蛋白A介質(zhì)抗體吸附性能及耐堿性的量熱學(xué)

盛　志，史清洪，白　姝

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072； 2.中化集團(tuán)沈陽(yáng)化工研究院，沈陽(yáng) 110021)

單克隆抗體(簡(jiǎn)稱單抗)被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究、醫(yī)學(xué)診斷和治療等多個(gè)領(lǐng)域。單抗藥物是治療乳腺癌、哮喘、關(guān)節(jié)炎、銀屑病、器官移植免疫排斥等多種疾病的特效藥，是生物醫(yī)藥領(lǐng)域中成長(zhǎng)最快的一類藥物?？贵w類藥物銷售額在2007年時(shí)就已經(jīng)達(dá)到263億美元，約占生物制藥市場(chǎng)的35%[1]，預(yù)計(jì)在2017年將達(dá)到1 410億美元。在過(guò)去的20～30年間單抗的生產(chǎn)工藝飛速發(fā)展，抗體的表達(dá)滴度和發(fā)酵規(guī)模都顯著增加，20 000 L以上的反應(yīng)器已被普遍采用。下游生產(chǎn)過(guò)程中的純化技術(shù)逐漸成為單抗藥物制備中的主要瓶頸，開發(fā)高效的抗體純化技術(shù)成為單抗藥物制備中亟待解決的重要問(wèn)題。

蛋白A色譜對(duì)抗體具有很高的選擇性和親和性，抗體經(jīng)過(guò)蛋白A色譜一步純化就可以達(dá)到很高的純度和收率，蛋白A色譜已成為抗體純化工業(yè)中的金標(biāo)準(zhǔn)。0.5 mol·L-1NaOH清洗是絕大多數(shù)色譜介質(zhì)在位清洗(clean in place, CIP)的標(biāo)準(zhǔn)方法，但傳統(tǒng)的蛋白A色譜介質(zhì)在堿性環(huán)境中的穩(wěn)定性較差，難以耐受使用高濃度NaOH的CIP條件[2]。為了提高蛋白A色譜配基的堿性耐受性，已有研究者用蛋白質(zhì)工程技術(shù)構(gòu)建突變的蛋白A，并從中篩選出能夠抵抗工業(yè)純化中的惡劣的堿性環(huán)境的配基。天然蛋白A中含有5個(gè)抗體結(jié)合域,分別為A、B、C、D和E，每個(gè)結(jié)合域都可以獨(dú)立地與抗體的Fc片段相結(jié)合，其中B結(jié)合域的研究最為廣泛[3]。為了提高B結(jié)構(gòu)域?qū)A性環(huán)境的耐受性，將位于28～29的殘基Asn-Gly進(jìn)行定向突變?yōu)锳sn-Ala，得到重組的Z結(jié)構(gòu)域[4]。此突變可以提高蛋白A在堿性環(huán)境下的穩(wěn)定性，還降低蛋白A與抗體的Fab片段的非特異性吸附。研究表明將4或5個(gè)Z結(jié)合域頭尾相連形成的重組突變蛋白A，與抗體的結(jié)合容量同天然蛋白A分子的結(jié)合容量相似。使用親和色譜中的洗脫條件也更加緩和(洗脫pH值由3.3變?yōu)?.5)，是目前應(yīng)用最為廣泛的蛋白A配基之一。而將Z結(jié)合域的其他位置的天冬酰胺殘基進(jìn)行突變，還可以進(jìn)一步增強(qiáng)Z結(jié)合域的穩(wěn)定性[5]。

等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry, ITC)是用于定量研究生物分子相互作用的微量熱測(cè)量方法，它可以直接測(cè)量生物分子結(jié)合過(guò)程中釋放或吸收的熱量。之前已經(jīng)有報(bào)道ITC被應(yīng)用于表征抗體分子和游離親和配基(包括蛋白A、蛋白G和小分子合成親和配基)的相互作用[6-10]，而且ITC也被用于考察疏水電荷誘導(dǎo)色譜介質(zhì)對(duì)蛋白的吸附過(guò)程[11]。但抗體分子與蛋白A配基色譜介質(zhì)結(jié)合的熱力學(xué)分析還未見(jiàn)報(bào)道。

微量差示掃描量熱法(Differential scanning calorimetry，DSC)可以通過(guò)溫度的升降檢測(cè)生物分子發(fā)生的熱量變化。生物分子在溶液狀態(tài)中處于天然(折疊)構(gòu)象和變性(去折疊)構(gòu)象這2種狀態(tài)的平衡。相變溫度Tm(該溫度時(shí)50%的生物分子為去折疊狀態(tài))越高，分子穩(wěn)定性越強(qiáng)。DSC可用于蛋白類藥物開發(fā)過(guò)程中的穩(wěn)定性檢測(cè)和藥物的保質(zhì)期預(yù)測(cè)[12]。

本研究使用ITC和DSC等量熱學(xué)方法研究了重組蛋白A親和色譜吸附抗體過(guò)程的熱力學(xué)性質(zhì)，得到了抗體與介質(zhì)結(jié)合的焓變與熵變等熱力學(xué)參數(shù)，為使用計(jì)算機(jī)模擬方法設(shè)計(jì)擬蛋白A親和配基提供了可參考的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步設(shè)計(jì)和改進(jìn)重組蛋白A配基提供了基礎(chǔ)。

1　材料和方法

1.1　材料

微生物培養(yǎng)用的胰蛋白胨和酵母提取物購(gòu)自O(shè)XOID(英國(guó))；γ-球蛋白(IgG)；1，4-丁二醇二縮水甘油醚(BDGE)；縮水甘油醚三甲基氯化銨(GTMAC)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司(美國(guó))；Q Sepharose HP和Sepharose CL-6B介質(zhì)購(gòu)自GE Healthcare(美國(guó))；BCA試劑盒購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑為本地采購(gòu)的分析純?cè)噭B液體培養(yǎng)基配方：10 g·L-1胰蛋白胨，5 g·L-1酵母提取物，10 g·L-1NaCl。LB固體培養(yǎng)基在上述配方中再添加15, g·L-1瓊脂粉。

SpAZ是由化學(xué)法合成的，購(gòu)自北京華大蛋白。SpA4z和SpA4m的基因委托北京華大蛋白合成，并連接到表達(dá)質(zhì)粒pET-30a(+)-SpA4z和pET-30a(+)-SpA4m上，質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21菌株中進(jìn)行表達(dá)。SpA4z和SpA4m的氨基酸序列見(jiàn)圖1。

圖1　SpAZ，SpA4z和SpA4m的氨基酸序列Fig.1　The amino acid sequence of SpAz，SpA4z and SpA4m

1.2　方法

1.2.1SpA4z和SpA4m的表達(dá)與純化

將保存在-80 ℃冰箱中的含有質(zhì)粒pET-30a(+)-SPA4Z的大腸桿菌BL21菌株在LB平板培養(yǎng)基上劃線分離，挑取單菌落接種到含30 mg·L-1硫酸卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，用作種子液。將種子液稀釋200倍接種，于37 ℃，220 r·min-1下培養(yǎng)，待OD600值達(dá)到0.4～0.6后，加入終濃度為0.5 mmol·L-1的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h左右。菌體在4 800 r·min-1離心30 min后收集，用20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)重懸；重懸菌液經(jīng)超聲破碎后離心收集上清液。收集的上清液用0.44 μm濾膜過(guò)濾后備用。

使用Q-Sepharose High Performance離子交換色譜從上述的上清液中提取SpA4z。色譜平衡緩沖液為20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)，洗脫緩沖液為含1 mol·L-1NaCl的20 mmol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=7.5)，洗脫條件為洗脫緩沖液在30 min內(nèi)由0%升至15%，目標(biāo)蛋白SpA4Z在電導(dǎo)率為8～11 mS·cm-1下洗脫，見(jiàn)圖2。收集的SpA4Z產(chǎn)物經(jīng)透析除鹽后，冷凍干燥備用。樣品中蛋白純度用SDS-PAGE分析。SpA4m的表達(dá)與純化方法與SpA4z相同。

圖2　純化SpA的離子交換色譜圖Fig.2　Ion exchange chromatograms for purifying SpA

1.2.2親和介質(zhì)的制備

SpA色譜介質(zhì)通過(guò)1,4-丁二醇二縮水甘油醚(BDDE)活化法將SpA配基偶聯(lián)于Sepharose CL-6B上實(shí)現(xiàn)，見(jiàn)圖3。具體方法如下：將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%乙醇溶液保存的Sepharose CL-6B介質(zhì)在G3漏斗用大量雙蒸水洗滌，抽干10 min后，稱取10 g抽干介質(zhì)置于100 mL錐形瓶中，加入5 mL 75%(質(zhì)量比)GTMAC、5 mL 0.645 mol·L-1NaOH?；旌暇鶆蚝?，將錐形瓶置于空氣搖床中在170 r·min-1和25 ℃下反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)后的介質(zhì)用大量雙蒸水清洗并抽干10 min；然后稱取2 g抽干的介質(zhì)置于25 mL三角瓶中，用1.2 mL 4.6 mol·L-1NaOH溶液充分懸浮后，加入4 mL BDDE；混合均勻，在35 ℃和170 r·min-1條件下，反應(yīng)約2 h。反應(yīng)后的介質(zhì)經(jīng)大量雙蒸水洗滌后，加入10 mmol·L-1NaHCO3溶液平衡；平衡后的上述介質(zhì)抽干10 min，抽干介質(zhì)置于含有10 mmol·L-1NaHCO3的蛋白溶液中，充分懸浮后于37 ℃和170 r·min-1下反應(yīng)約2 h。反應(yīng)后介質(zhì)用10 mL雙蒸水清洗3遍并抽干。向抽干的介質(zhì)中加入4 mL封閉緩沖液，封閉緩沖液由1 mL 巰基乙醇和9 mL 含0.5 mol·L-1NaCl的0.2 mol·L-1NaHCO3溶液配置。上述混合物于25 ℃和170 r·min-1反應(yīng)過(guò)夜。得到的產(chǎn)物用10 mL下述溶液依次洗滌3遍：含0.15 mol·L-1NaCl 的0.1 mol·L-1Tris-HCl緩沖液(pH=8)和50 mmol·L-1乙酸(pH=4.5)。洗滌后的介質(zhì)再分別用雙蒸水和20%乙醇溶液清洗，最后保存于20%乙醇溶液中。配基密度采用BCA法進(jìn)行測(cè)量。

1.2.3吸附平衡實(shí)驗(yàn)

本研究采用間歇法研究抗體在親和介質(zhì)上的吸附平衡。吸附實(shí)驗(yàn)中以含0.1 mol·L-1NaCl 的0.02 mol·L-1PBS緩沖液(pH 7.5)為吸附緩沖液，抗體溶液亦采用吸附緩沖液配置。具體實(shí)驗(yàn)方法如下：親和介質(zhì)用大量雙蒸水清洗并抽干后，在吸附緩沖液中平衡4 h；平衡后將介質(zhì)抽干10 min，依次稱取0.01 g抽干介質(zhì)分別置于1.5 mL離心管中，然后向每支離心管中加入1 mL不同濃度的抗體溶液。混合均勻后，離心管置于搖床中在25 ℃和170 r·min-1下震蕩反應(yīng)約8 h。反應(yīng)結(jié)束后，離心管在4 000 r·min-1下離心10 min收集上清液并在280 nm下測(cè)定其中的蛋白濃度。然后，根據(jù)物料平衡公式(1)計(jì)算靜態(tài)吸附量：

圖3　親和介質(zhì)的制備Fig.3　The synthesis scheme of affinity beads

(1)

其中：q表示吸附劑上抗體吸附量(mol/g)，C0表示初始抗體濃度(mol·L-1)，C表示吸附平衡時(shí)上清液中抗體濃度(mol·L-1)，V表示液相體積(L)，m表示抽干的介質(zhì)質(zhì)量(g)。

1.2.4等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)

等溫滴定微量熱實(shí)驗(yàn)使用VP-ITC(Microcal，美國(guó))，所用的緩沖液與吸附平衡實(shí)驗(yàn)相同。用吸附緩沖液分別配置100 μmol·L-1的抗體溶液和10 μmol·L-1游離的SpA4Z的溶液，蛋白濃度用BCA法測(cè)定后，將上述溶液在24.8 ℃下各自恒溫脫氣20 min后，SpA4Z溶液注入樣品池中，抗體溶液加入到滴定注射器中，以吸附緩沖液作為參比池溶液，在25 ℃下滴定樣品池中的SpA4Z溶液，共滴定30滴，每滴7 μL，每滴間隔300 s，攪拌轉(zhuǎn)速307 r/min。用相同方法測(cè)定抗體溶液與吸附緩沖液之間的稀釋熱。

親和介質(zhì)用大量雙蒸水清洗，并用吸附緩沖液平衡4 h。抽干10 min，稱取200 mg抽干介質(zhì)，用2.5 mL吸附緩沖液充分懸浮。將介質(zhì)懸浮液和抗體溶液在24.8 ℃下恒溫脫氣20 min后，介質(zhì)懸浮液加入到樣品池中，抗體溶液加入到滴定注射器中，以吸附緩沖液作為參比池溶液,在25 ℃下等溫滴定樣品池中的抗體懸浮液，每滴間隔20 min，攪拌轉(zhuǎn)速307 r/min。

用相同方法測(cè)定SpAZ在偶聯(lián)前后與抗體的結(jié)合過(guò)程熱力學(xué)行為。

1.2.5示差掃描量熱實(shí)驗(yàn)

示差掃描量熱實(shí)驗(yàn)使用VP-DSC(Microcal，美國(guó))，儀器的樣品池體積為0.5282 mL。分別用含0.1 mol·L-1NaCl的0.02 mol·L-1PBS緩沖液(pH=6.0)和0.5 mol·L-1NaOH溶液配置SpAZ、SpA4z和SpA4m蛋白溶液(濃度均為1 g·L-1)。將含0.1 mol·L-1NaCl的0.02 mol·L-1PBS緩沖液(pH=6.0)及該緩沖液配置的蛋白溶液分別加入到參比池和樣品池中，檢測(cè)蛋白在pH值為6.0的穩(wěn)定性。溶液在加入前先真空脫氣30 min。在加熱測(cè)試開始前設(shè)定實(shí)驗(yàn)溫度平衡30 min。掃描溫度范圍為25～110 ℃，升溫幅度為1 ℃·min-1。將0.5 mol·L-1NaOH及以0.5 mol·L-1NaOH溶液配置的蛋白溶液分別加入到參比池和樣品池中，用相同的方法檢測(cè)蛋白在堿性條件下的穩(wěn)定性。數(shù)據(jù)處理均使用儀器自帶的MicroCal-enabled Origin 7.0軟件完成。

1.2.6色譜實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證配基的堿性穩(wěn)定性

將合成的SpA4z-sepharose和SpA4m-sepharose介質(zhì)裝于色譜柱Tricorn 5/50，柱體積約為1 mL。用0.5 mol·L-1的NaOH分別浸泡介質(zhì)0 h、8 h和16 h。用NaOH浸泡后的介質(zhì)進(jìn)行色譜實(shí)驗(yàn)：對(duì)NaOH處理后的介質(zhì)用平衡緩沖液平衡后進(jìn)行上樣；上樣溶液為2 g·L-1IgG，流速為1 mL·min-1，上樣量為40 mL，用平衡緩沖液沖洗40 mL，0.1 mol·L-1檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫10 mL，用0.5 mol·L-1的NaOH 再生10 mL。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1　SpA4z和SpA4m的表達(dá)與純化

SpA4Z蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量約27.4 kD)是由大腸桿菌發(fā)酵，將收集的細(xì)胞破碎，再將破碎后的上清液經(jīng)離子交換色譜純化獲得。發(fā)酵液及各種步產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果如圖4所示。

圖4　蛋白A表達(dá)和純化產(chǎn)物電泳圖Fig.4　SDS-PAGE profile of SpA4z expression

電泳結(jié)果顯示，加入IPTG誘導(dǎo)后的全菌破碎液(電泳帶1)在27.4 kD處有明顯的蛋白條帶，而發(fā)酵液離心上清液(電泳帶2)中沒(méi)有可見(jiàn)的目的蛋白，說(shuō)明SpA4z主要為胞內(nèi)表達(dá)；全菌液離心后，上清液中有明顯的目的蛋白條帶，而沉淀中的目的蛋白含量很少，說(shuō)明SpA4z蛋白主要為可溶性表達(dá)。經(jīng)離子交換色譜純化得到的產(chǎn)物只有一條明顯的電泳帶，目的蛋白純度大于95%，可作為親和配基合成SpA親和色譜介質(zhì)。SpA4m的表達(dá)與純化與SpA4z類似。

2.2　親和介質(zhì)的吸附抗體的熱力學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了SpA4z-sepharoseh,SpAz-sepharose的吸附平衡等溫線。用BCA法測(cè)得SpA4z-sepharose的配基密度為1.8 mg/g，SpAZ-sepharose的配基密度為0.83 mg/g (以gel計(jì)，下同)。根據(jù)SpA4z的相對(duì)分子質(zhì)量為27.43 kD，SpAZ的相對(duì)分子質(zhì)量為6.64 kD。從而得到SpA4z-sepharose摩爾配基密度為6.56×10-8mol/g，SpAz-sepharose摩爾配基密度為1.25×10-7mol/g。

圖5　抗體在SpA4Z-Sepharose和SpAZ-Sepharose上的吸附等溫線Fig.5　Adsorption equilibrium of SpA4Z-Sepharose and SpAZ-Sepharose

抗體在親和介質(zhì)上的吸附平衡實(shí)驗(yàn)結(jié)果為圖5所示，親和介質(zhì)上蛋白質(zhì)的吸附量q隨溶液中抗體濃度C的增加而增加，直到達(dá)到吸附飽和。從圖5中可以看出，吸附等溫線符合Langmuir模型，可用方程(2)擬合抗體在親和介質(zhì)上的吸附平衡數(shù)據(jù)。

(2)

其中，qm和Kd分別為飽和吸附容量(mol/g)和解離常數(shù)(mol·L-1)。解離常數(shù)Kd為結(jié)合常數(shù)Kb的倒數(shù)，可以反映結(jié)合的親和力大小，Kd越小表明親和作用的結(jié)合力越強(qiáng)。

擬合后得到抗體在SPA4z-sepharose介質(zhì)上的qm值為1.43×10-7mol/g，Kd為2.08×10-6mol·L-1；而抗體在SpAZ-sepharose介質(zhì)上的qm為1.35×10-7mol/g，Kd為5.36×10-6mol·L-1。

SpA4z-sepharose摩爾配基密度為6.56×10-8mol/g，qm為1.43×10-7mol/g，即抗體與SpA4z親和配基結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比約為2.2∶1。SpAZ-sepharose摩爾配基密度為1.25×10-7mol/g，qm為1.35×10-7mol/g，抗體分子與SpA4z親和配基結(jié)合的化學(xué)計(jì)量比約為1∶1。SpA4z含有4個(gè)抗體結(jié)合域，理論上能結(jié)合4個(gè)抗體分子，但實(shí)際上只能結(jié)合約2.2個(gè)抗體分子。而SpAZ卻能與抗體分子以接近于1∶1的比例結(jié)合。Ghose等[13]的實(shí)驗(yàn)表明，含有5個(gè)抗體結(jié)合域的游離的SpA分子只能結(jié)合2.4～3.1個(gè)抗體分子，本實(shí)驗(yàn)用固定化的SpA4z分子，得到了類似的結(jié)果。當(dāng)多個(gè)抗體與SpA4z結(jié)合時(shí)，分子之間可能存在空間位阻效應(yīng)，使得SpA4z中4個(gè)抗體結(jié)合域不能被充分占用。

SpA4z-sepharose的Kd小于SpAZ-sepharose，說(shuō)明抗體與SPA4z-sepharose介質(zhì)的結(jié)合作用更強(qiáng)。本研究采用ITC測(cè)量了結(jié)合過(guò)程的焓變，以揭示結(jié)合作用的機(jī)制?？贵w滴定SpA4Z-sepharose介質(zhì)的滴定曲線如圖6所示。

圖6　抗體溶液與SpA4z-sepharose的滴定曲線Fig.6　ITC curves of SpA4z-sepharose

用儀器自帶的MicroCal-enabled Origin 7.0軟件對(duì)其積分并歸一化得到抗體溶液與SpA4Z-sepharose的結(jié)合焓變?chǔ)為-47.8 kJ·mol-1，進(jìn)而利用式(2)、式(3)、式(4)和式(5)，

(3)

ΔG=-RTlnKC

(4)

ΔG=ΔH-TΔS

(5)

可計(jì)算得到，ΔG為-10.5 kJ·mol-1, ΔS為-125 J·(mol·K)-1。用相同的方法得到抗體與Z-sepharose的結(jié)合焓變?chǔ)為-10.1 kJ·mol-1，吉布思自由能變?chǔ)為-8.0 kJ·mol-1，熵變?chǔ)為-7.1 J·(mol·K)-1。

游離配基與抗體的等溫滴定曲線如圖7所示，游離配基與抗體結(jié)合的熱力學(xué)常數(shù)可以直接由等溫滴定量熱法測(cè)得。SpA4z與抗體結(jié)合的ΔG為-42 kJ·mol-1，ΔH為-146 kJ·mol-1，ΔS為-350 J·(mol·K)-1。Z結(jié)合域與抗體結(jié)合的ΔG為-41 kJ·mol-1, ΔH為-138 kJ·mol-1，ΔS為-327 J·(mol·K)-1。

圖7　抗體溶液與游離配基SpA4Z和游離配基SpAZ的滴定曲線Fig.7　ITC curves of free SpA4Z and SpAZ

SpAZ與SpA4Z固定化前后與抗體結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)可參見(jiàn)表1。

表1　熱力學(xué)參數(shù)

引發(fā)焓變的主要因素是靜電相互作用，引發(fā)熵變的主要因素是疏水相互作用和構(gòu)象自由度。由SpA與抗體結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)可知，SpA與抗體的結(jié)合是由焓變驅(qū)動(dòng)的，而熵變不利于SpA與抗體的結(jié)合，這與前人的研究一致[8]，SpA與抗體結(jié)合的主要是由靜電相互作用驅(qū)動(dòng)的。與SpAZ和抗體的結(jié)合相比，SpA4Z與抗體結(jié)合的焓變和熵變均有提高，而兩者的自由能變非常接近，這暗示著配基中Z結(jié)構(gòu)域單體數(shù)量增加所導(dǎo)致的焓變主要用于補(bǔ)償熵變的降低。固定化之后SpA4Z-Sepharose與抗體的結(jié)合焓變較SpAZ-Sepharose迅速降低，雖然SpA4Z-Sepharose的結(jié)合過(guò)程熵變也有所降低，但自由能變的結(jié)果顯示SpA4Z-Sepharose更有利于親和吸附的進(jìn)行。

2.3　蛋白穩(wěn)定性檢測(cè)

微量差示掃描量熱結(jié)果，如圖8所示。

圖8　微量差示掃描量熱結(jié)果Fig.8　Results of DSC

用MicroCal-enabled Origin軟件擬合后得到的Tm值見(jiàn)表2?？梢钥闯觯琍BS緩沖液環(huán)境下SpA4m的Tm值高于SpA4z，而Z domain的Tm值最低。這表明SpA4m的穩(wěn)定性高于SpA4z，而單一Z結(jié)構(gòu)域的穩(wěn)定性最差。NaOH溶液使蛋白的Tm降低，穩(wěn)定性下降。但同樣NaOH條件下SpA4m的Tm值依舊高于SpA4z。實(shí)驗(yàn)表明，SpA4m的穩(wěn)定性高于SpA4z，對(duì)SpA4z進(jìn)行的突變提高了它的穩(wěn)定性。

表2　DSC擬合結(jié)果

NaOH處理后的SpA4z-sepharose和SpA4m-sepharose親和介質(zhì)的色譜圖9如所示。

圖9　色譜實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SpA4z-sepharose和SpA4m-sepharose介質(zhì)的耐堿性能Fig.9　Alkaline stability analysis of SpA4z-sepharose and SpA4m-sepharose

由圖9可以看出，NaOH處理使得介質(zhì)的吸附容量下降。對(duì)色譜峰進(jìn)行積分分析，可知NaOH處理SpA4z-sepharose介質(zhì)8 h后使其抗體結(jié)合容量下降到41%，處理16 h后使其結(jié)合容量下降到17%。NaOH處理SpA4m-sepharose介質(zhì)8 h后使其抗體結(jié)合容量下降到77%，處理16 h后使其結(jié)合容量下降到47%?？梢钥闯鲈贜aOH處理后SpA4m-sepharose的吸附容量下降的比SpA4z-sepharose的少很多，說(shuō)明SpA4m親和介質(zhì)在堿性條件下更穩(wěn)定。

3　結(jié)語(yǔ)

將SpAZ、SpA4z和SpA4m分別偶聯(lián)到瓊脂糖介質(zhì)。用等溫滴定實(shí)驗(yàn)結(jié)合吸附平衡實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分別測(cè)定了SpAZ和SpA4z與抗體結(jié)合的熱力學(xué)性質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明固定化的SpAZ與抗體分子以約1∶1的比例結(jié)合；而固定化的SpA4z分子雖然含有4個(gè)抗體結(jié)合域，但只能結(jié)合約2.2個(gè)抗體分子。SpA4z-Sepharose與抗體結(jié)合的Kd值比SpAZ-sepharose與抗體結(jié)合的Kd值小，說(shuō)明SpA4z-Sepharose與抗體的親和性更強(qiáng)。利用等溫滴定量熱法測(cè)得結(jié)合焓，并計(jì)算出結(jié)合熵。實(shí)驗(yàn)表明，結(jié)合反應(yīng)是由焓變驅(qū)動(dòng)的，而熵變不利于反應(yīng)的進(jìn)行。SpA4z-Sepharose與抗體結(jié)合的焓變和熵變都比Z-Sepharose的要顯著，但總體效果還是焓變比熵變的作用更大。

氫氧化鈉是最常用的色譜CIP試劑，針對(duì)天然蛋白A對(duì)氫氧化鈉堿性環(huán)境耐受性較差的問(wèn)題。本研究使用微量差示掃描量熱儀檢測(cè)了SpA4z和SpA4m的穩(wěn)定性，結(jié)合色譜實(shí)驗(yàn)表明同樣經(jīng)NaOH處理，SpA4m比SpA4z具有更強(qiáng)的穩(wěn)定性。本研究工作有助于深化重組蛋白A配基與抗體的結(jié)合機(jī)制，為開發(fā)高效耐用的重組蛋白A色譜介質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]崔加友, 李菁, 林東強(qiáng), 等. 疏水性電荷誘導(dǎo)色譜分離抗HER2單克隆抗體[J]. 化工學(xué)報(bào), 2014, 65(10): 3 931-3 937

Cui Jiayou, Li Jin, Lin Dongqiang,etal. Separation and purification of anti-HER2 monoclonal antibody with hydrophobic charge-induction chromatography[J]. CIESC Journal, 2014, 65(10): 3 931-3 937 (in Chinese)

[2]Linhult M, Gulich S, Hober S. Affinity ligands for industrial protein purification[J]. Protein and Peptide Letters, 2005, 12(4): 305-310

[3]Geiger T, Clarke S. Deamidation, isomerization, and racemization at asparaginyl and aspartyl residues in peptides Succinimide-linked reactions that contribute to protein degradation[J]. The Journal of Biological Chemistry, 1987, 262(2): 785-794

[4]Nilsson B, Tomas M, Jansson B. A synthetic IgG-binding domain based on Staphylococcal protein A[J]. Protein Engineering, 1987, 1(2): 107-113

[5]Xia H, Wang S, Wu P,etal. Molecular modification of Protein A to improve the elution pH and alkali resistance in affinity chromatography[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(8): 4 002-4 012

[6]Arouri A, Garidel P, Kliche W,etal. Hydrophobic interactions are the driving force for the binding of peptide mimotopes and Staphylococcal protein A to recombinant human IgG1[J]. European Biophysics Journal: EBJ, 2007, 36(6): 647-660

[7]D′Agostino B, Bellofiore P, De Martino T,etal. Affinity purification of IgG monoclonal antibodies using the D-PAM synthetic ligand: Chromatographic comparison with protein A and thermodynamic investigation of the D-PAM/IgG interaction[J]. Journal of Immunological Methods, 2008, 333(1/2): 126-138

[8]Lund L N, Christensen T, Toone E,etal. Exploring variation in binding of Protein A and Protein G to immunoglobulin type G by isothermal titration calorimetry[J]. Journal of Molecular Recognition:JMR, 2011, 24(6): 945-952

[9]Starovasnik M A, O'Connell M P, Fairbrother W J,etal. Antibody variable region binding by Staphylococcal protein A: Thermodynamic analysis and location of the Fv binding site on E-domain[J]. Protein Science: A Publication of the Protein Society, 1999, 8(7): 1 423-1 431

[10]Van Eldijk M B, Smits F C, Thies J C,etal. Thermodynamic investigation of Z33-antibody interaction leads to selective purification of human antibodies[J]. Journal of Biotechnology, 2014, 179: 32-41

[11]Shi Q, Shen F, Sun S. Studies of lysozyme binding to histamine as a ligand for hydrophobic charge induction chromatography[J]. Biotechnol Prog, 2010, 26(1): 134-141

[12]Niedziela-Majka A, Kan E, Weissburg P,etal. High-Throughput screening of formulations to optimize the thermal stability of a therapeutic monoclonal antibody[J]. Journal of Biomolecular Screening, 2014, 20(4): 552-559

[13]Ghose S, Hubbard B, Cramer S. Binding capacity differences for antibodies and Fc-fusion proteins on protein A chromatographic materials[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 96(4): 768-779