外源性硫化氫對肺移植大鼠肺血管功能改變的影響

朱宏偉 吳鏡湘 徐美英

外源性硫化氫對肺移植大鼠肺血管功能改變的影響

朱宏偉 吳鏡湘 徐美英

目的探討外源性硫化氫對肺移植大鼠再灌注早期肺血管功能改變的影響。方法雄性SD大鼠隨機分為對照組（假手術(shù)）、肺移植組和硫化氫－肺移植組，每組10只。硫化氫－肺移植組：于移植肺肺門開放前5 min腹腔注入外源性硫化氫（Na HS）14μmol/kg，再灌注2 h后處死大鼠，取左肺組織檢測肺濕干比（W/D）、丙二醛（MDA）和髓過氧化物酶（MPO）含量以及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）。取大鼠肺動脈行離體血管環(huán)實驗，分別比較血管環(huán)舒張和收縮功能功能。結(jié)果與對照組比較，肺移植組大鼠肺組織的W/D比值升高，MDA含量、MPO、iNOS活性增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與肺移植組比較，硫化氫－肺移植組大鼠肺組織的W/D比值降低，MDA含量、MPO、iNOS活性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組比較，肺移植組離體肺動脈對乙酰膽堿引起的內(nèi)皮依賴的舒張反應(yīng)降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而使用Na HS處理后，硫化氫－肺移植組的血管舒張效應(yīng)恢復(fù)到對照組水平（P＞0.05）。與對照組比較，肺移植組離體肺動脈的收縮功能下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；使用Na HS處理后硫化氫－肺移植組的血管收縮功能無明顯改變（P＞0.05）。結(jié)論外源性硫化氫不僅能夠減少肺移植后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制iNOS活性的增加，減輕缺血再灌注損傷，而且能夠增強移植后離體肺血管的舒張功能。

硫化氫； 肺移植； 缺血再灌注損傷； 離體肺動脈； 一氧化氮合酶

肺移植是終末期肺疾病患者的最終治療方法，而移植肺缺血再灌注損傷（ischemia－reperfusion injury，IRI）是導(dǎo)致移植肺早期功能障礙和患者死亡的重要原因［1］。新型氣體信號分子H2S與多種肺部疾病相關(guān)，內(nèi)源性H2S在肺組織主要由胱硫醚－γ－裂解酶（cystathionineγ－lyase，CSE）合成。近年來研究［2］表明，H2S參與了肺IRI的病理改變，且給予外源性硫化氫可不同程度地減輕肺缺血損傷。但是，H2S/CSE體系與移植肺IRI的直接關(guān)系知之甚少。一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）可催化L－精氨酸生成一氧化氮（NO），NO在肺移植IRI中具有重要作用［3］。前期研究發(fā)現(xiàn)NO信號通路通過NO/NOS體系部分參與了移植肺損傷機制，引起肺移植缺血再灌注早期肺動脈收縮和舒張功能的損害，其機制可能與iNOS活性的異常增加有關(guān)［4］。本研究采用給予外源性硫化氫來觀察對肺移植缺血再灌注早期NO/NOS通路的影響以及離體肺血管功能的變化。

材料與方法

一、動物來源和分組

雄性SD大鼠（上海中國科學(xué)院實驗動物中心）300～400 g，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（滬）2007－0005，使用許可證號為SYXK（滬）2006－0033。隨機分為3組，對照組（n＝10）：假手術(shù)組；肺移植組（n＝10）：肺移植后恢復(fù)再灌注2 h，平均冷缺血時間1 h；硫化氫－肺移植組（n＝10）：于移植肺肺門開放前5 min腹腔注入Na HS 14μmol/kg，再灌注2 h。

二、肺移植模型的建立

采用改良三袖套法建立大鼠左肺原位移植模型［6］，簡述如下：供體鼠腹腔內(nèi)注射阿托品0.2 mg和100 mg/kg氯胺酮麻醉，經(jīng)胸腹U形切口進(jìn)胸暴露心臟和肺，肝素化后經(jīng)肺動脈，利用重力注入4℃Euro－collins溶液（Fresenius公司）20ml，灌注壓20 cm H2O，于吸氣末肺膨脹狀態(tài)下取出心肺組織，放入盛有4℃Euro－collins溶液的容器中，顯微鏡下套入預(yù)先制備好的袖樣套管（動脈18G、靜脈16G、支氣管14G）。受體手術(shù)：麻醉同前，尾動靜脈穿刺置入24G套管，連接補液3 ml/h，測動脈血壓，連接心電圖，間斷抽血0.1 ml測量動脈血氣，經(jīng)口行氣管插管插入14G套管，潮氣量10 ml/kg，呼吸頻率70次/min，吸呼比為1∶2，吸入氧氣分?jǐn)?shù)FiO240%，左胸第4肋間進(jìn)胸，10倍顯微鏡下解剖游離肺門后，顯微心耳鉗將左肺動、靜脈和支氣管近心端一并夾閉，嵌入橡皮泥固定。吻合時，分別在近心端繞以5－0絲線并預(yù)留外科結(jié)，遠(yuǎn)心端斜行剪一小口，順勢將供肺袖套管插入，雙道結(jié)扎，妥善固定，松開鉗夾在肺門近心端的心耳鉗，觀察血管吻合無漏血，氣管吻合口無漏氣后，再剪去“病肺”。開放后可見血液立即充盈移植肺，在呼吸機通氣下逐漸擴張的移植肺由白色變?yōu)榉奂t色，調(diào)整PEEP，使其完全復(fù)張后納入胸腔，留置胸腔引流管關(guān)閉胸腔。維持機械通氣和補液，有蘇醒現(xiàn)象則追加氯胺酮20 mg/kg，再灌注2 h后處死大鼠開胸取材。

三、離體血管制備

大鼠處死后，心肺一起取出。放入盛有4℃的混合氣體（95%O2和5%CO2）飽和的Krebs液的培養(yǎng)皿中，顯微鏡下仔細(xì)分離主肺動脈和左右肺動脈分支，小心剝?nèi)ネ鈬闹窘M織和結(jié)締組織，舍棄袖套管上外翻的部分，然后將肺動脈剪成2～3 mm長的動脈環(huán)3段備用。血管環(huán)穿入張力測試儀的不銹鋼鉤，固定懸掛于盛有10 ml Krebs液的浴槽內(nèi)，（37.0±0.5）℃恒溫，連續(xù)用混合氣體充氣，連接MPA2000型多道生理記錄儀（上海奧爾科特科技有限公司）記錄。血管環(huán)的初始張力為1 g，并以此張力平衡45 min。每隔15 min換液一次。用終濃度0.06 mol/L（3 mol/L KCl 100μl）收縮血管環(huán)，待收縮穩(wěn)定后用預(yù)熱的Krebs液洗脫，反復(fù)沖洗直至張力恢復(fù)到初始值為止。

四、離體血管實驗觀察項目

1.離體肺動脈血管環(huán)收縮功能：采用遞增濃度的去氧腎上腺素（1×10－10、3×10－10、1×10－9、3× 10－9、1×10－8、3×10－8、1×10－7、3×10－7、1× 10－6、3×10－6、1×10－5mol/L）處理血管，記錄動脈環(huán)收縮的累積反應(yīng)曲線。

2.離體肺動脈血管環(huán)舒張功能：先用濃度為10－7mol/L的去氧腎上腺素進(jìn)行預(yù)收縮，再逐步遞增乙酰膽堿的濃度（1×10－9、3×10－9、1×10－8、3× 10－8、1×10－7、3×10－7、1×10－6、3×10－6、1× 10－5、3×10－5、1×10－4mol/L）處理，記錄動脈環(huán)舒張的效應(yīng)累積反應(yīng)曲線。

五、肺組織濕干比（W/D）測定

再灌注2 h后處死動物，取左肺組織，用鋒利的刀片切取1/3，濾紙吸凈表面液體，以分析天平稱取濕重，再置入80℃的烤箱中，48 h后稱取干重，二者之比為肺濕干比（W/D）。

六、肺組織iNOS、e NOS活性的測定

再灌注2 h后處死動物，取左肺組織0.1 g左右，使用iNOS、eNOS酶聯(lián)免疫（ELISA）試劑盒（美國ADL公司），肺組織標(biāo)本按1∶5（W/V）加入預(yù)冷的提取液，冰浴中勻漿，4℃下20 000×g離心60 min，在酶聯(lián)板中加入樣品稀釋液、標(biāo)準(zhǔn)品及待測樣品各100μl，37℃下120 min后棄去甩干，每孔加檢測液A 100μl，60 min后棄去，洗板3次；加檢測液B 100μl，37℃下60 min后棄去甩干，洗板5次；加底物溶液90μl，避光顯色后加終止液50μl，在450 nm處讀取OD值。

七、肺組織中丙二醛（malondialdehyde，MDA）和髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）含量測定

取左肺組織0.2 g勻漿，采用ELISA試劑盒（美國ADL公司）檢測，標(biāo)本處理方法與上述類似。

八、統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以±s表示，組織標(biāo)本檢測部分的數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析，離體血管實驗的數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量的方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、肺移植大鼠離體肺血管環(huán)收縮功能的變化

去氧腎上腺素在三組中均產(chǎn)生濃度依賴性收縮反應(yīng)，但肺移植組的血管收縮曲線明顯低平（P＜0.05），提示收縮功能減弱。而使用硫化氫后肺移植組的收縮曲線沒有變化，提示使用硫化氫后對肺移植大鼠離體肺血管收縮功能沒有影響（圖1A）。

三、三組間濕干比（W/D）比較

與對照組比較，肺移植組肺組織的W/D比增加；與肺移植組比較，使用硫化氫－肺移植組肺組織W/D比減少（P＜0.05）（表1）。四、三組間MDA、MPO、iNOS、eNOS的比較

圖1 Na HS預(yù)處理對肺移植大鼠離體肺血管環(huán)去氧腎上腺素濃度反應(yīng)曲線（A）和乙酰膽堿的濃度反應(yīng)曲線（B）的影響。肺移植組與對照組比較，各濃度點均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

與對照組比較，肺移植組大鼠的MDA含量、MPO及iNOS活性均顯著增加（P＜0.05），eNOS活性顯著降低（P＜0.05）；與肺移植組比較，硫化氫－肺移植組大鼠的MDA含量、MPO及iNOS活性顯著降低（P＜0.05），eNOS活性顯著增加（P＜0.05）（表1）。

表1 三組W/D、MPO、MDA、iNOS和eNOS含量比較±s，n＝10）

表1 三組W/D、MPO、MDA、iNOS和eNOS含量比較±s，n＝10）

組別 W/D MDA（ng/ml） MPO（ng/ml） iNOS（ng/ml） eNOS（ng/ml）對照組①4.2±0.5 13.3±0.5 1.0±0.2 0.3±0.1 0.7±0.2肺移植組② 5.2±0.3 21.2±4.2 1.2±0.1 0.8±0.1 0.3±0.1硫化氫－肺移植組③ 4.6±0.3 16.3±2.1 1.1±0.1 0.5±0.1 0.5±0.1①與②比較t值 －5.42 －5.91 －2.83 －11.18 5.66P值 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05②與③比較t值 4.47 3.30 2.24 6.71 －4.47P值 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05 P＜0.05

討 論

肺移植后再灌注早期存在肺血管功能紊亂及微循環(huán)障礙，表現(xiàn)為炎細(xì)胞大量浸潤，血管內(nèi)皮功能失調(diào)，微循環(huán)障礙，通氣－血流比值不匹配，肺水腫、急性呼吸窘迫綜合征、低氧血癥等，即缺血再灌注導(dǎo)致的肺損傷（ischemia－reperfusion－induced lung injury，IRILI），其主要環(huán)節(jié)是過度炎癥反應(yīng)和肺血管功能障礙［5］。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，IRI時誘導(dǎo)型iNOS的過度升高可能參與內(nèi)皮損傷機制。iNOS在生理狀態(tài)下的活性很低，機體在遭受微生物內(nèi)外毒素、炎性介質(zhì)如腫瘤壞死因子、細(xì)胞分裂素或白細(xì)胞介素、創(chuàng)傷等刺激后誘導(dǎo)iNOS表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用，加重組織的損傷［7－8］。MDA是氧自由基使細(xì)胞膜中多價不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，代表了膜脂質(zhì)過氧化的程度，又間接反映了機體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。MPO是中性粒細(xì)胞所特有，其活性與組織中多形核粒細(xì)胞（polymorphonuclear neutrophil，PMN）浸潤程度成正比，被認(rèn)為是多形核粒細(xì)胞浸潤的可靠指標(biāo)。肺濕干比重（W/D）反映了肺水潴留的情況，可以反映肺功能損害的程度。肺水潴留是肺缺血導(dǎo)致肺毛細(xì)血管通透性增加和肺泡毛細(xì)血管膜破壞的直接后果。

在肺缺血再灌注的反應(yīng)中，NO是很重要的參與者［9］。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞合成eNOS生成的NO可舒張肺血管［10］，降低肺血管阻力、抑制白細(xì)胞和血小板滲出的作用，而iNOS能催化合成大量非生理濃度的NO，與氧自由基反應(yīng)，產(chǎn)生半衰期更長、細(xì)胞毒性更甚的超氧亞硝酸陰離子ONOO－而起毒性作用［11］。另外，過量NO可介導(dǎo)細(xì)胞毒性和促進(jìn)肺泡細(xì)胞凋亡，從而引起肺損傷［12］

本實驗中我們發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，肺移植組缺血再灌注2 h后MDA含量、MPO和iNOS活性明顯增加；肺移植組的肺濕干比重（W/D）明顯增加。這表明在肺IRI過程中發(fā)生的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，一方面造成了肺微循環(huán)障礙，微血管通透性增高；另一方面可誘導(dǎo)不依賴鈣離子的iNOS在轉(zhuǎn)錄水平激活。應(yīng)用外源性硫化氫后MDA含量、MPO和iNOS活性明顯降低，肺移植組的肺濕干比重（W/D）明顯減少，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減輕，微血管通透性改善，減輕移植后肺IRI。

離體血管實驗的結(jié)果顯示，在對照組中乙酰膽堿能明顯松弛由去氧腎上腺素預(yù)收縮的離體肺動脈，而對于肺移植缺血再灌注2 h后的離體肺動脈，乙酰膽堿的舒張效應(yīng)明顯減弱。這表明，eNOS源性的NO的產(chǎn)生被認(rèn)為有助于維持基礎(chǔ)條件下肺微血管低張力［13］。而血管壁中的iNOS活性呈病理性增強，抑制eNOS活性，降低NO的生物利用度，使內(nèi)皮依賴的乙酰膽堿舒血管反應(yīng)受損。而給予硫化氫處理的肺移植組的離體肺動脈對乙酰膽堿的舒張效應(yīng)恢復(fù)到了對照組水平，說明硫化氫對肺移植后肺血管有舒張作用，這種舒張作用可能與硫化氫本身的舒血管作用有關(guān)［14］；另外可能抑制了iNOS活性的異常增高，減輕炎癥反應(yīng)，使eNOS活性增加，NO的生物利用度增強，血管舒張作用進(jìn)一步增強。

與對照組相比，肺移植組的離體肺動脈對去氧腎上腺素的收縮反應(yīng)減弱。這可能是由于缺血再灌注早期iNOS活性的異常增強可以與超氧陰離子反應(yīng)，形成硝基超氧化物，同時在形成硝基過氧化物時競爭結(jié)合一部分超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD），將不利于氧自由基的清除，并且形成的較高水平的硝基過氧化物可向組織擴散，與相應(yīng)的組織蛋白和脂質(zhì)結(jié)合形成脂質(zhì)過氧化物，降低NO的生物利用度。這些氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)損傷的產(chǎn)物使血管對α－腎上腺素受體激動劑的反應(yīng)敏感性減弱，收縮反應(yīng)降低［15］；使用硫化氫后氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)降低，iNOS活性降低，收縮反應(yīng)有所提高，但是由于舒張作用增加，抵消了收縮作用，因此使用硫化氫后移植肺的肺動脈收縮作用無明顯改善。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用外源性硫化氫不僅能夠減少肺移植后的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，抑制iNOS活性的增加，減輕IRI，而且能夠增強移植后離體肺血管的舒張功能。

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Effects of hydrogen sulfide on function change of isolated pulmonary artery in rat lung transplantation model

ZhuHongwei，WuJingxiang，XuMeiying.DepartmentofAnesthesiology，ShanghaiChest Hospital，ShanghaiJiaotongUniversity，Shanghai200030，China

：XuMeiying.Email：xumeiyingxk＠163.com

ObjectiveTo investigate the effects of hydrogen sulfide on function change of isolated pulmonary artery in rat lung transplantation model.MethodsMale SD rats were randomly divided into control group（sham operation group），lung transplantation group and lung transplantation＋hydrogen sulfide group，with 10 rats in each group.In hydrogen sulfide＋lung transplantation group，orthotopic left lung allograft transplantation was performed，and hydrogen sulfide 14μmol/kg was injected intraperitoneally at the beginning of reperfusion.Rats were sacrificed 2 h after reperfusion，and left lung tissues were harvested to determine the wet dry ratio（W/D），content of malondialdehyde（MDA）and activity of myeloperoxidase（MPO）and inducible nitric oxide synthase（iNOS）.Isolated pulmonary artery rings were prepared，and the vasodilation and contraction function of pulmonary artery rings were compared.ResultsThe W/D，MDA content and activity of MPO and iNOS in lung transplantation group were significantly higher than those in control group（P＜0.05）.The W/D，MDA content and activity of MPO and iNOS in lung transplantation＋hydrogen sulfide group were significantly lower than those in lung transplantation group（P＜0.05）.Compared with control group，the endotheliumdependent vasodilation function of isolated pulmonary artery significantly decreased in lung transplantation group（P＜0.05），but after hydrogen sulfide treatment，the vasodilation functionrestored to the level in control group（P＞0.05）.The contraction function of isolated pulmonary artery in lung transplantation group was significantly lower than that in control group（P＜0.05），but there was no significant change in contraction function of isolated pulmonary artery in lung transplantation＋hydrogen sulfide group（P＞0.05）.ConclusionsHydrogen sulfide can alleviate the oxidative stress and inflammatory reaction，inhibit the activity of iNOS，reduce the ischemia－reperfusion injury after lung transplantation，and improve the vasodilation function of isolated pulmonary artery after transplantation.

Hydrogen sulfide； Lung transplantation； Ischemia－reperfusion injury； isolated pulmonary artery； nitric oxide synthase

2016－10－10）

（本文編輯：周珠鳳）

10.3877/cma.j.issn.2095－8773.2017.01.05

上海市衛(wèi)生局科研項目（20124331）

200030 上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院麻醉科

徐美英，Email：xumeiyingxk＠163.com

朱宏偉，吳鏡湘，徐美英.外源性硫化氫對肺移植大鼠肺血管功能改變的影響［J/CD］.中華胸部外科電子雜志，2017，4（1）：22－26.