響應(yīng)面法提取煙葉有效物質(zhì)工藝優(yōu)化

張呂鴻，王成卓，肖曉明*，趙世民，李豪豪，王玉潔，張趙鵬，姜　斌

(1.天津大學(xué)化工學(xué)院，天津 300072； 2.洛陽煙草公司，河南 洛陽 471000; 3.浙江中煙工業(yè)有限責(zé)任公司，杭州 310008)

我國是世界上最大的煙草生產(chǎn)國，每年有大約25%的煙葉被廢棄[1]，不僅造成了巨額經(jīng)濟(jì)損失，也帶來了巨大的生態(tài)環(huán)境污染。廢棄煙葉中含有大量有效成分，不僅有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，還有重要的醫(yī)藥價(jià)值。合理的利用廢棄煙葉是我國煙葉產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要保障[2]。常用的煙葉致香成分提取方法有：水蒸氣蒸餾[3]、溶劑萃取[4]、同時(shí)蒸餾萃取(SE-SD)[5]、微波輔助溶劑萃取 (MASE)[6-7]等。高宏建等[8]對(duì)煙草精油的水蒸氣蒸餾法提取工藝進(jìn)行了研究，通過單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)的方法得到最適宜提取條件，并獲得了1.7%的精油收率。楊再波等[9]采用同時(shí)蒸餾萃取方法，研究了烤煙煙梗中揮發(fā)性香氣成分的組成，鑒定出39種香氣成分。張獻(xiàn)忠等[10]采用溶劑提取法對(duì)廢棄煙葉進(jìn)行了萃取研究，共鑒定致香物質(zhì)91種，得到浸膏產(chǎn)率約為3.38%。以上研究均取得了較為顯著的成果，但這些研究均未提及到煙葉中含量較高的α-維生素E(α-Tocopherol)的提取。周等[11]研究了微波輔助溶劑提取法提取煙葉中茄尼醇的工藝，但并未報(bào)道發(fā)現(xiàn)天然維生素E。盡管同時(shí)蒸餾萃取和微波輔助溶劑提取法相比溶劑提取法有諸多優(yōu)勢(shì)，但不適合煙葉中天然維生素E的提取。為了更好地利用廢棄煙葉資源，選取溶劑提取法對(duì)煙葉精油以及天然維生素E進(jìn)行了提取研究，并采取響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料和分析方法

實(shí)驗(yàn)所用廢棄煙葉產(chǎn)自洛陽地區(qū)，于35 ℃下真空干燥4 h。粉碎后過30、40、50、60和70目篩密封保存?zhèn)溆谩?/p>

所有有機(jī)試劑(N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、丙酮、乙醚、環(huán)己烷)均購自天津市江天化工科技有限公司，分析純。

實(shí)驗(yàn)中定性分析由安捷倫公司氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS，Agilent 7890A-5975)、定量分析由氣相色譜儀(GC，Agilent 7890B)完成。色譜條件：色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度選定為260 ℃，進(jìn)樣量選定為1 μL，分流比選定為5∶1，載氣為氦氣，載氣流量選定為5 mL/min，升溫程序選定為50 ℃保持2 min，4 ℃/min升溫至230 ℃，1 ℃/min升溫至255 ℃。

1.2　單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

所有單因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響用提取率評(píng)定：

(1)

其中Y為提取率，%；m為所得精油質(zhì)量，g；M為所用煙末質(zhì)量，g。

稱取煙末15 g，放置于250 mL三口燒瓶中，并置入一定量萃取劑，在一定溫度下水浴攪拌萃取一定時(shí)間。合并萃取液，脫除提取劑之后計(jì)算提取率，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行定性、定量分析。單因素實(shí)驗(yàn)安排如表1所示。單因素實(shí)驗(yàn)所得最適宜實(shí)驗(yàn)條件將被選為下一單因素實(shí)驗(yàn)條件。

表1　各單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

提取次數(shù)單因素實(shí)驗(yàn)其他實(shí)驗(yàn)條件為：提取溫度40 ℃，物料細(xì)度60目，提取時(shí)間6.0 h，物料比10 mL/g。提取溫度單因素實(shí)驗(yàn)其他實(shí)驗(yàn)條件為：物料細(xì)度60目，提取時(shí)間6.0 h，物料比10 mL/g。物料細(xì)度單因素實(shí)驗(yàn)其他實(shí)驗(yàn)條件為：提取溫度40 ℃，提取時(shí)間6.0 h，物料比10 mL/g。提取時(shí)間單因素實(shí)驗(yàn)其他實(shí)驗(yàn)條件為：提取溫度40 ℃，物料細(xì)度50目，物料比10 mL/g。物料比單因素實(shí)驗(yàn)其他實(shí)驗(yàn)條件為：提取溫度40 ℃，物料細(xì)度50目，提取時(shí)間6.0 h。

1.3　響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度、提取時(shí)間、提取物料比為獨(dú)立變量(分別以A、B、C表示)進(jìn)行響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取工藝。如表2所示，根據(jù)BBD方法設(shè)計(jì)三因素三水平共計(jì)17組實(shí)驗(yàn)。

表2　響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)因素水平表

實(shí)驗(yàn)通過Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)，以A、B、C為自變量，以提取率Y為響應(yīng)值，實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過式(2)進(jìn)行多元擬合回歸。

(2)

其中Y為響應(yīng)值，Xk與Xj為獨(dú)立變量；i與j為實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)變量；β0為模型距；βk，βkk與βkj為自變量的回歸系數(shù)、線性和二元交互系數(shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1　提取溶劑的選擇

N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，乙醇、丙酮、乙醚和環(huán)己烷的提取效果如圖1和圖2所示。

圖1　不同溶劑提取效率Fig.1　Extraction yields of different solvents

圖2　不同溶劑提取物主要成分表Fig.2　Major constituents of tobacco oleoresin extracted by different solvents

從圖1和圖2中可以看出，乙醇做溶劑時(shí)，浸膏提取率以及煙堿和維生素E的提取效率均達(dá)到最大。同樣，DMF作為萃取劑，雖然浸膏提取率較高，但是DMF本身黏度較大，不利于后期脫除溶劑、保護(hù)熱敏性物質(zhì)，而且在DMF提取物中并未發(fā)現(xiàn)維生素E。乙醚和丙酮作為提取劑時(shí)，提取率較低，且提取物中不含維生素E或含有量較少。張獻(xiàn)忠等[12]研究了乙醚作為溶劑對(duì)煙葉中有效物質(zhì)的提取效果，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)提取物中含有維生素E，并發(fā)現(xiàn)乙醚對(duì)煙堿有一定的提取效果。環(huán)己烷作為提取劑，提取效率較高，煙堿、蒎烷、維生素E的收率均較高，且溶劑回收率較高。劉悍等[13]考察了乙醇和環(huán)己烷對(duì)煙葉中維生素E的提取效果，研究結(jié)果表明，2種溶劑對(duì)維生素E的提取效果相當(dāng)。相比5種溶劑提取效果，選擇環(huán)己烷作為最佳提取劑。用環(huán)己烷得到的提取物中煙堿、蒎烷、維生素E所占提取物比例超過70%。

2.2　單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

當(dāng)提取次數(shù)增至2次，提取率從6.50%上升至7.45%。當(dāng)提取次數(shù)增至3次，提取率再次提升為7.59%，提升效果不明顯。為減少溶劑、能源消耗以及簡(jiǎn)化提取工藝，選取2次為最適宜提取次數(shù)。

提取溫度對(duì)提取率的影響如圖3所示。為了避免熱敏性物質(zhì)的損失，提取溫度區(qū)間選擇為30～70 ℃。圖3中所示，當(dāng)溫度提升至40 ℃時(shí)，提取率迅速增加至最高，隨著溫度的進(jìn)一步提升，提取率稍有下降并基本維持穩(wěn)定。這是由于溫度提升加大了溶劑的分子運(yùn)動(dòng)[14-15]并增強(qiáng)了傳質(zhì)速率所以導(dǎo)致提取率增加。但是過高的溫度會(huì)導(dǎo)致熱敏性物質(zhì)的損失，最佳提取溫度必須同時(shí)考慮到能源消耗和提取率，因此選取35～45 ℃進(jìn)行下一步研究。

圖3　提取溫度對(duì)提取率的影響Fig.3　Effect of temperature on the yield of the extract

物料細(xì)度對(duì)提取效率的影響如圖4所示。當(dāng)物料細(xì)度由30目提升至50目時(shí)，提取率一直上升。這是由于物料越細(xì)，煙葉中溶質(zhì)的溶解速度提升，同時(shí)固液兩相之間的有效接觸面增大使傳質(zhì)速度加快提升了提取率。然而當(dāng)物料目數(shù)增加至70目，由于物料過細(xì)導(dǎo)致吸附作用過強(qiáng)，降低了提取率。因此最適宜物料目數(shù)定為50目。

圖4　物料細(xì)度對(duì)提取率的影響Fig.4　Effect of particles size of powder on the yield of the extract

提取時(shí)間對(duì)提取率的影響如圖5所示，提取率隨提取時(shí)間增加而增加，并在6.0 h出達(dá)到最大值，隨后基本維持穩(wěn)定。當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到6.0 h時(shí)，溶質(zhì)與溶劑之間已達(dá)到溶解平衡，再增加提取時(shí)間并不能提升提取率。因此選取提取時(shí)間5.5～6.5 h進(jìn)行下一步研究。

圖5　提取時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.5　Effect of extraction time on the yield of the extract

物料比對(duì)提取效率的影響如圖6所示。提取率隨物料比增加而增加，并在物料比增加至12以后基本維持穩(wěn)定。這是由于當(dāng)物料比為12時(shí)，煙葉中所含物質(zhì)已達(dá)到最低水平，增加物料比已不能再有效提升提取率。因此，選擇物料比11～13進(jìn)行下一步研究。

圖6　提取物料比對(duì)提取率的影響Fig.6　Effect of ratio of liquid to solid (mL/g) on the yield of the extract

2.3　提取參數(shù)的響應(yīng)面優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及結(jié)果如表3所示。經(jīng)過Design-Expert軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸，得模型如下。

Y=-159.4127+1.66019A+22.57298B+

10.49193C-0.051018AB-0.0062635AC-

0.35495BC-0.014908A2-1.33684B2-

0.33149C2

(3)

式(3)方差分析如表4所示。表4中可見，該模型P值為0.0014(<0.01)，R2=0.9435，失擬項(xiàng)(Lack of fit)值為0.0851(>0.05)不顯著，證明該模型擬合程度好，實(shí)驗(yàn)誤差小，為可靠模型。在此模型中，A、C、A2、B2、C2為顯著項(xiàng)。與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。

表3　Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及提取率響應(yīng)值結(jié)果

2.3.1提取參數(shù)交互作用對(duì)提取率的影響

響應(yīng)面圖可以很好的反映自變量之間的交互作用，并確定各個(gè)自變量的最大響應(yīng)值[16]。各自變量的交互作用對(duì)提取率的影響如圖7、圖8和圖9所示。

提取時(shí)間和提取溫度的交互影響如圖7所示。從表3可以看出，提取溫度和時(shí)間的交互作用影響顯著(P<0.05)，并且二者對(duì)提取率影響均顯著。隨著提取溫度和時(shí)間的增加，提取率出現(xiàn)增加，但隨著繼續(xù)增加，提取率出現(xiàn)下降。這可能是由于熱敏性物質(zhì)的損失以及提取劑提取性能隨著溫度變化而變化引起。

表4　回歸方程方差分析

Std. Dev.: 0.18;R2=0.9435;AdjR2=0.8709.aSignificant.bNot significant.

圖7　提取時(shí)間與溫度對(duì)提取率的影響Fig.7　Response surface plot for the effect of time-temperature on extraction

如圖8及表3所示，提取溫度對(duì)提取率的影響顯著(P<0.05)，然而物料比以及提取溫度和物料比的交互作用對(duì)提取率影響效果不顯著(P>0.05)。提取溫度和物料比對(duì)提取率的影響同提取溫度和時(shí)間對(duì)提取率的影響類似。

圖8　提取物料比與溫度對(duì)提取率的影響Fig.8　Response surface plot for the effect of liquid-solid ratio and temperature on extraction

提取時(shí)間及物料比交互作用對(duì)提取率的影響如圖9所示，提取物料比及時(shí)間的增長(zhǎng)可以促進(jìn)提取率的增加。但是過度的增加會(huì)導(dǎo)致提取率的降低。當(dāng)提取物料比和時(shí)間超過一定值之后，煙葉內(nèi)所含溶質(zhì)處于可提取的最低水平。表3中方差分析可以證實(shí)二者交互作用對(duì)提取率影響不顯著(P>0.05)，同樣，物料比對(duì)提取率影響不顯著(P>0.05)，而提取時(shí)間顯著(P<0.05)。

圖9　提取時(shí)間與物料比對(duì)提取率的影響Fig.9　Response surface plot for the effect of time and liquid-solid ratio on extraction

2.3.2模型驗(yàn)證

模型驗(yàn)證試驗(yàn)在提取溫度42.54 ℃、物料比12.31 mL/g、時(shí)間6.0 h下進(jìn)行，所得收率為7.95%，與模型預(yù)測(cè)值7.94%相差無幾，表明此模型可靠。

3　結(jié)論

通過考察不同提取劑對(duì)提取率的影響，其中環(huán)己烷作提取劑有較高的提取率，且對(duì)煙堿、蒎烷、維生素E有較強(qiáng)的提取能力。選用環(huán)己烷作為提取劑，得到煙葉致香物質(zhì)提取率較之前張獻(xiàn)忠[10]研究所得3.38%的提取率高出許多，并且所得致香物質(zhì)中維生素E的含量較高。實(shí)驗(yàn)證明提取時(shí)間、溫度、物料比對(duì)提取率有較大影響。通過響應(yīng)面法對(duì)三因素進(jìn)行提取工藝優(yōu)化，所得最適宜提取工藝條件為：提取溫度42.54 ℃，物料比為12.31 mL/g，時(shí)間6.0 h，在此條件下可得收率7.95%。其中含煙堿為32.25%、蒎烷為23.14%、維生素E為14.11%。

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