葛根復(fù)合固體飲料保護(hù)化學(xué)性肝損傷的研究

黃 敏 鄭建仙 董慶亮 李加興

(1. 華南理工大學(xué)，廣東 廣州 510640；2. 吉首大學(xué)，湖南 吉首 416000)

葛根復(fù)合固體飲料保護(hù)化學(xué)性肝損傷的研究

黃 敏1鄭建仙1董慶亮1李加興2

(1. 華南理工大學(xué)，廣東 廣州 510640；2. 吉首大學(xué)，湖南 吉首 416000)

以葛根、山楂、酸刺、黃秋葵、干姜、玉米肽和結(jié)晶果糖為原料制備的固體飲料為受試物，研究其對Wistar大鼠CCl4所致化學(xué)性肝損傷的輔助保護(hù)作用。將Wistar大鼠隨機(jī)分為陰性對照組、模型對照組和3個劑量的試驗(yàn)組，分別灌胃蒸餾水或1.08，2.17，4.33 g/kg bw的受試物。連續(xù)30 d后，給除陰性對照組外大鼠灌胃CCl4，成功建立化學(xué)性肝損傷模型，并測定丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、甘油三酯(TG)值，取肝臟稱重并作病理切片，計算肝臟系數(shù)及觀察肝臟的病理改變情況。相對于模型對照組大鼠，3個試驗(yàn)組大鼠在灌胃CCl4后，其ALT、AST水平及肝臟系數(shù)明顯較低，肝組織病理改變也呈不同程度的減輕，其中以高劑量試驗(yàn)組的效果最為顯著。因此，該受試物具有良好的輔助保護(hù)化學(xué)性肝損傷的功能。

葛根；玉米肽；化學(xué)性肝損傷；動物試驗(yàn)

肝臟是機(jī)體內(nèi)以代謝為主的器官，參與多種化學(xué)物質(zhì)代謝，同時還是人體內(nèi)最大的解毒器官。目前，各種污染隨著現(xiàn)代工業(yè)化的發(fā)展而日益加劇，各種肝毒性化合物也日益增多，由此可能導(dǎo)致的化學(xué)性肝損傷大大增加。因此，具有保護(hù)化學(xué)性肝損傷功能的食品飲料，在增強(qiáng)免疫力，加速化學(xué)毒物的代謝分解和保護(hù)肝臟等方面，可發(fā)揮良好作用。

大量研究[1-3]表明，葛根具有明顯解酒護(hù)肝功效。葛根包括葛根素、大豆苷、大豆苷元等功效成分[4-5]，宋小莉[6]通過小鼠腹腔注射CCl4制備急性肝損傷模型，灌胃小鼠不同劑量的葛根水煎液證實(shí)葛根水提物對CCl4誘導(dǎo)的小鼠化學(xué)性肝損傷具有一定保護(hù)作用。張建夫等[7]利用酒精比重計測定葛根在不同條件下與酒精作用的密度，發(fā)現(xiàn)葛根在唾液酶的作用下，可以加快酒精分解，起到保肝、護(hù)肝的功效。此外，付萍等[8]通過建立小鼠酒精性肝損傷模型發(fā)現(xiàn)玉米肽能使小鼠肝勻漿中MDA、TG含量顯著減少，GSH含量增加，且肝組織損害程度得到明顯改善。Yamaguchi等[9]研究發(fā)現(xiàn)玉米肽能夠顯著提高血漿中亮氨酸和丙氨酸的含量從而降低體內(nèi)血乙醇濃度，起到防止酒精引起的肝臟損傷的作用。

本研究擬以葛根、山楂、酸刺、黃秋葵、干姜、玉米肽和結(jié)晶果糖為原料制成的葛根復(fù)合固體飲料為受試物，以CCl4致Wistar大鼠化學(xué)性肝損傷為模型，對選用的葛根復(fù)合固體飲料的保護(hù)化學(xué)性肝損傷作用進(jìn)行動物試驗(yàn)，以檢驗(yàn)其實(shí)際護(hù)肝效果，并對其作用機(jī)理進(jìn)行理論探討。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

受試物：葛根復(fù)合固體飲料，以葛根、山楂、酸刺、黃秋葵、干姜、玉米肽和結(jié)晶果糖為原料，湖南普蘭特生物科技有限公司；

CCl4：分析純，廣州蘇喏化工有限公司；

精制菜油：益海嘉里食品營銷有限公司；

ALT、AST、TG測定試劑盒：中生北控生物科技股份有限公司；

臺式低速自動平衡離心機(jī)：TDL-40B型，北京醫(yī)用離心機(jī)廠；

紫外可見分光光度計：UV-102-02FW型，日本島津公司；

電子天平：DT500A型，常熟市意歐儀器儀表有限公司。

1.2 動物試驗(yàn)

1.2.1 試驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠40只，體重(180～200) g，中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2.2 試驗(yàn)方法 將Wistar大鼠隨機(jī)均分為陰性對照組、模型對照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組，每組8只。給試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組大鼠每日灌胃受試物，劑量分別為1.08，2.17，4.33 g/kg bw(按顆粒重計，沖劑濃度0.13 g/mL)，分別相當(dāng)于人體推薦每公斤體重日攝入量的5，10，20倍；陰性對照組和模型對照組則灌胃同體積的蒸餾水。每日1次，連續(xù)30 d。同時，各組大鼠均自由攝食與飲水。除陰性對照組外，其余4組大鼠隔夜禁食16 h后，于第31天均按5 mL/kg劑量灌胃2%濃度的CCl4溶液(精制菜油配制)，4 h后繼續(xù)給予受試物。灌胃CCl4溶液后48 h，股靜脈放血處死老鼠，分離血清，測定ALT、AST、TG水平，并取肝臟觀察病理損傷情況。

1.2.3 血清生化指標(biāo)測定 大鼠股靜脈取血后，靜置，3 000 r/min 離心10 min后得血清，采用速率法以丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、甘油三酯(TG)測定試劑盒操作方法，采用紫外可見分光光度計測定血清ALT、AST和TG值。

1.2.4 肝組織病理檢查 根據(jù)衛(wèi)生部發(fā)布的《保健食品檢驗(yàn)與評價技術(shù)規(guī)范》(2003年版)中“對化學(xué)性肝損傷有輔助保護(hù)功能檢驗(yàn)方法”進(jìn)行。解剖取肝臟，計算肝臟系數(shù)；10%福爾馬林將肝組織固定，按常規(guī)做組織病理切片檢查(石蠟包埋，H.E.染色)，普通光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄組織病理改變情況。分別記錄每個視野中各種病變所占視野的面積，并累計所觀察視野的病變總分。評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 病理損傷評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scoring criteria of pathological lesion

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，組間采用單因素方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05，組間數(shù)據(jù)顯著，P<0.01，組間數(shù)據(jù)極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 受試物對大鼠體重的影響

各組大鼠在試驗(yàn)初期(0 d)、中期(15 d)和末期(30 d)分別稱重，結(jié)果見表2。由表2可知，經(jīng)過灌胃不同劑量的受試物30 d后，各試驗(yàn)組與CCl4模型組、陰性對照組相比，各個時期大鼠體重及增重差異均無顯著性(P>0.05)，表明該受試物對大鼠體重基本無影響。

2.2 受試物對大鼠血清中ALT、AST、TG的影響

由表3可知，陰性對照組大鼠血清各項生化指標(biāo)均處于正常范圍內(nèi)，而CCl4模型對照組的血清ALT和AST較陰性對照組顯著升高(P<0.01)，說明CCl4致肝細(xì)胞損傷，其細(xì)胞膜通透性改變，ALT、AST釋放入血從而血清中ALT、AST水平升高，成功建立化學(xué)性肝損傷模型[10]。3個試驗(yàn)組中，在灌胃不同劑量的受試物后，其ALT和AST水平都有了相應(yīng)程度的下降，其中試驗(yàn)Ⅱ、Ⅲ組較模型對照組差異極顯著(P<0.01)，試驗(yàn)Ⅰ組的ALT值與模型對照組差異顯著(P<0.05)，AST值雖無顯著性差異，但是其AST值低于模型對照組。各試驗(yàn)組的TG值雖無顯著性差異，但高劑量組的TG值仍接近于陰性對照組。因此，受試物在1.08，2.17，4.33 g/kg bw(相當(dāng)于人體推薦每公斤體重日攝入量的5，10，20倍)劑量時，具有降低CCl4致大鼠化學(xué)性肝損傷血清ALT、AST的作用，尤以高劑量組的效果最為明顯。

2.3 受試物對大鼠肝臟系數(shù)的影響

由表4可知，模型對照組肝臟系數(shù)較陰性對照組顯著增加(P<0.01)，說明灌胃CCl4明顯引起了大鼠肝損傷，肝臟腫脹效果明顯。通過與模型對照組比較，各試驗(yàn)組大鼠的肝臟系數(shù)均呈不同程度的下降，其中高劑量組效果顯著(P<0.01)，且接近于陰性對照組。

表2 受試物對大鼠體重的影響Table 2 Effect of the test substance on the mice weight (n=8)

表3 受試物對大鼠血清ALT、AST、TG的影響?Table 3 Effect of the test substance on the level of serum ALT, AST and TG in mice (n=8)

? 與陰性對照組相比，* P<0.05，** P<0.01；與模型對照組相比，△ P<0.05，△△ P<0.01。

2.4 受試物對大鼠肝組織病理學(xué)的影響

由表5可知，陰性對照組大鼠的肝臟結(jié)構(gòu)基本正常，而CCl4則明顯引起了肝損傷，導(dǎo)致大鼠肝小葉中心性肝細(xì)胞的氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝集和肝細(xì)胞壞死等病變，說明模型建立成功。灌胃受試物的3個試驗(yàn)組中，高劑量組在氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝集和肝細(xì)胞壞死的病理積分都明顯低于模型對照組，且具有差異性顯著(P<0.05)，其他中、低劑量組各項指標(biāo)較模型對照組雖沒有明顯降低(P>0.05)，但仍呈減輕趨勢，且隨受試物的濃度增加，各項病變積分相對下降。

表4 受試物對大鼠肝臟系數(shù)的影響?Table 4 Effect of the test substance on the liver coefficients of mice (n=8)

? 與陰性對照組相比，* P<0.05，** P<0.01；與模型對照組相比，△ P<0.05，△△ P<0.01。

表5 受試物對大鼠肝組織病理學(xué)的影響?Table 5 Effect of the test substance on the liver histopathology of mice (n=8)

? 與模型對照組相比，△ P<0.05，△△ P<0.01。

2.5 受試物保護(hù)化學(xué)性肝損傷的作用機(jī)理探討

選用的葛根復(fù)合固體飲料以葛根、山楂、酸刺、黃秋葵、干姜、玉米肽和結(jié)晶果糖為原料，經(jīng)生物技術(shù)、高新分離技術(shù)提取制備而成，整個生產(chǎn)過程對原料中的功效成分進(jìn)行了最大限度的提取和活性保留，以保證其功效成分的高含量和強(qiáng)活性，而顯示出良好的生理功效。

葛根中含有豐富的異黃酮類化合物和皂苷成分，其具有較好的抗氧化作用，可以不同程度地清除體內(nèi)自由基，減少氧自由基和其他自由基對肝臟的損害，降低肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化程度，提高體內(nèi)抗氧化酶的活性，維持肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能的完整[11-12]。同時研究[13]表明，葛根粗提物可以一定程度上抑制乙醇引起的胃腸道通透性增加，從而起到保護(hù)腸粘膜的作用。此外，葛根提取物以及葛根素可以一定程度上減少乙醇分解代謝過程中所產(chǎn)生的自由基，從而減輕免疫應(yīng)激反應(yīng)給肝細(xì)胞帶來的損傷。徐茂紅等[14]發(fā)現(xiàn)葛根總黃酮能降低CCl4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷小鼠肝勻漿中MDA、IFN-γ、TNF-α的活性，推測其作用機(jī)制可能與減少細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的表達(dá)有關(guān)。

玉米肽護(hù)肝效果同樣明顯，王雙玉等[15]通過建立小鼠酒精性肝損傷模型，觀察到玉米肽劑量組小鼠肝勻漿中MDA含量明顯降低，GSH-PX活力明顯升高，表明玉米肽具有良好的清除自由基和抗氧化能力，可對抗酒精所引起的肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，清除酒精在肝臟中所產(chǎn)生的自由基，從而減輕肝細(xì)胞損傷。同時有研究[16]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)肝臟發(fā)生急性損傷時，會使得人體血漿中支鏈氨基酸和芳香族氨基酸的分子比值下降。玉米肽因其具有高F值，能夠有效維持血漿中支鏈氨基酸的濃度，從而減輕肝臟損傷。

CCl4是典型的化學(xué)性肝損傷動物模型的毒劑，其機(jī)理主要是其代謝過程中產(chǎn)生大量自由基CCl3·和CCl3OO·，會破壞肝細(xì)胞膜上的磷脂分子從而引起脂質(zhì)過氧化，破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)達(dá)到致肝臟損傷的目的[17]，試驗(yàn)結(jié)果證明受試物對CCl4所致大鼠化學(xué)性肝損傷有很好的保護(hù)作用，提示其可能通過上述機(jī)制發(fā)揮保肝作用，即抑制肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化從而修復(fù)損傷的肝細(xì)胞。

此外，由于該固體飲料成分比較復(fù)雜多樣，除上述提及的功效成分以外，其可能還含有其他的功能因子，尚待進(jìn)一步的研究與探討。

3 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果顯示，葛根復(fù)合固體飲料各劑量組大鼠與CCl4模型組、陰性對照組大鼠體重數(shù)據(jù)并無顯著性差異，說明受試物對動物體重基本無影響。CCl4模型組大鼠血清中ALT、AST活性較陰性對照組顯著升高(P<0.01)，說明CCl4致大鼠肝細(xì)胞損傷成功，細(xì)胞膜通透性改變，血清中ALT、AST水平升高。灌胃不同劑量的受試物后，ALT、AST水平都呈下降趨勢，尤以中高劑量組效果明顯(P<0.01)。此外，CCl4模型組大鼠肝臟系數(shù)較陰性對照組顯著增加(P<0.01)，肝臟腫脹嚴(yán)重，且觀察到氣球樣變、脂肪變性、胞漿凝集和肝細(xì)胞壞死等病變現(xiàn)象。而同樣受毒但灌胃不同劑量受試物的3個試驗(yàn)組的大鼠，其肝臟系數(shù)明顯下降，肝組織病理改變也都呈不同程度的減輕，尤其是高劑量組的效果最為明顯(P<0.05)。因此，葛根復(fù)合固體飲料對試驗(yàn)動物具有良好的保護(hù)化學(xué)性肝損傷的作用。

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Study on protective effect of puerarin solid beverage on chemical hepatic injury

HUANG Min1ZHENGJian-xian1DONGQing-liang1LIJia-xing2

(1.SouthChinaUniversityofTechnology,Guangzhou,Guangdong501640,China; 2.JishouUniversity,Jishou,Hunan416000,China)

With puerarin solid beverage made ofpueraria, hawthorn, acid gill, okra,Rhizomazingiberis, corn peptide and crystalline fructose as the test substance, to study its protection function on chemical hepatic injury by CCl4in the Wistar mice. Wistar mice were randomly allocated to negative control group, model control group and three experiment groups, which were treated with intubation of distilled water or 1.08, 2.17 or 4.33 g/kg test substance per day for 30 days. Groups which except negative control group were treated with gastric intubation of CCl4, and the chemical hepatic injury model was gained. The level of serum alanine aminotransferase (ALT), aspartate aminotransferase (AST), triglyceride (TG) were detected, and then take the liver weight and pathological section for the liver coefficients and observing the pathological changes of liver. Compared with model control group, ALT, AST and liver coefficients were decreased significantly in experiment groups after gastric intubation of CCl4, also with the mitigatory pathologic changes. And the highest dose experiment group (experiment Ⅲ) gained the most significant effects. Thus, the test substance could protect liver against chemical hepatic injury.

Radixpuerariae; corn peptides; chemical hepatic injury; animal experiment

黃敏，男，華南理工大學(xué)在讀碩士研究生。

鄭建仙(1966-)，男，華南理工大學(xué)教授，博士生導(dǎo)師，博士。E-mail: fejxzhen@scut.edu.cn

2016-12-19

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.02.027