組織型纖溶酶原激活物突變體對鼠急性腦梗死及腦組織保護作用實驗研究

侯沛秋，祝 丹，唐 曦，林 川，曾大奎

組織型纖溶酶原激活物突變體對鼠急性腦梗死及腦組織保護作用實驗研究

侯沛秋1，祝 丹1，唐 曦2，林 川3，曾大奎3

（1.成都醫(yī)學院 醫(yī)學影像系，四川 成都 610500；2.成都醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 醫(yī)學影像系，四川 成都 610500；3.四川省宜賓市第二人民醫(yī)院 腫瘤二科，四川 宜賓 644000）

目的 評價新型組織型纖溶酶原激活物突變體（t-PAm）對鼠急性腦梗死溶栓作用及腦組織保護作用。 方法 84只成年Wistar大鼠隨機分為對照組、組織型纖溶酶原激活物組（t-PA）、低劑量組織型纖溶酶原激活物突變體組（低劑量t-PAm組）及常規(guī)劑量組織型纖溶酶原激活物突變體組（常規(guī)劑量t-PAm組），大腦中動脈血栓形成3 h后進行相應治療。觀察溶栓24 h后腦梗死面積、神經(jīng)損傷評分、腦出血的情況，并通過中性粒細胞浸潤及蛋白酶激活受體1（PAR-1）濃度的變化了解t-PAm對腦組織的保護作用。結果 梗死后應用低劑量t-PAm[（108.5±27.3）mm3]及常規(guī)劑量t-PAm[（68.3±17.2）mm3]組梗死面積均較對照組降低，同時梗死面積與神經(jīng)評分有明確的相關性（r=0.613，P=0.000），且低劑量t-PAm在溶栓的同時沒有明顯增加腦出血的概率。t-PAm還減少髓過氧化物酶的生成，并與t-PA組相比減少PAR-1的生成（P＜0.001）。結論 新型組織型纖溶酶原激活物突變體有較好的溶栓作用，同時對缺血腦組織有明顯的保護作用。

尿激酶；血栓；組織型纖溶酶原激活物；突變體

腦組織具有不可再生的特點，隨著腦梗死時間的延長，腦細胞壞死逐漸增加，因此，盡早開通閉塞血管有著決定性的意義。溶栓劑被廣泛應用在急性腦梗死中，目前急性腦梗死的溶栓窗限定在血栓形成后3 h內(nèi)，延遲溶栓增加腦出血及血腦屏障損傷的風險，同時增加其他腦血管疾病的發(fā)生率。因此，尋找一個療效好、副作用低的溶栓劑會給患者及社會帶來極大的益處[1-5]。本實驗重點觀察新型組織型纖溶酶原激活物突變體（tissue type plasminogen activator mutant，t-PAm）對大鼠急性腦梗死的溶栓療效。本研究希望新藥t-PAm能減少出血風險，提高再通率，并對缺血再灌注的腦組織有保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

84只雄性成年Wistar大鼠，平均體重（332± 19）g，合格證號：SCXK（滬）2013-0009（上海大學醫(yī)學院）。愛通立粉劑（德國勃林格殷格翰公司），普通肝素（常州千紅生物制藥有限公司），2，3，5-氯化三苯四唑（上海源葉生物科技有限公司），戌二醛固定液（常州千紅生物制藥有限公司），0.1%四氮唑藍溶液（深圳中晶生物技術有限公司），異氟醚（杭州維康科技有限公司），三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（廣州偉伯化工有限公司），0.05%聚環(huán)氧乙烯月桂酰醚（深圳銘科化工有限公司），1%聚乙二醇辛基苯基醚（廣州偉伯化工有限公司），10%聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠（天津比克化學科技有限公司），抗髓過氧化物酶（Myelopero xidase，MPO）的鼠單克隆抗體（上海葉民生物技術有限公司），兔多克隆抗體（南京金斯瑞生物科技有限公司），β-微管蛋白（北京博奧森生物技術有限公司），抗兔二抗（上海歐韋達儀器科技有限公司），山羊抗小鼠多克隆抗體（美國Santa Cruz公司），兔抗山羊免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）（上海西唐生物科技有限公司），鏈霉親和素-生物素復合物（strept avidin-biotin complex，SABC）（武漢博士德生物工程有限公司），二氨基聯(lián)苯氨（Diaminobezidin，DAB）（上海西唐生物科技有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 84只雄性成年Wistar大鼠，平均體重（332±19）g，異氟醚麻醉（5%誘導，2%手術，1.2%維持）。恒溫加熱裝置使大鼠肛溫控制在（37.0±0.5）℃。體外復制新鮮血栓（直徑=0.35 mm，長度=18 mm），注射入鼠的右側大腦中動脈（middle cerebral artery，MCA）形成急性腦梗死[6]。急性腦梗死形成3 h后大鼠被隨機分入下列4組：對照組，使用生理鹽水；組織型纖溶酶原激活物組（t-PA組），采用愛通立粉劑，總量10 mg/kg（其中10%劑量溶于鹽水后靜脈推注，余量用微量泵在30 min內(nèi)勻速泵入體內(nèi)）；常規(guī)劑量組織型纖溶酶原激活物突變體組（常規(guī)劑量t-PAm組），用法與t-PA組類似，總量10 mg/kg（其中10%劑量溶于鹽水后靜脈推注，余量用微量泵在30 min內(nèi)勻速泵入體內(nèi)）；低劑量組織型纖溶酶原激活物突變體組（低劑量t-PAm組），總量5 mg/kg，用法與t-PA組相似[7-8]。血栓形成后24h后斷頭法處死小鼠。

1.2.2 梗死面積測量、神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分及腦出血評價 大鼠腦組織切片，應用2，3，5-氯化三苯四唑染色評估梗死面積。采用9分法評價神經(jīng)系統(tǒng)損傷，0分=正常，9分=最重損傷[9-12]。用藥后大鼠腦出血評價大鼠腦組織沿冠狀溝切成1.5mm薄片，肉眼分析腦出血情況，分為：①HI-1型（hemorrhagic infarction type 1，HI-1），定義為梗死區(qū)周圍有點狀出血；②HI-2型（hemorrhagic infarction type 2，HI-2），定義為梗死區(qū)周圍有片狀出血；③PH型（parenchymal hematoma，PH）腦實質出血，定義為梗死區(qū)周圍有大的血腫[6]。計算各組大鼠各種類型出血的數(shù)量[13-14]。

1.2.3 中性粒細胞浸潤及蛋白酶激活受體1（protease-activated receptor-1，PAR-1）濃度測量 評價中性粒細胞浸潤：腦梗死形成24 h后應用Western blot測定髓過氧化物酶來評價中性粒細胞浸潤。腦組織分離后切片成2 mm厚，分離出同側及對側MCA范圍，組織冷凍用于分析。組織放置在緩沖液中[由50 mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（pH=7.6），150 mmol/L氯化鈉NaCl，5 mmol/L氯化鈣CaCl2，0.05%聚環(huán)氧乙烯月桂酰醚，0.02%疊氮化鈉NaN3，1%聚乙二醇辛基苯基醚混合而成]，4℃、12 000 r/min離心5 min。在上清液中分離蛋白組織。10%聚丙烯酰胺瓊脂糖凝膠著色。蛋白轉到薄膜上，4℃孵化過夜，加抗MPO的鼠單克隆抗體，稀釋到1∶500，室溫孵化2 h，加鼠二抗，稀釋到1∶2 500，加兔多克隆抗體對抗β-微管蛋白（β-tubulin），稀釋到1∶10 000。再加過氧化物酶相連的抗兔二抗，抗兔二抗稀釋到1∶2 500。免疫組織化學法測定PAR-1。標本置甲醛溶液中固定、包埋。按下述步驟行PAR-1免疫組織化學染色：切片、微波修復抗原、3%過氧化氫抑制、兔血清封閉、加一抗（山羊抗小鼠多克隆抗體）、4℃過夜、加生物素二抗（兔抗山羊IgG）、加SABC、DAB顯色，蘇木素復染。高倍鏡下隨機選取左側海馬皮質相鄰而不重疊的4個視野區(qū)，用圖像分析軟件計算PAR-1陽性表達細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，直線回歸分析評價梗死面積與神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分的關系，方差分析進行多組間比較，若有統(tǒng)計學意義用LSD-t檢驗進行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

血栓形成后24 h測量各組小鼠校正的梗死面積以及神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分比較，差異有統(tǒng)計學意義，LSD-t檢驗發(fā)現(xiàn)，對照組梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分均較其他組增高，低劑量t-PAm組梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分較t-PAm組有增加，但較t-PA組差異無統(tǒng)計學意義。24 h后小鼠神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分與梗死面積的大小有相關性（r=0.613，P=0.000）。見附表和圖1、2。

在梗死外組織未見出血。出血位于梗死血管周圍的皮層下、皮層及外周腦組織中。各組出血部位無差異。分析腦出血的類型發(fā)現(xiàn)，HI-1和HI-2型的出血較PH型更常見（P＜0.05）。

t-PA組和常規(guī)劑量t-PAm組HI-2型出血較對照組有增高，而低劑量t-PAm組HI-2型出血較對照組有增高趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義。t-PA組和常規(guī)劑量t-PAm組間HI-2型腦出血差異無統(tǒng)計學意義，但較低劑量t-PAm組增高。這也表明低劑量t-PAm組在溶解腦梗死的同時HI-2型的腦出血的發(fā)生率有減低趨勢。

附表 不同治療方法的梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分的比較 （n=21，x±s）

圖1 不同治療方法的梗死面積對比圖

圖2 梗死面積和神經(jīng)系統(tǒng)損傷評分的比較

各處理組中髓過氧化物酶表達不同（F=3.752，P=0.042），而在梗死部位的對側未見表達，LSD-t檢驗發(fā)現(xiàn)，在愛通立溶栓后會阻止因缺血帶來的MPO的升高（t=8.536，P=0.032），應用t-PAm后則更明顯阻止MPO的升高（t=12.536，P=0.022）。通過電泳圖看到t-PAm能夠通過提高再通率及縮短再通的時間來減少中性粒細胞的浸潤，從而減輕急性缺血帶來的炎癥反應。見圖3、4。

凝血酶的細胞外效應在腦組織缺血損傷中起重要作用，其細胞外效應由凝血酶受體介導，PAR-1對凝血酶的介導作用最強。本實驗可知隨著腦動脈血栓形成，每個統(tǒng)計場（0.26 mm2）腦組織PAR-1陽性細胞數(shù)升高（F=12.356，P=0.012），經(jīng)LSD-t檢驗，與對照組比較，應用t-PA后，PAR-1陽性細胞數(shù)繼續(xù)升高，有統(tǒng)計學意義（t=6.536，P=0.046）。而低劑量t-PAm組局部PAR-1陽性細胞數(shù)卻有下降趨勢（t=8.536，P=0.040），但較t-PA組無顯著減低，而t-PAm組PAR-1陽性細胞數(shù)較t-PA組有減低（t= 16.536，P=0.016），表明t-PAm對PAR-1生成有抑制作用。見圖5。

圖3 不同治療方法電泳圖

圖4 不同治療方法MPO相對水平比較

圖5 各組PAR-1陽性細胞數(shù)比較

3 討論

急性腦梗死在我國有較高的發(fā)生率和較大的危害，早期開通閉死的腦血管，并盡可能地降低再灌注損傷是臨床治療的方向。早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、早期應用有效的溶栓物及加強缺血腦組織的保護治療是臨床治療的基本策略，尋找理想的溶栓劑是永遠努力的方向。

為降低t-PA對PAR的敏感性，延長其半衰期從而提高溶栓效果，根據(jù)t-PA與PAR的結合特性，賀石漢設計了t-PA與PAR結合部位的定點突變，成功構建了重組質粒pU CT-t-PAm，并表達t-PAm，t-PAm克隆到pFT-his原核表達載體上，誘導表達出的目的蛋白主要以不可溶的包涵體形式存在于細胞內(nèi)。在沒有PAR存在的體外實驗已表明t-PAm活性比t-PA高很多，為減少給藥量、提高治療效果、進一步開發(fā)半衰期較長的溶栓藥物打下良好的基礎[8-9]。

本實驗發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死形成3 h后與對照組及t-PA組相比，t-PAm能減少梗死面積，并不明顯提高腦出血的發(fā)生率。低劑量t-PAm組與t-PA組有相似的溶栓療效并有較低的腦出血的發(fā)生率，而常規(guī)劑量t-PAm較t-PA組的溶栓療效更佳，且與t-PA組有相似的腦出血的發(fā)生率。因此可見，t-PAm的療效較t-PA更好。同時，梗死面積與神經(jīng)系統(tǒng)評分有密切的相關性，t-PAm組評分低于對照組。溶栓后出血是常見并發(fā)癥，在溶栓組HI-2型的出血升高，低劑量t-PAm組與t-PA組比較，HI-2型出血有降低，說明在保證溶栓療效的同時，新藥t-PAm會帶來相對較少的出血風險。

腦梗死后及時進行抗凝血酶治療，有可能抑制PAR-1的高表達，減少氧自由基的生成，從而減輕腦組織炎癥反應和腦組織損傷。同時積極減少中性粒細胞的浸潤也對腦組織的損傷有預防作用。已有許多藥物如S-0139、尿酸、他汀類調(diào)脂藥等[12-14]也有一定作用。本實驗證明t-PAm有較好的抑制中性粒細胞浸潤及減低PAR-1表達的作用，表明在溶解血栓再灌注的同時，t-PAm提供很好的腦組織保護作用。

通過本實驗證明，新型溶栓物t-PAm對急性腦梗死有良好的溶解作用，同時，腦出血的并發(fā)癥相對較少，而且能抑制中性粒細胞浸潤，降低PAR-1生成，保護腦細胞，為臨床應用打下良好基礎。

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（張蕾 編輯）

Protective effect of tissue type plasminogen activator mutant on acute cerebral thrombosis and cerebral tissue in rats

Pei-qiu Hou1,Dan Zhu1,Xi Tang2,Chuan Lin3,Da-kui Zeng3
(1.Department of Medical Imaging,Chengdu Medical College,Chengdu,Sichuan 610500,China; 2.Department of Medical Imaging,the First Affiliated Hospital of Chengdu Medical College, Chengdu,Sichuan 610500,China;3.the Second Department of Oncology, the Second People's Hospital of Yibin,Yibin,Sichuan 644000,China)

Objective To evaluate the thrombolytic and brain-protective effect of new tissue plasminogen activator mutant in rat model of acute cerebral thrombosis.Methods Eighty-four adult Wistar rats were randomly divided into control group,tissue-type plasminogen activator(t-PA)group,low-dose tissue plasminogen activator mutant(lowdose t-PAm)group and conventional-dose tissue plasminogen activator mutant(regular-dose t-PAm)group.The rats of the three groups were treated separately 3 hours after thrombosis in middle cerebral artery.Volume of infarction, neurologic scores and severity of hemorrhage were observed 24 hours after treatment.The protective role of t-PAm for brain tissue was evaluated through neutrophil infiltration and the change in the concentration of PAR-1.Results Volume of infarction in the low-dose t-PAm group and the regular-dose t-PAm group was significantly smaller than that in the control group[(108.5±27.3)mm3and(68.3±17.2)mm3vs (323.4±42.3)mm3],and the neurologic scores were evidently correlated with the volume of infarction(r=0.613,P＝0.000),while the incidence of cerebral hemorrhage in the low-dose t-PAm group was not significantly increased.T-PAm also reduced the production of myeloperoxidase,as well as the production of PAR-1,compared with the t-PA group(P＜0.001).Conclusions Newtissue plasminogen activator mutant shows better thrombolytic effect with significant protection for ischemic brain tissue.

urokinase;thrombus;recombinant tissue-type plasminogen activator;mutant

R-332

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.04.005

1005-8982（2017）04-0022-05

2016-04-08

唐曦，Tel：13438105051；E-mail：zz13938972737@163.com