豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備

烏吉斯古楞，劉亭岐，巨敏瑩，張 斌，韓 宇，劉建奇，宋慶慶，關(guān)平原

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，農(nóng)業(yè)部動物疾病臨床診療技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.金宇保靈生物藥品有限公司，獸醫(yī)疫苗國家工程實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古呼和浩特 010020）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的豬的一種傳染性疾病，又稱為“豬藍(lán)耳病”[1]。各品種和日齡的豬均可感染該病，主要引起妊娠母豬早產(chǎn)、流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或木乃伊胎，仔豬呼吸困難。1987年美國首次發(fā)現(xiàn)該病，1996年我國郭寶清等[2]從流產(chǎn)死胎中分離到PRRSV并命名為CH-1a株，從而首次證實(shí)我國存在該病，其后我國大部分地區(qū)相繼檢出PRRSV[3]。根據(jù)全球范圍內(nèi)的流行狀況和病毒基因特征可將PRRSV分為歐洲型和美洲型，其中在我國主要流行的是美洲型[4]。

PRRSV為囊膜病毒，屬于套式病毒目（Nidoviraie）、動脈炎病毒科（Arterivirdae）、動脈炎病毒屬（Arterivirus），病毒粒子直徑為50～65 nm，核衣殼大小為25～35 nm，核衣殼呈現(xiàn)立體對稱的二十面體，其表面具有明顯的纖突狀結(jié)構(gòu)[5]。其核酸不分節(jié)段，為單股正鏈RNA，大小約為15 kb，包括8個(gè)開放閱讀框架，共編碼RNA聚合酶（非結(jié)構(gòu)蛋白）以及GP2、GP3、GP4、GP5、M（基質(zhì)蛋白）和N（核衣殼蛋白）等7種蛋白[6]。

GP5蛋白是由ORF5開放閱讀框編碼的糖基化囊膜蛋白，又稱E蛋白，相對分子質(zhì)量為25 kDa左右[7]。研究發(fā)現(xiàn)，GP5蛋白的糖基化可能引起病毒的免疫逃逸，降低機(jī)體免疫力和抗體產(chǎn)生的能力，其功能區(qū)一旦缺失了糖基化的殘基，可導(dǎo)致PRRSV對中和抗體的敏感性提高，同時(shí)中和位點(diǎn)的抗原性將增強(qiáng)[8]。到目前為止，對PRRSV的復(fù)制機(jī)制和致病機(jī)理還不甚了解[9]。因此，至今未能找到有效防控PRRS的方法。本研究在原核表達(dá)PRRSV GP5蛋白的基礎(chǔ)上制備其多克隆抗體，為進(jìn)一步研究相關(guān)免疫保護(hù)性提供了試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株與細(xì)胞 PRRSV PC株、Marc-145細(xì)胞，均由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.1.2 試劑 Axyprep體液病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自康寧生命科學(xué)（吳江）有限公司；pMD19-T克隆載體、限制性內(nèi)切酶（HindIII、KpnI），均購自于大連寶生物（TaKaRa）工程有限公司；SuperScript&TRADE III反轉(zhuǎn)錄試劑盒、MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒、Thermo Scientific GeneJET質(zhì)粒小提試劑盒、NuPAGE?12%、Bis-Tris以及Mini Protein Gel，均購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司；弗氏完全佐劑和不完全佐劑，為美國Sigma公司產(chǎn)品；HRP標(biāo)記的山羊抗豬、山羊抗兔IgG，購自艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；His標(biāo)簽抗體，購自上海仝元生物科技有限公司；PRRSV陽性血清，由金宇保靈生物藥品有限公司提供；超敏型辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG、DAPI染色液，購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動物 2月齡、體質(zhì)量約1.8 kg的北京大耳白兔1只，購自達(dá)拉特旗永恒農(nóng)牧業(yè)開發(fā)有限公司。

1.1.4 主要儀器 生物安全柜、PCR儀、高速冷凍離心機(jī)、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱、恒溫振蕩器、超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、聚丙烯酰胺凝膠電泳儀、化學(xué)發(fā)光成像儀、蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)和濕式轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、倒置熒光顯微鏡等，均由金宇保靈生物藥品有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 PRRSV GP5蛋白生物信息學(xué)分析 使用DNAstar軟件分析PRRSV GP5蛋白質(zhì)的氨基酸、相對分子質(zhì)量和等電點(diǎn)等指標(biāo)。使用在線分析軟件SignalP 4.1 Server、TMHMM、NetOGlyc 4.0 Server、NetPhos server等，分析GP5蛋白氨基酸序列的信號肽、跨膜區(qū)、糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)。

1.2.2 目的基因擴(kuò)增及表達(dá)載體構(gòu)建 使用Axyprep體液病毒DNA/RNA提取試劑盒提取PRRSV PC株的總RNA。按照SuperScriptTMIII反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將提取得到的PRRSV PC株RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將所預(yù)測的序列信號肽去除，使用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)GP5基因PCR擴(kuò)增引物（上游引物：5'-GGTACCATGTTGGGGAAGTGCTTGA-3'；下游引物：5'-AGCTTCTAGACGACCCCATTGTTC-3'），引物送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系：Mix 25 μL、ddH2O 20 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、模板1 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。目的基因片段與pMD19-T載體在16 ℃條件下連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-T-GP5。pMD19-T-GP5和pET-32a（+）分別使用限制性內(nèi)切酶HindIII和KpnI雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收試劑盒分別回收GP5基因片段和pET-32a（+）載體。將回收的產(chǎn)物進(jìn)行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-GP5。然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，次日在氨芐抗性的LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行陽性克隆篩選，對陽性克隆進(jìn)行搖菌提取質(zhì)粒，并進(jìn)行質(zhì)粒雙酶切鑒定。

1.2.3 GP5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 對于雙酶切驗(yàn)證正確的菌株，挑取單菌落接種于5 mL含有氨芐抗性的LB培養(yǎng)液中，37 ℃、130 r/min過夜培養(yǎng)；次日，以1:1 000的比例接菌于1 L含氨芐抗性的LB培養(yǎng)液，37 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)；培養(yǎng)至OD值為0.6～0.8時(shí)，加濃度為1 mol/L的IPTG，設(shè)置溫度為27 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后離心收集菌體，加上適量的上清Binding Buffer，超聲波細(xì)胞粉碎器進(jìn)行破碎；5 000 r/min離心30 min。

1.2.4 GP5蛋白純化及免疫印跡檢測（Western Blot） 菌液離心后，上清用0.22 μm濾器過濾去除雜質(zhì)；使用親和層析方法純化GP5蛋白，并用SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色及Western Blot（Western Blot分別用PRRSV陽性血清和His標(biāo)簽抗體）進(jìn)行鑒定及檢測。

1.2.5 GP5蛋白兔源多克隆血清制備 首次，1 mg/只的劑量將GP5蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分乳化，以0.5 mL/只的劑量給予北京大耳白兔背部皮下注射；2周后，以1 mg/只的劑量將GP5蛋白與等體積的不完全弗氏佐劑充分乳化后加強(qiáng)免疫，在加強(qiáng)免疫2次后采集兔血液并分離血清，作為GP5蛋白多抗血清。此外，首次免疫前采集兔血液分離血清，作為后期試驗(yàn)陰性血清對照。

1.2.6 GP5蛋白多抗血清ELISA效價(jià)測定 參照張永寧等[10]操作步驟，以純化的PRRSV GP5蛋白為包被抗原，利用間接ELISA方法對制備的多抗血清進(jìn)行效價(jià)測定。

1.2.7 Western Blot檢測GP5多克隆血清反應(yīng)性 重組蛋白GP5進(jìn)行SDS-PAGE后，濕轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，用雞卵清白蛋白4 ℃過夜封閉，用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；加入稀釋為1:100的多抗血清，4 ℃過夜孵育；用PBST緩沖液洗滌3次，每次5 min；洗滌完畢加入稀釋為1:5 000的山羊抗兔IgG H&L（HRP），4 ℃過夜孵育；用超敏型辣根過氧化氫酶DAB顯色試劑盒進(jìn)行顯色拍照。

1.2.8 間接免疫熒光法（IFA）檢測GP5多抗血清免疫反應(yīng)性 Marc-145細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá)到70%時(shí)接種PRRSV，同時(shí)設(shè)陰性對照細(xì)胞；放置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)36 h；棄掉培養(yǎng)液，PBS洗滌；加預(yù)冷后的丙酮，4 ℃固定細(xì)胞30 min；用PBS稀釋多抗血清至1:200，37 ℃孵育1 h；PBS洗滌3～5次，用PBS稀釋FITC標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體至1:2 000，37 ℃孵育1 h；用DAPI染液進(jìn)行染核，倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

2 結(jié)果

2.1 目的片段擴(kuò)增及原核質(zhì)粒構(gòu)建

以PRRSV總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，用設(shè)計(jì)的上下游引物對GP5基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到片段大小為603 bp的目的基因（圖1）目的基因與pET-32a（+）載體連接后得到pET-32a-GP5重組質(zhì)粒，對重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，與預(yù)期條帶相符合（圖2）。

圖1 GP5基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 pET-32a-GP5重組質(zhì)粒雙酶切電泳檢測結(jié)果

2.2 GP5蛋白純化

利用鎳柱，對菌體裂解產(chǎn)物上清中的GP5蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE電泳、考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果顯示，含重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a-GP5的菌體在IPTG的誘導(dǎo)下表達(dá)出了一條約30 kDa的蛋白條帶（圖3），通過純化、濃縮，獲得了GP5蛋白。經(jīng)BCA試劑盒測定該蛋白的終濃度為223.84 μg/mL。

圖3 GP5蛋白考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果

2.3 GP5蛋白Western Blot檢測

對純化后的表達(dá)蛋白進(jìn)行Western Blot鑒定，100 V電壓下轉(zhuǎn)膜80 min，一抗分別孵育PRRSV陽性血清（圖4）、His標(biāo)簽抗體（圖5）后，結(jié)果均有較為明顯的目的條帶。

圖4 孵育PRRSV陽性血清后Western Blot檢測結(jié)果

圖5 孵育His標(biāo)簽抗體后Western Blot檢測結(jié)果

2.4 GP5蛋白多抗血清Western Blot檢測

利用制備的兔多抗血清對表達(dá)蛋白GP5進(jìn)行Western Blot檢測，100 V電壓下轉(zhuǎn)膜80 min，孵育制備的多抗血清后有明顯的目的條帶（圖6），說明制備的兔多抗血清與所表達(dá)的GP5蛋白有良好的反應(yīng)性。

圖6 GP5蛋白多抗血清的Western Blot檢測結(jié)果

2.5 GP5蛋白多克隆抗體ELISA效價(jià)測定

當(dāng)多克隆抗體孔的OD450nm值與陰性對照孔比值（P/N）＞2.1時(shí)，多克隆抗體的最高稀釋度為多克隆抗體的效價(jià)。結(jié)果（圖7）顯示，純化后的兔抗GP5蛋白的多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1:64 000。

圖7 GP5蛋白多克隆抗體ELISA效價(jià)測定結(jié)果

2.6 GP5蛋白多克隆抗體IFA檢測

對感染PRRSV的Marc-145細(xì)胞應(yīng)用GP5蛋白多克隆抗體進(jìn)行IFA檢測。結(jié)果（圖8）顯示，PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞表現(xiàn)特異性的綠色熒光，而陰性對照細(xì)胞沒有熒光，說明所制備的GP5蛋白多克隆抗體能夠特異性識別PRRSV。

圖8 GP5蛋白多克隆抗體IFA檢測結(jié)果

3 討論

PRRS是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的一大疫病，自20世紀(jì)80年代在北美洲流行以來迅速波及到全球。PRRSV感染可導(dǎo)致母豬繁殖障礙和育肥豬呼吸道疾病[11-12]。有研究表明，若將GP5全基因序列克隆至原核表達(dá)載體中，由于PRRSV GP5蛋白具有疏水跨膜特性，其N端的信號肽序列使表達(dá)的蛋白錨定在細(xì)胞膜上導(dǎo)致細(xì)胞裂解，從而影響GP5蛋白的表達(dá)劑量[13-14]。周恩民等[15]將GP5基因去掉信號肽部分26個(gè)氨基酸殘基編碼區(qū)后進(jìn)行了分段表達(dá)，獲得了大量的GP5重組蛋白。楊國宇等[16]通過10種不同可溶性標(biāo)簽的表達(dá)載體，構(gòu)建10個(gè)GP5/M表達(dá)載體，并獲得高純度的GP5/M重組蛋白，通過免疫家兔，檢測出重組蛋白具有免疫原性并能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高水平的中和抗體，初步鑒定了重組蛋白的免疫效力。

本試驗(yàn)通過分析PRRSVGP5基因的相關(guān)生物學(xué)信息，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，利用原核表達(dá)載體pET-32a（+）構(gòu)建了pET-32a-GP5重組表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行GP5蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)。然后，將純化獲得的GP5蛋白與弗氏佐劑充分乳化后免疫北京大耳白兔制備了GP5蛋白兔多抗血清。Western Blot、ELISA以及IFA檢測結(jié)果顯示，該多抗血清均表現(xiàn)出了特異性免疫反應(yīng)，但Western Blot和ELISA反應(yīng)相對較弱，推測與所純化GP5蛋白濃度較低有關(guān)。徐彥召等[17]通過對GP5a蛋白序列分析，應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)獲得高濃度包涵體形式表達(dá)的重組蛋白，并與PRRSV陽性血清進(jìn)行Western Blot試驗(yàn)，證實(shí)目標(biāo)蛋白具有良好的反應(yīng)原性。本試驗(yàn)中，由于僅對菌體裂解液上清中的GP5蛋白進(jìn)行了收集純化，未純化包涵體蛋白，因此獲得的GP5蛋白濃度偏低，雖然在免疫北京大耳白兔后產(chǎn)生了特異性的多抗血清，但Western Blot和ELISA反應(yīng)性相對較弱。

綜上，本研究成功構(gòu)建了PRRSV pET-32a-GP5原核表達(dá)載體，并對GP5蛋白進(jìn)行了大量誘導(dǎo)表達(dá)及純化，獲得了目的蛋白。通過免疫實(shí)驗(yàn)動物成功制備出GP5蛋白的多克隆抗體。PRRSV GP5原核蛋白的體外表達(dá)及多克隆抗體的成功制備，為進(jìn)一步研究PRRSV血清學(xué)檢測方法以及疫苗免疫效果評價(jià)提供了重要依據(jù)。