可累及20%的兒童及3%的成人［1］。AD發(fā)病與皮膚屏障功能障礙密切相關，絲聚合蛋白（filaggrin，F(xiàn)LG）是維持皮膚屏障結構及功能完整性的關鍵蛋白［2］。而由絲氨酸蛋白酶抑制劑Kazal 5型基因（serine protease inhibitor Ka?zal type 5，SPINK5）編碼的淋巴上皮Kazal型相關抑制劑（lympho?epithelial Kazal?type?related inhibitor，LEKTI）是FLG正常表達代謝的重要調控通路［3］。既往研究［4］表明AD急性及慢性皮損中FLG及LEK?TI表達均明顯下降，AD異常免疫反應模式可降低體外培養(yǎng)的人角質形成細胞LEKTI的表達，增強包括絲氨酸蛋白酶在內的多種蛋白酶的表達，從而干擾FLG表達，顯示了LEKTI在AD發(fā)病中具有保護作用。本研究擬構建表達小鼠LEKTI的腺病毒載體，將攜帶小鼠SPINK5基因的腺病毒穿梭質粒與攜帶腺病毒基因組的包裝質粒共轉染HEK293細胞，通過Cre/loxP重組酶系統(tǒng)的作用產生重組腺病毒。構建小鼠AD模型，并觀察SPINK5基因重組過表達腺病毒對小鼠AD模型皮損的療效，為進一步用于人類研究建立理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

6周齡Balb/c雌性小鼠（北京華阜康公司），腺病毒載體GV314（CMV?MCS?3FLAG?SV40?EGFP，克隆位點BamHⅠ/AgeⅠ，吉凱基因化學技術有限公司），大腸桿菌菌株DH5α（吉凱基因化學技術有限公司），限制性內切酶BamHⅠ、AgeⅠ（美國NEB公司），HEK293細胞（美國ATCC公司），輔助包裝質粒PBHG（中國Microbix公司），In?Fusion?PCR Clon?ing Kit（美國Clontech公司），Taq聚合酶（中國Sino?Bio公司），Plasmid抽提Kit（美國Promega公司），EndoFree midi Plasmid Kit（中國Tiangen公司），胎牛血清FBS（美國GIB公司），DMEM培養(yǎng)基（美國GIB公司），LB液體培養(yǎng)基（美國ATCC公司），Lipo?fectamine 2000轉染試劑（美國Invitrogen公司），PrimeSTAR HS DNA聚合酶（日本TaKaRa公司），Adeno?X?Virus Purification Kit（BD Biosciences，美國Clontech公司），明礬、卵清蛋白（ovalbumin，OVA）（美國Sigma公司），引物由上海捷瑞生物合成，測序由上海吉凱基因化學技術有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 小鼠SPINK5基因克隆及過表達腺病毒載體構建：根據(jù)小鼠SPINK5（NM?001081180）基因cDNA的序列，設計合成含有同源重組序列及酶切位點的擴增引物序列：SPINK5?P1，AGGTCGACTCTAGAG GATCCCGCCACCATGAAGACAGCCACGGTGCCAA TGCTTCTG；SPINK5?P2，CCTTGTAGTCCATACCG GTTTGCATCATTTTTTCAGATGCAGGTGTGCC。

PCR反應擴增SPINK5DNA片段，50 μL反應體系如下：ddH2O 32.5 μL；5×PS Buffer 10 μL；dNTP Mix 4 μL；上下游擴增引物（10 μmol）各1 μL；模板（10 ng/μL），1 μL；PrimeSTAR HS DNA聚合酶0.5 μL。利用限制性內切酶BamHⅠ，AgeⅠ消化腺病毒載體GV314獲得線性化載體，參照GV314載體說明書構建反應體系，完成GV314線性載體與SPINK5基因片段的環(huán)化。將此重組產物加入到含有大腸桿菌DH5α的LB液體培養(yǎng)基菌液中，在培養(yǎng)板上恒溫37℃培養(yǎng)12 h。取其單克隆菌落進行PCR鑒定。鑒定引物序列如下：P1，AAACAAACAAGAGC GATAAGG；P2，CCTTATAGTCCTTATCATCGTC，對陽性克隆進行測序。在LB液體培養(yǎng)基中，37℃擴大培養(yǎng)測序正確的菌液。按照天根無內毒素質粒試劑盒操作步驟進行質粒抽提，用于下游病毒包裝。

1.2.2 腺病毒包裝與滴度檢測：采用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)，將含有SPINK5基因的GV314載體重組產物，輔助包裝質粒PBHG（該質粒含有Cre/loxP重組酶系統(tǒng)）加入Lipofectamine 2000稀釋混合形成DNA/Lipofectamine2000轉染復合物；將此轉染復合液滴加至HEK293細胞培養(yǎng)液中，利用Cre?loxP重組酶切割系統(tǒng)，產生攜帶SPINK5基因的重組腺病毒載體。轉染后15 d，待50%HEK 293細胞脫壁飄落，細胞顯示典型細胞病變效應，離心收集細胞并重懸于DMEM液中，-70℃/37℃反復凍融3次，離心收集病毒上清，采用終點稀釋法進行滴度測定，于-70℃保存。

1.2.3 特應性皮炎小鼠模型建立：采用6周齡Balb/c雌性小鼠，改良OVA致敏方法［5?6］。（1）第1天（系統(tǒng)致敏）：小鼠腹腔內注射200 μg/mL OVA溶液0.5 mL（含5%明礬佐劑）。（2）第6天（系統(tǒng)致敏）：小鼠背部皮下注射100 μg/mL OVA溶液0.5 mL。（3）第18天（第1次局部致敏）：7%水合氯醛，1 mL腹腔注射麻醉后，剃除背部毛發(fā)，用毛刷反復刺激背部皮膚，使之有微小均勻裂口。取1 000 μg/mL OVA溶液100 μL置于1 cm2無菌紗布上，貼于小鼠背部皮膚，采用保鮮膜覆蓋藥布防止藥物揮發(fā)，外纏黏性彈力繃帶，每天更換，持續(xù)1周。（4）第39天（第2次局部致敏）：重復第18天局部OVA給藥方法，持續(xù)1周。（5）第60天（第3次局部致敏）：重復第18天局部OVA給藥方法，持續(xù)1周。

1.2.4 AD小鼠模型皮損內注射SPINK5腺病毒過表達載體：皮損處皮內注射病毒載體，每只病毒質粒總量3.5×108PFU，分多點均勻注射，注射間距0.5 cm。觀測其對AD小鼠模型的療效。分組：正常對照組、模型空白對照組、模型10 d空白對照組、模型17 d空白對照組、SPINK5腺病毒過表達載體皮損內局部注射后10 d組、SPINK5腺病毒過表達載體皮損內局部注射后17 d組，每組3只。

1.2.5 皮損變化及不良反應評價：分別于上述分組時間評價皮損變化，皮膚取材，記錄皮損外觀變化，皮損組織病理HE染色，光學顯微鏡下觀察皮損處厚度及炎癥細胞浸潤強度。評價SPINK5腺病毒過表達載體對AD小鼠模型的大體及組織病理學影響。觀察皮內注射病毒載體后小鼠活動、飲食及體質量變化。

2 結果

2.1 SPINK5基因的克隆合成

成功克隆合成小鼠SPINK5基因片段，該DNA片段長度為3 095 bp。PCR產物經1%瓊脂糖電泳可清晰顯示，見圖1。

2.2 SPINK5基因腺病毒載體構建及測定結果

圖1 克隆合成小鼠SPINK5基因DNA片段Fig.1PCR produce fragment of mice SPINK5 gene

GV314載體與SPINK5基因片段環(huán)化后，在含有大腸桿菌DH5α的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，將獲得的單克隆菌落經PCR鑒定，鑒定產物經1%瓊脂糖電泳，可見到小鼠SPINK5基因1、2、3、5、7、8號轉化子清晰表達，見圖2。

2.3 SPINK5基因重組腺病毒包裝及病毒濃度測定

圖2 經瓊脂糖電泳鑒定GV314線性載體與SPINK5基因片段重組產物Fig.2Agarose electrophoresis of recombination product of GV314 and mouse SPINK5 gene sequence

SPINK5基因重組腺病毒載體轉染HEK293細胞36 h，細胞內即可觀察到明顯的熒光信號，表明目的質粒轉染及熒光標記基因表達正常，見圖3。濃縮收集病毒質粒經檢測濃度為1E+10 PFU/mL

2.4 AD小鼠模型構建

經系統(tǒng)及局部致敏過程后，小鼠在第1次局部激發(fā)致敏后具有明顯搔抓行為，背部可出現(xiàn)明顯紅斑滲出結痂，第2、3次局部激發(fā)致敏后背部皮膚逐漸增厚，局部潮紅，伴有脫屑，皮損可持續(xù)存在3～4周。表現(xiàn)為從急性皮損逐漸向慢性皮損的演變的過程。正常對照小鼠及AD模型小鼠背部皮損情況見圖4A、4B。

2.5 AD小鼠模型經皮損內注射SPINK5腺病毒過表達載體后皮損變化（圖4）

經皮損內注射SPINK5腺病毒過表達載體后10 d、17 d，與模型空白對照比較，使用腺病毒載體小鼠體質量無明顯改變，未見局部破潰紅腫等不良反應，飲食活動未見明顯改變，治療組與對照組比較體質量未見明顯差異。皮損局部潮紅明顯減輕，皮損厚度變薄。皮損處組織病理HE染色下觀察AD小鼠模型可見表皮細胞增厚，細胞間水腫，真皮內淋巴細胞及嗜酸性粒細胞明顯浸潤。經皮損內注射SPINK5腺病毒1～2周后，與模型對照比較皮損處厚度明顯減小，浸潤炎性細胞數(shù)目明顯減少，見圖5。

圖3 SPINK5基因重組腺病毒載體轉染HEK293細胞×200Fig.3HEK 293 cells transformed with recombinant adenovirus vector containing mouse SPINK5 gene×200

圖4 AD小鼠模型皮損內注射SPINK5基因腺病毒過表達載體治療后皮損局部改變Fig.4The effect of SPINK5 gene recombinant adenovirus on the lesions of atopic dermatitis mice model

3 討論

目前，AD皮損處外用藥治療以糖皮質激素、鈣調磷酸酶抑制劑為主。糖皮質類固醇激素具有導致皮膚萎縮，毛細血管擴張，色素改變等不良反應；鈣調磷酸酶抑制劑長期外用具有潛在的致癌風險，因而不能長期使用。FLG蛋白是維持皮膚正常屏障結構及功能的關鍵性蛋白。LEKTI在表皮分化的過程中通過抑制性調節(jié)Matriptase、CAP1、caspase14、SCCE、SCTE等多種蛋白酶的活性而參與FLG代謝及皮膚屏障功能的維持與平衡的多個環(huán)節(jié)。LEKTI主要通過抑制Matriptase、CAP1、caspase14而抑制FLG的過度降解；還可通過抑制SCCE、SCTE活性而阻止角質形成細胞（keratinocyte，KC）過早成熟所導致的過度脫屑，因此，LEKTI是維持表皮屏障及皮膚外觀的關鍵性蛋白酶［7］。LEKTI低表達可繼發(fā)SC?CE、SCTE酶活性增高，加重炎癥反應及過度脫屑，典型病例是在基因缺陷性皮膚病Netherton綜合征中，由LEKTI蛋白編碼基因SPINK5缺陷導致AD樣皮損及皮膚過度脫屑，套疊性脆發(fā)癥［8］。研究［4］表明AD皮損中FLG表達普遍下降，并伴有多種蛋白酶表達增高，而LEKTI表達明顯下降。近年的研究［9］表明SPINK5也是AD的易感基因之一，AD患者皮損中LEKTI及SPs表達普遍異常，但SPINK5基因的無義變異在AD患者中并非普遍存在。盡管FLG異常表達是AD的重要發(fā)病機制，然而由于ProFLG是400×103的超大分子量蛋白，包含10～12個高度相似，但又有細微差別的FLG重復片段，且在不同種族中存在遺傳異質性等特征，因此針對FLG進行基因治療目前尚難以實現(xiàn)。而LEKTI作為FLG表達代謝的核心性調控蛋白，結構簡單，是適合基因治療的理想分子。最近，有研究［10］表明人SPINK5基因重組腺病毒可增高Netherton綜合征患者體外培養(yǎng)的KC細胞SPINK5 mRNA的表達。顯示LEKTI在AD治療方面具有令人期待的藥用前景。目前缺乏SPINK5持續(xù)表達的載體，并且對人體的其他影響不明，因此需要一個持續(xù)表達的LEKTI蛋白系統(tǒng)。

圖5 HE染色顯示皮損內注射SPINK5腺病毒過表達載體對AD小鼠模型的療效×200Fig.5HE staining of AD mice model with SPINK5 gene recombinant adenovirus×200

OVA致敏小鼠AD模型是目前廣泛應用的AD小鼠模型之一，其外周血免疫細胞及細胞因子，皮損局部病理及免疫反應與AD患者復合度高。其皮損處IL?4、IL?5增高，IFN?γ隨病程延長而增高，呈現(xiàn)出由Th2向Th1型Th2型混合免疫反應轉化，類似于AD慢性皮損［5?6］。筆者通過改良的OVA致敏方法建立小鼠AD動物模型，造模成功率高，臨床及病理顯示了從急性皮損逐漸向慢性皮損演變的過程。

本研究構建了SPINK5基因表達腺病毒載體，腺病毒載體對非分裂期及分裂期細胞均具感染力，其通過受體介導的內吞作用進入宿主細胞，可將腺病毒基因轉移至細胞核內染色體外，但不整合入宿主細胞基因組，是目前較為安全的基因治療載體。本研究結果表明小鼠皮損內注射整合了SPINK5基因的腺病毒載體，小鼠飲食睡眠正常，無體質量下降、死亡等表現(xiàn)。皮損內注射SPINK5基因表達腺病毒質粒后與模型對照比較，治療2周可明顯減輕皮損處潮紅、水腫及炎癥反應。皮損處病理與模型對照比較，皮損厚度、炎癥細胞浸潤明顯改善。

LEKTI分子量相對較小，皮膚外用基因治療具有基因導入方便，劑量易于調控等特點，推測蛋白酶抑制劑LEKTI有望成為未來AD藥物治療的重要靶點，局部使用LEKTI生物活性片段具有高度藥理前途，開發(fā)LEKTI類藥物有望經AD治療帶來新的突破。

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（編輯武玉欣）

Construction of Recombinant Adenovirus Vector Expressing Mouse SPINK5 Gene and Its Curative Effect on Skin Lesions in Atopic Dermatitis Mice

DI Zhenghong1，XU Jing1，HOU Diandong2，JI Lian3，LIU Xiaomei3，SUN Luning4
（1.Department of Dermatology，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；2.Department of Dermatology，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China；3.Experiment Center，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China；4.Department of Pathophysiology，College of Basic Medical Science，China Medical University，Shenyang 110122，China）

ObjectiveTo construct a recombinant adenovirus vector expressing mouseSPINK5gene，and observe its curative effect on the skin lesions in atopic dermatitis mice model.MethodsBy recombining DNA technology，the sequence of mouseSPINK5gene was cloned into adeno?virus shuttle plasmid.Then it was transformed into HEK 293 cells with the adenoviral backbone plasmid to obtain the recombinant adenovirus.A mouse model of atopic dermatitis was established by system and local sensitization of Balb/c mice with ovalbumin.The effect of recombinant adeno?virus on the lesions of atopic dermatitis mice model was observed.ResultsTheSPINK5over?expressing adenovirus vector and atopic dermatitis mice model were successfully constructed.After 2 weeks of adenovirus?mediatedSPINK5gene intracutaneous injection，the redness and edema of lesions of AD model mice were obvious relieved.The pathological detection indicated that epidermal thickness and prickle cell layer，inflammatory cell infiltration significant decreased accompanied with the model blank control.ConclusionThe adenovirus?mediatedSPINK5gene had signifi?cant therapeutic effect to the atopic dermatitis mice model，which provided a laboratory basis of application ofSPINK5gene product to therapy atopic dermatitis.

SPINK5gene；recombinant adenovirus vector；atopic dermatitis；mice model

R751.05

A

0258-4646（2017）01-0011-06

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.01.003

國家自然科學基金（81301366）；遼寧省自然科學基金（2013021004，2014021056）

狄正鴻（1973-），女，副教授，博士. E-mail：dizh2005@163.com

2016-05-07

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