Toll樣受體4在百草枯中毒急性肺損傷中的作用

劉偉，董雪松，劉曉偉，陳昕明，劉煥植，劉志

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽110001）

Toll樣受體4在百草枯中毒急性肺損傷中的作用

劉偉，董雪松，劉曉偉，陳昕明，劉煥植，劉志

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院急診科，沈陽110001）

目的探討Toll樣受體4（TLR4）在百草枯（PQ）中毒急性肺損傷中的作用及相關(guān)機制。方法野生小鼠（C57BL/6J）和TLR4基因敲除小鼠（C57BL/10ScN）各20只，隨機分成野生小鼠對照（WT）組、WT+PQ組，TLR4基因敲除小鼠對照（TLR4?ko）組、TLR4?ko+PQ組，每組10只。腹腔注射PQ，24 h后處死小鼠，觀察各組小鼠肺臟病理改變（HE染色和電鏡）、血氣分析結(jié)果、肺臟TLR4和炎癥介質(zhì)的表達情況。結(jié)果腹腔注射PQ 24 h后野生小鼠出現(xiàn)明顯急性肺損傷表現(xiàn)，包括血氣氧分壓明顯下降、肺臟損傷急性期病理改變、TLR4表達明顯升高（伴隨肺臟TNF?α、IL?1β和NF?κB p65表達明顯升高）；而TLR4基因敲除小鼠在接觸PQ后肺損傷情況明顯減輕，WT+PQ組和TLR4?ko+PQ組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論TLR4是PQ中毒急性肺損傷的重要介質(zhì)，阻斷TLR4信號通路對PQ中毒所致肺損傷具有保護作用。

百草枯；中毒；肺損傷；Toll樣受體4；炎癥

百草枯（paraquat，PQ）是世界上應(yīng)用廣泛的有機雜環(huán)類除草劑，中毒后病死率高達60%～80%［1］。PQ經(jīng)胃腸道吸收入血后主要聚集于肺臟，肺臟PQ濃度可達血液的10～90倍［2］。肺臟是PQ中毒后損傷的主要靶器官，早期表現(xiàn)為明顯肺水腫、肺出血等急性肺損傷（acute lung injury，ALI）表現(xiàn)，后期發(fā)展為不可逆的肺間質(zhì)纖維化而導(dǎo)致死亡［3］。然而目前PQ中毒的機制尚未完全明了，亦無有效拮抗藥物，因此對于PQ中毒肺損傷的研究具有重要意義。

Toll樣受體4（Toll?like receptor 4，TLR4）是一種細胞內(nèi)源免疫的跨膜受體和病原識別受體，在調(diào)節(jié)急性炎性反應(yīng)、細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和凋亡過程發(fā)揮重要作用，它可以介導(dǎo)腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor?α，TNF?α）、白細胞介素6（interleukin?6，IL?6）和白細胞介素1β（interleukin?1β，IL?1β）等炎癥介質(zhì)釋放并參與炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用［4］。已有研究顯示在脂多糖（lipopoly?saccharides，LPS）或其他非炎性細胞因子誘導(dǎo)的ALI過程中，TLR4通過促進炎癥介質(zhì)釋放而導(dǎo)致肺損傷加重［5］。本研究利用TLR4基因敲除小鼠研究TLR4在PQ中毒肺損傷過程中的作用及相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

野生雄性小鼠（C57BL/6J，8～10周齡，18～22 g）和TLR4基因敲除雄性小鼠（C57BL/10ScN）均購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物部，飼養(yǎng)條件相同，恒溫恒濕，人工照明12 h/d，24 h自由進食水。整個實驗過程遵從動物實驗倫理委員會要求進行。

野生小鼠20只，隨機分成2組：對照（WT）組、WT+PQ組，每組10只；TLR4基因敲除小鼠20只，隨機分成2組：對照（TLR4?ko）組、TLR4?ko+PQ組，每組10只。PQ中毒組小鼠經(jīng)腹腔注射PQ（40 mg/kg，美國Sigma公司），對照組腹腔注射等量生理鹽水。各組小鼠于腹腔注射24 h后經(jīng)深度麻醉并腹主動脈放血致死，取0.2 mL動脈血行血氣分析，開胸取出肺組織，左肺上葉用2.5%戊二醛固定，留作電鏡分析，左肺下葉4℃4%多聚甲醛固定，留作HE染色分析，右肺上葉和下葉取出后立即-80℃冷凍，留作Western blotting、實時PCR以及ELISA檢測。

1.2 方法

1.2.1 血氣分析：抽取0.2 mL動脈血后，立即于急診中毒室進行血氣分析（AVLOMNI血氣分析儀，瑞士AVL公司），記錄pH值、PO2（mmHg）和PCO2（mmHg）結(jié)果。

1.2.2 HE染色：肺組織以4%多聚甲醛浸泡24 h以上，常規(guī)脫水、包埋，切成4 μm切片，用蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察肺組織病理改變。

1.2.3 電鏡觀察：肺組織用2.5%戊二醛固定，經(jīng)過脫水、環(huán)氧樹脂包埋、超薄切片，透射電鏡（JEM?1200EX）下觀察細胞器的變化。

1.2.4 實時PCR檢測：取-80℃冷凍肺組織（20 mg），總RNA提取使用RNAiso Reagent（寶信生物科技有限公司），操作嚴格按照說明進行。在260 nm處用分光光度計對總RNA進行定量。反轉(zhuǎn)錄使用SYBR PrimeScript RT?PCR試劑盒（寶信生物科技有限公司）。得到的RT反應(yīng)液加入到下一步的實時熒光PCR反應(yīng)體系中。實時熒光PCR分析使用7500型實時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國Applied Biosystems公司）。引物如下：TLR4，上游引物5’?CAGCAAAG TCCCTGATGACA?3’，下游引物5’?CCTGGGGAAAA ACTCTGGAT?3’；GAPDH，上游引物5’?TGTGTCCG TCGTGGATCTGA?3’，下游引物5’?TTGCTGTTGAA GTCGCAGGAG?3’。TLR4mRNA擴增需要在94℃預(yù)變性30 s，進行40個PCR循環(huán)（95℃5 s，60℃60 s），72℃延伸90 s。每個樣本重復(fù)測定3次，取3次測定的Ct平均值作為該樣本的Ct值。GAPDH作為看家基因，各組均進行檢測。采用相對定量法計算TLR4在各組的表達。

1.2.5 Western blotting檢測：凍存肺組織20 mg，RI?PA裂解液勻漿化，收集上清液，使用蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）檢測上清液蛋白濃度。樣品被稀釋到合適的濃度，每孔20 μg上樣量，12%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜，封閉，用一抗TLR4抗體（1∶200，美國圣克魯斯生物技術(shù)公司）孵育，4℃，60 min，洗滌液清洗，加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗（1∶200，武漢博士德生物工程有限公司），使用加強的化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國PIERCE公司）檢測TLR4蛋白表達。GAPDH作為內(nèi)對照。

1.2.6 ELISA檢測TNF?α、IL?1β和NF?κB p65在肺組織的表達：將凍存的肺組織用生理鹽水沖洗后在冰上勻漿，3 000g離心15 min（4℃），取上清，按照試劑盒操作說明檢測肺組織中TNF?α、IL?1β和核因子κB p65（nuclear factor?κB p65，NF?κB p65）的表達（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 動脈血氣分析

結(jié)果如表1所示，與WT組比較，TLR4?ko組小鼠pH、PaO2、PaCO2值無明顯改變（P＞0.05）。PQ腹腔注射24 h后WT+PQ組和TLR4?ko+PQ組的PaO2和PaCO2與WT組比較均明顯下降（P＜0.05）；但TLR4?ko+PQ組PaO2和PaCO2降低情況較WT+PQ組明顯改善（P＜0.05），4組中pH值比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

2.2 光鏡下病理改變

HE染色結(jié)果顯示，WT組肺泡結(jié)構(gòu)完整，未見明顯充血、中性粒細胞浸潤和間質(zhì)水腫；TLR4?ko組和WT組比較肺臟病理結(jié)構(gòu)無明顯變化；WT+PQ組肺臟呈現(xiàn)明顯炎癥細胞浸潤、肺泡壁破壞、肺泡和肺間質(zhì)出血及肺泡壁增厚的急性肺損傷的病理改變；而TLR4?ko+PQ組小鼠在接觸PQ后肺臟病理損傷情況明顯改善。見圖1。

圖1 各組小鼠肺臟HE染色×200Fig.1HE staining of lung sections in different groups rats×200

2.3 電鏡下肺組織超微結(jié)構(gòu)（Ⅱ型肺泡上皮細胞）

WT組和TLR4?ko組電鏡下Ⅱ型肺泡上皮細胞的超微結(jié)構(gòu)無明顯差異，均表現(xiàn)為胞核形狀大致正常，胞質(zhì)內(nèi)線粒體較多，嗜鋨小體內(nèi)可見較多板層結(jié)構(gòu)。WT+PQ組胞核形狀不規(guī)則，核內(nèi)大量異染色質(zhì)凝聚、邊集，線粒體嵴減少、外膜破壞，嗜鋨小體及板層結(jié)構(gòu)減少，核膜水腫。TLR4?ko+PQ組上述細胞器的損傷情況較WT+PQ組明顯減輕。見圖2。

圖2 各組小鼠肺臟超微結(jié)構(gòu)×6 000Fig.2Electron microscope of lung sections in different groups rats×6 000

2.4 PQ中毒后TLR4在肺組織的表達

TLR4蛋白和mRNA水平，WT+PQ組（1.13± 0.06、1.37±0.11）均較WT組（0.69±0.05、0.86±0.08）表達明顯增高（P＜0.05），而在TLR4?ko組和TLR4? ko+PQ均無表達。見圖3。

圖3 各組小鼠TLR4蛋白表達Fig.3TLR4 protein expression detected by Western blotting

2.5 肺臟炎癥介質(zhì)的表達

ELISA結(jié)果顯示：與WT組比較，WT+PQ組小鼠肺組織中TNF?α、IL?1β和NF?κB p65均明顯升高（P＜0.05）；TLR4?ko組炎癥介質(zhì)表達無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；而TLR4+PQ組炎癥介質(zhì)表達較WT+PQ組明顯下降（P＜0.05）。見表2。

3 討論

近年來對PQ中毒肺損傷的研究越來越多，但仍缺乏有效的治療方法［6?7］。PQ中毒成為死亡率最高的農(nóng)藥中毒事件。ALI和后續(xù)的肺纖維化是PQ中毒后最嚴重的并發(fā)癥，也是影響預(yù)后的關(guān)鍵因素［8］。本研究應(yīng)用WT和TLR4?ko小鼠探討PQ中毒早期肺損傷改變發(fā)現(xiàn)，PQ注射24 h后，WT小鼠出現(xiàn)明顯的肺臟病理學(xué)改變（光鏡和電鏡），并伴隨明顯的PaO2和PaCO2下降，這與在臨床上觀察到的PQ中毒患者早期出現(xiàn)氣促、呼吸困難的臨床表現(xiàn)相符。TLR4基因敲除后小鼠在接觸PQ后，上述肺損傷情況明顯改善，提示TLR4參與了PQ中毒肺損傷的過程。

表2 各組小鼠肺臟炎癥介質(zhì)表達比較Tab.2Comparison of inflammation mediator expression in lung tissues

表2 各組小鼠肺臟炎癥介質(zhì)表達比較Tab.2Comparison of inflammation mediator expression in lung tissues

1）P＜0.05 vs WT group；2）P＜0.05 vs WT+PQ group.

GroupnTNF?αIL?1βNF?κB p65 WT1069.35±4.41238.43±10.2648.19±4.59 TLR4?ko1070.11±4.35236.58±11.9747.93±4.85 WT+PQ10148.59±7.831）423.67±19.641）92.49±5.781）TLR4?ko+PQ10106.64±6.122）334.51±15.372）58.25±5.232）

TLR4作為細胞的跨膜受體，被證實在炎癥誘導(dǎo)的ALI中發(fā)揮病原識別受體的功能，參與肺損傷的發(fā)生與進展［9］。外源性配基（LPS）可以激活TLR4通路［10］，同時細胞損傷壞死后產(chǎn)生的內(nèi)源性配基（HSP60和HSP70）亦可激活TLR4信號通路［11］。激活的TLR4通過髓樣分化蛋白88（myeloid differentia?tion 88，MyD88）依賴性途徑，介導(dǎo)炎性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與炎性反應(yīng)，以誘導(dǎo)下游的NF?κB和絲裂原活化蛋白激酶的早期相活化為特征，主要介導(dǎo)炎性細胞因子（TNF?α、IL?6、IL?1β）產(chǎn)生。

研究報道在LPS誘導(dǎo)ALI的過程中，TLR4?MyD88信號通路被激活，促進大量炎癥介質(zhì)釋放，導(dǎo)致ALI加重［5］。在本研究中，WT小鼠在接觸PQ后，TLR4在mRNA和蛋白水平表達均明顯升高，伴隨急性肺損傷的發(fā)生，而TLR4基因敲除后，PQ誘導(dǎo)的急性肺損傷程度明顯改善，提示TLR4在PQ中毒過程中被過度激活并加重肺損傷，TLR4基因敲除后明顯降低了PQ中毒后肺臟的炎性反應(yīng)。

雖然PQ中毒肺損傷的機制復(fù)雜，但炎癥介質(zhì)的過度釋放在此過程扮演重要角色。然而炎癥通路是如何被過度激活依然未完全明了。PQ中毒過程中可以誘導(dǎo)大量活性氧簇釋放，致使脂質(zhì)過氧化和細胞損傷［3］，另外有研究［12］報道，細胞損傷過程釋放的內(nèi)源性配基（損傷相關(guān)分子模式、DAMPs）可以激活TLR4信號通路。因此推測在PQ中毒過程中，肺泡上皮細胞和血管內(nèi)皮細胞受到活性氧族的攻擊而損傷，并形成大量DAMPs，后者作為內(nèi)源性配基激活TLR4信號通路。激活的TLR4信號通路導(dǎo)致大量炎癥介質(zhì)（NF?κB、TNF?α和IL?1β）的過度釋放，誘發(fā)加重肺損傷同時繼續(xù)產(chǎn)生大量DAMPs。TLR4與DAMPs可能形成正反饋環(huán)，導(dǎo)致肺損傷的持續(xù)發(fā)酵。TLR4基因敲除后阻斷了TLR4信號通路，降低了炎癥介質(zhì)的釋放，最終對PQ中毒誘導(dǎo)的ALI具有保護作用。

綜上所述，本研究通過TLR4基因敲除小鼠，明確了TLR4信號通路在PQ中毒誘導(dǎo)急性肺損傷過程中發(fā)揮重要作用，阻斷TLR4信號通路可以減少炎癥介質(zhì)的表達，從而保護肺功能，為臨床治療提供了新的靶點。但本研究選擇的時間點有限（中毒后24 h），相關(guān)實驗還有待進一步深入。

［1］BERTOLOTE JM，F(xiàn)LEISCHMANN A.Deaths from pesticide poison?ing：a global response［J］.Br J Psychiatry，2006，189：201-203. DOI：10.1192/bjp.bp.105.020834.

［2］GUNNELL D，EDDLESTON M，PHILLIPS MR，et al.The global distribution of fatal pesticide self?poisoning：systematic review［J］. BMC Public Health，2007，7：357.DOI：10.1186/1471?2458?7?357.

［3］DINIS?OLIVEIRA RJ，DUARTE JA，SáNCHEZ?NAVARRO A，et al.Paraquat poisonings：mechanisms of lung toxicity，clinical fea?tures and treatment［J］.Crit Rev Toxicol，2008，38（1）：13-71. DOI：10.1080/10408440701669959.

［4］ZHOU B，ZHOU H，LING S，et al.Activation of PAR2 or/and TLR4 promotes SW620 cell proliferation and migration via phosphoryla?tion of ERK1/2［J］.Oncol Rep，2011（25）：503-511.DOI：10.3892/ or.2010.1077.

［5］VILLAR J，CABRERA N，CASULA M.Mechanical ventilation mod?ulates Toll?like receptor signaling pathway in a sepsis?induced lung injury model［J］.Intensive Care Med，2010，36（6）：1049-1057. DOI：10.1007/s00134?010?1799?3.

［6］CHANGJB，LINCC，CHIOUJF，etal.Treatmentofacute paraquat in?toxication using recommended megadose of vitamin C：a reappraisal［J］.Free Radic Res，2013，47（12）：991-1001.DOI：10.3109/1071 5762.2013.838321.

［7］YANG H，WEN Y，HOU?YOU Y，et al.Combined treatment with bone marrow mesenchymal stem cells and methylprednisolone in paraquat?induced acute lung injury［J］.BMC Emerg Med，2013，13（Suppl 1）：S5.DOI：10.1186/1471?227X?13?S1?S5.

［8］WHITEHEAD GS，GRASMAN KA，KIMMEL EC.Lung function and airway inflammation in rats following exposure to combustion products of carbon?graphite/epoxy composite material：comparison to a rodent model of acute lung injury［J］.Toxicology，2003，183（1/ 3）：175-197.DOI：10.1016/S0300?483X（02）00542?5.

［9］AKIRA S.Mammalian Toll?like receptors［J］.Curr Opin Immunol，2003，15（1）：5-11.DOI.：10.1016/S0952?7915（02）00013?4.

［10］TSAN MF，GAO B.Heat shock proteins and immune system［J］.J Leukoc Biol，2009，85（6）：905-910.DOI：10.1189/jlb.0109005.

［11］SWAROOP S，SENGUPTA N，SURYAWANSHI AR，et al.HSP60 plays a regulatory role in IL?1β?induced microglial inflammation via TLR4?p38 MAPK axis［J］.J Neuroinflammation，2016，13：27. DOI：10.1186/s12974?016?0486?x.

［12］TSUNG A，HOFFMAN RA，IZUISHI K，et al.Hepatic ischemia/re?perfusion injury involves functional TLR4 signaling in non?paren?chymal cells［J］.J Immunol，2005，175（11）：7661-7668.DOI：10.4049/jimmunol.175.11.7661.

（編輯武玉欣）

Role of TLR4 in Lung Injury Induced by Paraquat Poisoning

LIU Wei，DONG Xuesong，LIU Xiaowei，CHEN Xinming，LIU Huanzhi，LIU Zhi
（Department of Emergency，The First Hospital，China Medical University，Shenyang 110001，China）

ObjectiveTo investigate the role of Toll?like receptor 4（TLR4）in acute lung injury induced by paraquat（PQ）poisoning.Meth?odsTwenty wild?type mice（C57BL/6J）andTLR4knockout mice（C57BL/10ScN）were randomly divided into 4 groups：WT group，WT+PQ group，TLR4gene knockout（TLR4?ko）group and TLR4?ko+PQ group，with 10 mice in each group.After paraquat treatment for 24 hours，mice were euthanized and sacrificed.TLR4 expression and pro?inflammatory cytokines were evaluated.ResultsAfter 24 hours of intraperitoneal injec?tion of PQ，wild?type mice showed significant acute lung injury，including decreased oxygen tension in blood gas，pathological changes in the acute stage of lung injury and increased TLR4 expression（accompanied by increased levels of TNF?α，IL?1β and NF）.TLR4?deficient mice exhibited significantly reduced level of paraquat?induced lung injury.ConclusionTLR4 may be required as a mediator and play an important role in acute lung injury induced by paraquat.Inhibition of TLR4 signaling has protection of lung injury induced by PQ.

paraquat；poisoning；acute lung injury；Toll?like receptor 4；inflammation

R363

A

0258-4646（2017）01-0007-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.01.002

國家自然科學(xué)基金（81571882）；遼寧省科學(xué)技術(shù)計劃（2013225303）；沈陽市科技計劃（F16?206?9?02）

劉偉（1979-），女，副主任醫(yī)師，博士研究生.

劉志，E-mail：lzsy2014@163.com

2016-06-06

網(wǎng)絡(luò)出版時間：